עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ La Fondation איב Cotrel de l&#39;Institut de France, פריז, צרפת (לד&quot;ר מורו), המכון הקנדי לחקר בריאות (מענק PP2-99,466 לד&quot;ר מורו) ומהממד הרביעי השדרה LLC , ניו יורק, ארה&quot;ב (מענק מחקר לד&quot;ר מורו).

התהליך כולו מתבצע מתחת למכסת המנוע הביולוגי סטרילי וכל הפתרונות והציוד הבאים במגע עם תאים חייבים להיות סטרילי. 1. הכנה של פתרונות חיוניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות לפי טבלת 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על פתרון מאוזן מלח (BSS) בטמפרטורת חדר וכל פתרונות האחרים על 4 מעלות צלזיוס עד למועד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיה חמה קרה ל37 מעלות צלזיוס באמבט המים במשך כמה דקות לפני השימוש. </li></ol> 2. הכנה ואחסון של PBMCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 10 מיליליטר של דם מלא בצינורות איסוף שטופלה EDTA להכין שני aliquots של PBMCs באמצעות 5 מ&quot;ל לכל aliquot. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 5 מיליליטר של דם מלא מצינור האיסוף שטופלה EDTA לצינור 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של BSS ומערבבים מדגם על ידי pipetting העדין מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 3 מיליליטר של Ficoll בשני 15 צינורות מיליליטר פלקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבת זהירות 4.5 מיליליטרשל דילול תערובת דם מעל Ficoll בצינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הצינורות לנוח לתקופה של עד 5 דקות לטובת הפרדה ברורה של הדם וFicoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינורות ב XG 400 ל30 דקות בטמפרטורת חדר עם בלם לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את הצינורות מצנטריפוגות כדי לא להפריע את השכבות. PBMCs גלויות בממשק BSS / Ficoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את השכבה מעוננת של PBMCs בממשק של שני הצינורות עם טפטפת ולהעביר לצינור מיליליטר 50 חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מיליליטר של מדיה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות הצינור ב288 XG במשך 7 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant על ידי שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב μl 500 של מדיה משלימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של תקשורת הקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את ההשעיה התא לcryovial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את cryovial לתוך מיכל cryofreezing עם isopropanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את מיכל ההקפאה ב -80 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfer PBMCs הקפואה aliquot לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. </li></ol> 3. Assay פונקציונלי 1. יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח aliquot מחנקן נוזלי באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך דקה או עד שהופשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את ההשעיה תא צינור 50 מיליליטר עם פיפטה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 מיליליטר של מדיה מלאה ולסובב את התאים למטה XG 200 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant על ידי שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להשעות את התא גלולה ב 1 מיליליטר של תקשורת PHA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם את הנפח עד 20 מיליליטר עם אותה התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווי הצינור באופן רופף, כדי לאפשר לאוויר להיכנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את צינור הלילה ב 37 מעלות צלזיוס חממת CO 2 כדי לאפשר לימפוציטים שקטים להפוך לlymphoblasts מהירות-מתרבים. </li></ol> 2. יום 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצינור אל מחוץ לחממה, לדפוק את כובעים לחלוטין ולסובב את התאים למטה XG 200 במשך 5 דקותבטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant על ידי שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להשעות את התא גלולה ב 1 מיליליטר של מדיה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם את הנפח עד 20 מיליליטר עם אותה התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווי הצינור באופן רופף, כדי לאפשר לאוויר להיכנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את צינור הלילה ב 37 מעלות צלזיוס חממת CO 2 להרחיב את המספרים סלולריים. </li></ol> 3. יום 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבל את הצינור אל מחוץ לחממה, לדפוק את כובעים לחלוטין ולסובב את התאים למטה XG 200 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant על ידי שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים פעמיים עם 10 מיליליטר של RPMI-1640 ידי צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend התא גלולה ב μl 600 של RPMI-1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ריכוז תאים ואת הכדאיות, באמצעות מונה תא אוטומטי ומנתח כדאיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח מתאים של RPMI-1640 להסתגל לריכוז תא של 1.5 x 10 5 cells/20 μl. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בתאים עם OPN רקומביננטי (rOPN) או רכב (PBS) ב1.5 מיליליטר של צינורות Eppendorf. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את ההשעיה תא 100 μl לשני 1.5 מיליליטר Eppendorf צינורות סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת rOPN בצינור אחד לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של PBS בצינור השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב בעדינות כל תנאי על ידי pipetting למעלה ולמטה פעמיים באמצעות סט פיפטה סטרילית ב100 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדגם הקטן microplate 96 היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של RPMI-1640 היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב XG 200 במשך 3 דקות כדי להסיר כל בועות אוויר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי תאים שלא טופלו, כמו גם תאים שטופלו בrOPN או PBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני העברת תאים מצינור לmicroplate, פיפטה בעדינות מעלה ומטה פעם אחת כדי להבטיח השעיה אחידה של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של תא השעיה לכל גם בארבעה לתאים שלא טופלו, בשני עותקים לrOPN או PBS תאים שטופל. ReFER איור 1 לעיצוב. עיצוב זה מאפשר 12 חולים להיבדק באותו microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את צלחת התא מתחת למכסת מנוע סטרילי במשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים לנוח וליישב באופן שווה לתחתית הבאר לפני הצבת בחממה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת ל18 שעות על 37 מעלות צלזיוס חממת CO 2 כדי לייעל את ההשפעה של OPN. </li></ol> 4. יום 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הצלחת עם תרכובות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצלחת מחוץ לחממה ולהשאיר אותה ב RT עבור סביב 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מיליליטר של של סומטוסטטין וisoproterenol RPMI-1640 100 מיקרומטר על ידי הוספת 10 μl של פתרון מניות (10 מ&quot;מ) ב990 μl של RPMI-1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הצלחת במתחם על ידי מחלק 20 μl בבארות מתאימות כפי שמצוין באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צלחת המתחם עם חותם לנקבה חתוכה מראש, כדי למנוע שינוי בריכוז מתחם בשל התאדות לפניאו במהלך דגירה במערכת מבוססת ה-CDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת טען תא, טיפים פיפטה, וצלחת מתחם לתוך המערכת מבוססת ה-CDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן שם לצלחת בתוכנה במכשיר המבוססת על ה-CDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הפרוטוקול המתאים. הפרוטוקול נערך לסיווג עם PBMCs נקרא &quot;תאי אגוניסט אינו חסיד פלייט מדגם הקטן RT 15 דקות&quot;. עבור לתיבת הפרוטוקול ובחר בפרוטוקול זה ברשימה של פרוטוקולים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום את הפרוטוקול על ידי לחיצה על &quot;התחל&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת fluidics המשולבת בו זמנית מוסיפה תרכובות לכל הבארות על ידי הזרקת 5 μl לכל טוב כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרומטר בנפח כולל של 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המערכת מבוססת ה-CDS באופן אוטומטי אוספת את הנתונים עבור 15 דקות אחרי תוספת מתחם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר טווחים נמוכים וגבוהים של תדרים לשימוש בעת חישוב ערכים שחולצו לאיתאים חסיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תיקון להיסחף כדי לתקן את השינוי ליניארי במדידות עכבה בסיסיות לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר סינון נתונים כדי להפחית וריאציות במדידת התגובה קינטית עקב רעש אלקטרוני ובנוסף מתחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את שיטת Max-Min בפעם הניתוח מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצוא נתונים ל-Excel באפשרות פורמט צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הדלתא G (ΔG) על ידי הפחתה הממוצעת של עוצמת תגובה לגירוי Gi (RmGi) מהממוצע של גודל תגובה לגירוי Gs (RmGs) תוך שימוש בנוסחה הבאה: ΔG = RmGi - RmGs </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את אחוז ההשפעה של פי (Fe) של OPN בתגובה בתיווך-Gi על ידי חלוקת הממוצע של גודל תגובה לגירוי Gi בנוכחות OPN (RmGiOPN) עם הממוצע של עוצמת תגובה לגירוי במערכת העיכול בנוכחות של PBS ( RmGiPBS) תוך שימוש בנוסחה הבאה: פה = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיין Tתוכל 2 לסווג חולים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kane, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence:+a+call+for+a+statement+of+terms.">Prevalence: a call for a statement of terms.</a> Clin Orthop. Relat Res. 126, 43-46 (1977).</li><li>Bunnell, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+screening+for+scoliosis.">Selective screening for scoliosis.</a> Clin Orthop Relat Res. 434, 40-45 (2005).</li><li>Asher, M. A., Burton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adolescent+idiopathic+scoliosis:+natural+history+and+long+term+treatment+effects.">Adolescent idiopathic scoliosis: natural history and long term treatment effects.</a> Scoliosis. 1 (1), 2 (2006).</li><li>Fong, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meta-analysis+of+the+clinical+effectiveness+of+school+scoliosis+screening.">A meta-analysis of the clinical effectiveness of school scoliosis screening.</a> Spine (Phila Pa 1976). 35 (10), 1061-1071 (2010).</li><li>Chowanska, J., Kotwicki, T., Rosadzinski, K., Sliwinski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=School+screening+for+scoliosis:+can+surface+topography+replace+examination+with+scoliometer?.">School screening for scoliosis: can surface topography replace examination with scoliometer?.</a> Scoliosis. 7 (9), 1748-7161 (2012).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoliosis+imaging:+what+radiologists+should+know.">Scoliosis imaging: what radiologists should know.</a> Radiographics. 30 (7), 1823-1842 (2010).</li><li>Wong, H. K., Hui, J. H., Rajan, U., Chia, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+scoliosis+in+Singapore+schoolchildren:+a+prevalence+study+15+years+into+the+screening+program.">Idiopathic scoliosis in Singapore schoolchildren: a prevalence study 15 years into the screening program.</a> Spine. 30 (10), 1188-1196 (2005).</li><li>Nachemson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+term+follow-up+study+of+non-treated+scoliosis.">A long term follow-up study of non-treated scoliosis.</a> Acta Scand. 39 (4), 466-476 (1968).</li><li>Enneking, W. F., Harrington, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+changes+in+scoliosis.">Pathological changes in scoliosis.</a> J. Joint Surg. 51 (1), 165-184 (1969).</li><li>Miller, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+natural+history+of+adolescent+idiopathic+scoliosis.">Cause and natural history of adolescent idiopathic scoliosis.</a> Orthop. Clin. North Am. 30 (3), 343-3452 (1999).</li><li>Nash, C. L., Gregg, E. C., Brown, R. H., Pillai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+of+exposure+to+X-rays+in+patients+undergoing+long-term+treatment+for+scoliosis.">Risks of exposure to X-rays in patients undergoing long-term treatment for scoliosis.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 61 (3), 371-400 (1979).</li><li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+screening+test+for+idiopathic+scoliosis+using+cellular+dielectric+spectroscopy.">Cell-based screening test for idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy.</a> Spine. 35 (13), 601-608 (2010).</li><li>Verdonk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dielectric+spectroscopy:+a+label-free+comprehensive+platform+for+functional+evaluation+of+endogenous+receptors.">Cellular dielectric spectroscopy: a label-free comprehensive platform for functional evaluation of endogenous receptors.</a> Assay Drug Dev. Technol. 4 (5), 609-6019 (2006).</li><li>Peters, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cellular+dielectric+spectroscopy,+a+whole-cell,+label-free+technology+for+drug+discovery+on+Gi-coupled+GPCRs.">Evaluation of cellular dielectric spectroscopy, a whole-cell, label-free technology for drug discovery on Gi-coupled GPCRs.</a> J. Biomol. Screen. 12 (3), 312-319 (2007).</li><li>Peters, M. F., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cellular+impedance+assays+for+detection+of+GPCR+pleiotropic+signaling+and+functional+selectivity.">Evaluating cellular impedance assays for detection of GPCR pleiotropic signaling and functional selectivity.</a> J. Biomol. Screen. 14 (3), 246-255 (2009).</li><li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays.">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8 (2), 219-227 (2010).</li><li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+Gi-coupled+receptor+signaling+occurs+in+adolescent+idiopathic+scoliosis.">Disrupted Gi-coupled receptor signaling occurs in adolescent idiopathic scoliosis.</a> J. Clin. Invest. , (2013).</li></ol>

עבודה זו הובילה למספר פטנטים להחזיק ידי Sainte-Justine חולים האוניברסיטאי ועוד רבים אחרים תלויות ועומדת במספר מדינות. הממד הרביעי השדרה LLC הוא בעל הרישיון הבלעדי של Sainte-Justine חולים האוניברסיטאי.

יש לנו תארנו הליך מפורט של בדיקה מבוססת תאים פרוגנוסטיים לעקמת אידיופטית כי הוא ישים לתאי הדם היקפיים mononuclear (PBMCs) מבודדת טרי או קפוא נשמרת לתקופה של שנה עד אחד בחנקן נוזלי. מאז באמצעות PBMCs מבודדת טרי הוא מסורבל כאשר בודקים מספר גדול של אנשים, ההליך הוצג עם PBMCs הקפואה המציעות חלופה מעשית יותר בהגדרה קלינית. עם זאת, בעיות עם התא clumping על הפשרה היו נתקלו בעת PBMCs הקפואה היו בתחילה בשימוש, מה שמובילה לעתים לשונות בין assay. על מנת למקסם את שחזור assay, אנו ממליצים להימנע ממחזור ההפשרה הקפאה ושימוש במדגם הקפוא רק פעם אחת. ההליך הוא פשוט מאוד, המאפשר זיהוי מדויק של תפקוד חלבון Gi הפגום בזמן קצר. באמצעות הליך זה, ניתן לסווג ילדים אסימפטומטיים וscoliotic קלות לנבא התוצאה הקלינית שלהם טובים יותר ללא סכנה כלשהי לבריאותם. הוwever, בעת ביצוע סיווג על פי מידת התגובה המרבית לGi גירוי ביחס לנבדקים בריאים 12, כמה דרישות לנבדקי ביקורת צריכה להיות נפגשו. ואכן, כדי שתהיה לי עוקבה השוואה ראויה, נושאי השליטה חייבים להיות גיל ומין מתאים, לא יהיו על כל סוג של טיפול תרופתי, ולספק מידע אישי, כגון היסטוריה בעבר בודדת / משפחתית רפואית. דרישות אלה עלולות להוות מכשול חשוב לגיוס של נבדקי ביקורת. לכן, ביצוע סיווג על ידי בחינת המידה של חוסר איזון בין התגובה לגירוי חלבון Gi ו-G באותו האדם הוא אידיאלי כדי לחסל את הצורך בשימוש בקבוצת בקרה. השימוש במערכת מבוססת CDS לבצע בדיקה פרוגנוסטיים זה הוא משמעותי במונחים של בו זמנית לספק Gi-ותגובות הסלולר בתיווך-GS באותו assay. למרות שניתן לסווג חולים רבים ללא ambiguity באמצעות הטווח הדינמי קבוע עבור assay זה, מספר קטן של חולים יפגין ערכים בגבול של טווחים, כפי שמדגים את התוצאות של הדו&quot;ח הנוכחי. להפלות אנשים אלה, יש לנו הציגו ההערכה של ההשפעה של OPN בתגובה לגירוי Gi ידי הוכחת כי OPN גורם השפעת ההפרש על תגובה תאית בתיווך-Gi בין שלוש הקבוצות פונקציונליות. ואכן, מצאנו כי בנוכחותו של OPN, בתגובה לעליות גירוי Gi בFG1, תוך שהוא מקטין בFG2 וFG3, בFG2 מידה גבוהה יותר. למרות העלות הגבוהה של OPN, שימוש הכמוקין חיוני להבחין מקרים מעורפלים, ולכן לשפר את הדיוק של assay הסיווג שלנו. עם זאת, יש assay זה חסרון שבמינימום של 1.5 x 10 5 תאים לכל גם נדרש להתבונן תגובה תאית עם המערכת מבוססת ה-CDS בתנאי הניסוי שלנו. דגימות מטופל מסוימות לא תהיה לי מספר מספיק שלתאים להיבדק. במקרה זה, יש צורך לזכור את החולים עבור איסוף דם נוסף, שיכול להיות מדאיג עבור משפחות ומתסכלות עבור צוות הרפואי ומעבדה. מחקרים פרוספקטיביים מתוכננים במעבדה שלנו כדי לטפל בבעיה זו. עם זאת, הפרוטוקול הנוכחי מסתמך על שיטות פשוטות ומוכחות להכנת תאים ואילו הבדיקות מתבצעות באופן אוטומטי באמצעות מערכת תוקף ללא תווית 13, 14 לעקוב אחר תגובותיהם של התאים. פלטפורמת הבדיקות היא זולה יחסית בהשוואה לפלטפורמה גנטית זמינה עבור הפרוגנוזה של מחלות אחרות. כמו כן, העלות של כל החומרים חד פעמים, כוללים צינורות איסוף דם, טיפים, האלקטרודה המיוחדת microplates, וחרוטים וצינורות Eppendorf, היא לא יקרה מאוד ונאמדה בפחות מ -3,000 דולרים כדי להשלים בדיקות לכאלף חולים. למרות הערכה זו אינה כוללת את עלויות עבודה להכנת דגימותומבצע את הבדיקה, בדיקה זו נשארה הרבה יותר זול מאשר פלטפורמות הדור הבא של רצף. ראויים לציון, הוא השוואת העלות לא רק לפלטפורמות גנטיות, אבל באופן ספציפי יותר הקשורים לתחום של AIS, הוא העלויות הכרוכות להדמיה רדיולוגית. היום, יותר ממיליון ילדים בארה&quot;ב וכ -100,000 ילדים בקנדה מאובחנים עם עקמת אידיופטית, והעלות הכוללת של אבחון וניטור של ילדי scoliotic ידי חשיפת רנטגן היא מעל 2.5 מליארד דולרים בשנה בצפון אמריקה. לפיכך, הליך assay מבוסס התאים שלנו יהיה צפוי להיות מתאים להקרנה ומעקב אחר ילדים עם עקמת אידיופטית ללא סיכון בריאותי ובעלות נמוכה יותר שיגרתי.

עקמת אידיופטית היא עיוות בעמוד השדרה של גורמים לא ידועים בדרך כלל מוגדרת כעקמומיות לרוחב גדולה יותר מ10 מעלות מלוות בסיבוב בחוליות 1. המצב משפיע על 4% מאוכלוסיית הילדים, והוא בדרך כלל מאובחן בגילאי 9 עד 13 2,3,4. האבחנה היא בעיקר של הדרה ונעשתה רק לאחר שלילת גורמים אחרים של עיוות בעמוד השדרה, כגון מום בעמוד השדרה, התוקפת או הפרעות syndromic. באופן מסורתי, הסימטריה trunkal מתגלה על ידי מבחן קדימה כיפוף אדמס ונמדדה עם scoliometer במהלך בדיקה גופנית 5. האבחון ואז יכול להיות מאושר על ידי תצפית רדיוגרפי של העקומה ומדידת הזווית תוך שימוש בשיטת קוב 6. לאחר שאובחן, הדאגה העיקרית עבור רופאים בניהול ילדי scoliotic היא האם העקומה תהיה התקדמות. ואכן, את ההתקדמות העקומה היא לעתים קרובות בלתי צפויה והוא נצפה בקרב בנות בתדירות גבוהה יותר מאשר אצל בני 7. אם לא מטפלים, העקומה יכולה להתקדם באופן דרמטי, ויוצרת עיוות פיזית משמעותית ובעיות אפילו cardiopulmonary. גילויים אלה הופכים סכנת חיים כאשר העקומה עולה 70 ° 8,9. אפשרויות הטיפול הנוכחיות כדי למנוע או לעצור את ההתקדמות עקומה כוללות מרעננות וניתוח. באופן כללי, המרענן מומלץ לעקומות בין 25-40 °, ואילו ניתוח שמור לעקומות גדולות מ45 ° או להגיב למרענן. כ, 10% מילדים שאובחנו עם עקמת אידיופטית יש התקדמות עקומה הדורשת ניתוח מתקן 10. נכון לעכשיו, לא קיימת שיטה או בדיקה זמינה לזהות קטגוריה זו של חולים מוכחים. כתוצאה מכך, כל הילדים שאובחנו חשופים לצילומי רנטגן המרובים על פני מספר שנים, בדרך כלל עד שהם מגיעים לבגרות שלד. הערכה היא כי החולים הטיפוסיים עם עקמת יהיו ליכ 22 בדיקות רדיולוגיות על פני תקופה של 3 שנות 11. בגלל הסיכון הפוטנציאלי של בדיקות רדיוגרפי מרובות, הגישות חלופיות, שעלול לאפשר ביצוע הפרוגנוזה של עקמת אידיופטית בלי לחשוף ילדים לקרינה מייננת הן מאוד רצויות. במטרה לענות על צורך זה, פיתחנו בעבר assay הקרנה מבוסס תאים כמבחן פרוגנוסטיים לזהות מוקדם את הילדים אסימפטומטיים בסיכון לפתח עקמת אידיופטית. המבחן מנבא את התוצאה הקלינית בשני ילדים אסימפטומטיים ומושפעים על ידי בחינת המצב התפקודי של חלבוני Gi וסיווג ילדים לשלוש קבוצות פונקציונליות (FG1, FG2 וFG3) בהתאם למידת תגובה לגירוי מקסימלי חלבון Gi 12 כפי שהיא נמדדת על ידי CDS מערכת מבוססת. מערכת זו משמשת בעיקר כדי להעריך את העברת אותות באמצעות חלבוני G בסוגי תאים שונים 13,14,15,16. זה מניב מידע לגבי<html> תגובה כוללת משולבת של התאים לגירויים החיצוניים על ידי מדידת שינויים בעכבה בעקבות ההפעלה של הקולטנים בתא שטח. תאים הם זורעים לתוך microplates המכילים אלקטרודות בתחתית הבארות והמערכת חלה מתח קטן שיוצר זרמים תאיים וtranscellular. לאחר הזרקת תרכובת לתוך הבאר, קולטני תא שטח הם גירוי ואירועים הולכים אותות להתרחש, מה שמוביל לשינויים תאיים המשפיעים על הזרימה של זרמים תאיים וtranscellular, ובכך להשפיע על הגודל הנמדד. עם גישה זו, חולי scoliotic וילדים בסיכון גבוהים יותר לפתח עקמת מגיבים פחות לגירוי חלבון Gi בהשוואה לנבדקים בריאים, והסיווג מבוסס על אחוז ממידת הפחתה ביחס לקבוצת ביקורת. טווחי הסיווג קבועים בין 10 40% לFG3, 40 ו60% לFG2, ו60 ו90% לFG1 12. ss = &quot;jove_content&quot;&gt; לאחרונה, יש לנו שונה בגישה זו על ידי הוכחת כי באופן ברור ניתן להבחין בשלוש הקבוצות פונקציונליות בהתאם לפרופיל של חוסר איזון בין התגובה לGi וגירוי GS. ואכן, מצאה שתגובה לגירוי Gi שלטה בFG3, בעוד שאין חוסר איזון לכאורה נצפה בFG2. לעומת זאת, FG1 הציג דומיננטיות לתגובה לגירוי GS. בנוסף, יש לנו סיפקנו את הראיות לכך שחולים השייכים לFG2 נמצאים בסיכון גבוה יותר של התקדמות עד לנקודה של צורך ניתוח 17. הדיוק של בדיקת סיווג זה עוד יותר שופר על ידי הוכחת השפעת ההפרש של osteopontin (OPN) בתגובה לגירוי Gi בין קבוצות פונקציונליות. כאן אנו לתעד את הצעדים מפורטים של הפרוצדורות ואנליטי של בדיקה פונקציונלית זו הופיעה ככרגע במעבדה שלנו.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>350-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Therno Scientific Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohemagglutinin</td>
			<td>Invitrogen (Gibco)</td>
			<td>10576-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Osteopontin</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc</td>
			<td>1433-OP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somatostatin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>301-06-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Eppendorf tubes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>24-MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey small sample 96W microplate</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1026496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey tips</td>
			<td>Cybio</td>
			<td>OL3800-25-559N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut pierceable seals</td>
			<td>Excel Scientific, Inc</td>
			<td>XP-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicell XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>1284</td>
			<td>Class II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CY5093570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89032-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMIL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51019557</td>
			<td>5% CO2 at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1019185</td>
			<td>CDS-based instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-based assay protocol for the prognostic prediction of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy

פרוטוקול זה מפרט את ההליך ניסיוני ואנליטיים לassay מבוסס תאים שפותח במעבדה שלנו כמבחן פונקציונלי לנבא את הפרוגנוזה של עקמת אידיופטית בילדים אסימפטומטיים ומושפעים. Assay מורכב מההערכה של המצב התפקודי של חלבוני Gi ו-G בתאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) על ידי ספקטרוסקופיה הסלולרית דיאלקטרי (CDS), תוך שימוש במכשיר אוטומטי המבוסס על ה-CDS, וסיווגם של ילדים לשלוש קבוצות פונקציונליות (FG1 , FG2, FG3) ביחס לפרופיל של חוסר איזון בין מידת התגובה לGi וגירוי חלבוני GS. הסיווג הוא אושר עוד יותר על ידי אפקט ההפרש של osteopontin (OPN) בתגובה לגירוי Gi בין קבוצות ואת ההתקדמות החמורה של מחלה הפניה FG2. כ, בהיקף של 10 מיליליטר של דם נדרש כדי לחלץ PBMCs ידי Ficoll-שיפוע ותאים אז מאוחסן בחנקן נוזלי. המספר מספיק של PBMCs לבצע assay מתקבל לאחר יומיים של תרבית תאים. בעיקרו של דבר, תאים מודגרת ראשון עם phytohemmaglutinin (PHA). לאחר 24 דגירה שעות, בינוני הוא הוחלף על ידי תרבות בינונית ללא PHA ל24 שעות נוספות לפני זריעת תאים וטיפול OPN. לאחר מכן תאים מוקרנים spectroscopically לתגובות שלהם לסומטוסטטין וisoproterenol, אשר בהתאמה להפעיל חלבוני Gi וGs באמצעות קולטנים מאותו המקור שלהם. סומטוסטטין וisoproterenol שניהם הזריקו בו זמנית עם מערכת fluidics משולבת והתגובות של התאים נמצאות תחת פיקוח במשך 15 דקות. Assay ניתן לבצע עם PBMCs טריות או קפוא וההליך יושלם בתוך 4 ימים.

כדאיות תא היו דומות בין כל הדגימות עם ערכים עקביות בטווח של 86 ו96%. לעומת זאת, וריאציות גבוהות נרשמו במספרים סלולריים בין דגימות (לוח 3). של דגימות 32 משמשות, שתיים היו מספר מספיק של תאים ולא סווגו. דוגמא לתוצאות של הסיווג הפונקציונלי בהתאם למידה של חוסר איזון בין Gi ואיתות GS היא הראתה באיור 3. הציר האנכי של נתון זה הוא מחולק לשלושה חלקים המגדיר את הקבוצות פונקציונליות עם טווחים דינמיים הוקמו כ&gt; +10 לFG3, בין +10 ו-10 לFG2, ולבסוף &lt;ל-10 FG1. בקרב 30 חולים שנבדקו כאן, 14, 6, ו -5 חולים סווגו באופן ברור לFG3, FG2, וFG1, בהתאמה, ואילו חמישה חולים, בעיקר 345, 353, 370, 371, ו382, היו בקו הגבול של טווחים. ההערכה של השפעת OPN בתגובה לגירוי Gi גילתה כי OPN הגדיל את התגובה ברשותtients 353 ו371. לעומת זאת, התגובה הופחתה על ידי יותר מ 50% בחולים 345 ו382 ועל ידי פחות מ 50% במטופל 370 לאחר טיפול rOPN. אז, על פי הקריטריונים לסיווג שלנו (טבלה 2), היינו יכולים לסווג את חולי 353 ו371 בFG1, חולי 345 ו382 בFG2, ו370 מטופל בFG3. במקביל, כל המטופלים הוקרנו על תגובתם לגירוי חלבון Gi ולעומת השליטה נושאים. כצפוי, כל החולים היו מגיבים פחות מאשר לנבדקי ביקורת, וחולים סווגו באותה הקבוצה פונקציונלית על ידי הנוהל החדש שלנו הציגו רמות דומות של התגובה המרבית (איור 5). יתר על כן, פער בין המטופלים של כל קבוצה תפקודית היה עולה בקנה אחד עם מגוון הקלאסי שלנו של סיווג 12, המאמת את הנוהל החדש שלנו. הסיווג של עוקבה גדולה של חולי scoliotic אחרי באופן קבוע במרפאת המיוחדת שלנו בSainte-Justine החולים גילה כי שלושתקבוצות פונקציונליות חולקו באופן דומה בין מקרים מתונים, בעוד FG2 היה דומיננטי בקרב מקרים חמורים (איור 6), זיהוי חולים מסווגים לקבוצה פונקציונלית זה כמו יותר בסיכון להתקדמות מחלה חמורה של המחלה ומצביע על כך שבדיקת סיווג זה יכול להיות שימושית ב הפרוגנוזה של עקמת אידיופטית. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td rowspan="5"> פתרון </td><td> D-גלוקוז נטול מים </td><td> 0.1% </td></tr><tr><td> CaCl 2 2H 2 O </td><td> 0.05 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0.98 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5.4 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> טריס </td><td> 145 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> פתרון ב &#39; </td><td> NaCl </td><td> 140 מ&quot;מ </td></tr><tr><td rowspan="2"> תמיסת מלח מאוזנת (BSS) </td><td> פתרון </td><td> 1 נפח </td></tr><tr><td> פתרון ב &#39; </td><td> 9 נפח </td></tr><tr><tdrowspan =&gt; תקשורת מלאה &quot;3&quot; </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 מיליליטר </td></tr><tr><td> אנטיביוטיקה antimycotic </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td rowspan="3"> תקשורת משלימה </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 מיליליטר </td></tr><tr><td> אנטיביוטיקה antimycotic </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td rowspan="4"> תקשורת הקפאה </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 מיליליטר </td></tr><tr><td> אנטיביוטיקה antimycotic </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 20% </td></tr><tr><td rowspan="4"> תקשורת PHA </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 מיליליטר </td></tr><tr><td> אנטיביוטיקה antimycotic </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Phytohemaglutinin </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> טבלת 1. חיוניתפתרונות. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> טווחים דינמיים עם ΔG </td><td> קבוצות פונקציונליות </td><td> טווחים דינמיים עם פה </td></tr><tr><td> ΔG &lt;-10 </td><td> FG1 </td><td> פה&gt; 100% </td></tr><tr><td> -10 &lt;ΔG &lt;+10 </td><td> FG2 </td><td> פה &lt;50% </td></tr><tr><td> ΔG&gt; +10 </td><td> FG3 </td><td> 50% &lt;פה &lt;95% </td></tr></tbody></table> טבלה 2. קטגוריזציה של קבוצות פונקציונליות על פי טווחים דינמיים שהוקמו עם ΔG ופה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חולים </td><td> כדאיות (%) </td><td> ריכוז תא (× 10 6 / מיליליטר) </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 343 </td><td> 88.7 </td><td> 11.64 </td><td></td></tr><tr><td> 344 </td><td> 90.5</td><td> 13.6 </td><td></td></tr><tr><td> 345 </td><td> 94.4 </td><td> 8.54 </td><td></td></tr><tr><td> 346 </td><td> 94.3 </td><td> 25.79 </td><td></td></tr><tr><td> 347 </td><td> 94.2 </td><td> 27.36 </td><td></td></tr><tr><td> 348 </td><td> 94.6 </td><td> 8.52 </td><td></td></tr><tr><td> 349 </td><td> 91.2 </td><td> 0.82 </td><td> מספר מספק של תאים </td></tr><tr><td> 350 </td><td> 90.3 </td><td> 8.92 </td><td></td></tr><tr><td> 352 </td><td> 92.6 </td><td> 8.28 </td><td></td></tr><tr><td> 353 </td><td> 91.3 </td><td> 12.75 </td><td></td></tr><tr><td> 354 </td><td> 86.9 </td><td> 7.62 </td><td></td></tr><tr><td> 355 </td><td> 91.2 </td><td> 7.51 </td><td></td></tr><tr><td> 356 </td><td> 90.3 </td><td> 9.36 </td><td></td></tr><tr><td> 358 </td><td> 95.1 </td><td> 16.94 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> 359 </td><td> 92.3 </td><td> 13.89 </td><td></td></tr><tr><td> 360 </td><td> 89.4 </td><td> 7.67 </td><td></td></tr><tr><td> 361 </td><td> 93.5 </td><td> 7.84 </td><td></td></tr><tr><td> 365 </td><td> 86.5 </td><td> 2.2 </td><td> מספר מספק של תאים </td></tr><tr><td> 368 </td><td> 92.6 </td><td> 15.69 </td><td></td></tr><tr><td> 369 </td><td> 93.4 </td><td> 10.9 </td><td></td></tr><tr><td> 370 </td><td> 92.5 </td><td> 19.93 </td><td></td></tr><tr><td> 371 </td><td> 88.8 </td><td> 10.68 </td><td></td></tr><tr><td> 374 </td><td> 93.9 </td><td> 16.86 </td><td></td></tr><tr><td> 376 </td><td> 92.9 </td><td> 15.67 </td><td></td></tr><tr><td> 377 </td><td> 93.1 </td><td> 9.99 </td><td></td></tr><tr><td> 378 </td><td> 93.6 </td><td> 13.57 </td><td></td></tr><tr><td> 379 &lt;/ Td&gt; <td> 92.6 </td><td> 19.86 </td><td></td></tr><tr><td> 380 </td><td> 91.1 </td><td> 8.46 </td><td></td></tr><tr><td> 381 </td><td> 93.9 </td><td> 14.82 </td><td></td></tr><tr><td> 382 </td><td> 92.1 </td><td> 23.06 </td><td></td></tr><tr><td> 383 </td><td> 92.9 </td><td> 11.82 </td><td></td></tr><tr><td> 384 </td><td> 89.1 </td><td> 7.73 </td><td></td></tr></tbody></table> לוח 3. כדאיות אחוזים וריכוז תא כפי שנקבע באמצעות מונה תא אוטומטי ומנתח כדאיות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig1.jpg" /> איור 1. עיצוב לזריעת תאים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig2.jpg" /> איור 2.עיצוב עבור מחלק תרכובות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig3.jpg" /> איור 3. טווח דינמי של הסיווג הפונקציונלי באמצעות המערכת מבוססת ה-CDS. גרף ממחיש ערכים של מידת חוסר איזון בין התגובות לGi וגירוי Gs הושג בPBMCs מחולים עם עקמת אידיופטית. ערכים נמדדו על ידי המערכת מבוססת ה-CDS בתגובה ל10 מיקרומטר של סומטוסטטין וisoproterenol. כל נקודה מייצגת את ΔG של שני התגובות בשני עותקים. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig4.jpg" /> איור 4. השפעת rOPN בתגובה לגירוי Gi בPBMCs. תאים היו סרום רעב ל18 שעות בנוכחותו או היעדריו של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר rOPN ולאחר מכן מגורה עם 10<html> 56; M של סומטוסטטין ליזום תגובה תאית בתיווך-Gi. הנתונים בגרף נוצרו מעכבה מרבי המינימום ומתאים לממוצע של תגובה בשני עותקים. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg" /> איור 5. מצב תפקודי של חלבון Gi בPBMCs משליטה ונושאי scoliostic. PBMCs מנבדקי ביקורת וחולי scoliotic נחשפו להגדלת ריכוזים של סומטוסטטין כדי לעורר חלבוני Gi באמצעות קולט סומטוסטטין אנדוגני. התגובה התאית נמדדה על ידי מערכת מבוססת ה-CDS כמתואר בסעיף ההליך. עקומות נוצרו מעכבה מרבי מינימום. כל עקומה מייצגת את רגרסיה ליניארית. הנתונים היו מנורמלים לתגובה מקסימלי בתאים מנבדקי ביקורת וכל נקודה מתאימה לממוצע של תגובה בשני עותקים./ &quot;= היעד&quot; _blank 50768/50768fig5large.jpg &quot;&gt; לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig6.jpg" /> איור 6. הפצה של קבוצות פונקציונליות בין שלבים שונים של עקמת. עוקבה גדולה של חולים עם scoliotic 794 (עקמומיות בין 10-44 °) מתונה ו162 מקרים חמורים (עקמומיות גדולה מ45 °) ואחריו באופן קבוע בSainte-Justine חולים, סווגו על פי המידה של חוסר איזון בין התגובה לGi וGs גירוי. תגובות נמדדו על ידי המערכת מבוססת ה-CDS בתגובה ל10 מיקרומטר של סומטוסטטין וisoproterenol.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy at JoVE.com

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

פרוטוקול מובנה מוצג לassay מבוסס תאים כמבחן פונקציונלי לנבא את הפרוגנוזה של עקמת אידיופטית באמצעות ספקטרוסקופיית סלולרית דיאלקטרי (CDS). Assay ניתן לבצע עם תאים טריים או קפוא היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) וההליך יושלם בתוך 4 ימים.

פרוטוקול assay המבוסס תא לחיזוי הפרוגנוזה של Idiopathic עקמת באמצעות סלולרית דיאלקטרי ספקטרוסקופיה

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

cell-based-assay-protocol-for-prognostic-prediction-idiopathic

Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K Views.  Sainte-Justine University Hospital Research Center.  פרוטוקול מובנה מוצג לassay מבוסס תאים כמבחן פונקציונלי לנבא את הפרוגנוזה של עקמת אידיופטית באמצעות ספקטרוסקופיית סלולרית דיאלקטרי (CDS). Assay ניתן לבצע עם תאים טריים או קפוא היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) וההליך יושלם בתוך 4 ימים. 

Video: Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain (PPOP)

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative short-term and long-term effects on the mother. Prior to women undergoing surgery, can we predict who is at risk for developing significant postoperative pain and potentially prevent or minimize its negative consequences? These are the fundamental questions that a team from the University of Washington, Stanford University, the Catholic University in Brussels, Belgium, Santa Joana Women's Hospital in S&atilde;o Paulo, Brazil, and Rambam Medical Center in Israel is currently evaluating in an international research collaboration. The ultimate goal of this project is to provide optimal pain relief during and after cesarean section by offering individualized anesthetic care to women who appear to be more 'susceptible' to pain after surgery.
A significant number of women experience moderate or severe acute post-partum pain after vaginal and cesarean deliveries. 1 Furthermore, 10-15% of women suffer chronic persistent pain after cesarean section. 2 With constant increase in cesarean rates in the US 3 and the already high rate in Brazil, this is bound to create a significant public health problem. When questioning women's fears and expectations from cesarean section, pain during and after it is their greatest concern. 4 Individual variability in severity of pain after vaginal or operative delivery is influenced by multiple factors including sensitivity to pain, psychological factors, age, and genetics. The unique birth experience leads to unpredictable requirements for analgesics, from 'none at all' to 'very high' doses of pain medication. Pain after cesarean section is an excellent model to study post-operative pain because it is performed on otherwise young and healthy women. Therefore, it is recommended to attenuate the pain during the acute phase because this may lead to chronic pain disorders. The impact of developing persistent pain is immense, since it may impair not only the ability of women to care for their child in the immediate postpartum period, but also their own well being for a long period of time.
In a series of projects, an international research network is currently investigating the effect of pregnancy on pain modulation and ways to predict who will suffer acute severe pain and potentially chronic pain, by using simple pain tests and questionnaires in combination with genetic analysis. A relatively recent approach to investigate pain modulation is via the psychophysical measure of Diffuse Noxious Inhibitory Control (DNIC). This pain-modulating process is the neurophysiological basis for the well-known phenomenon of 'pain inhibits pain' from remote areas of the body. The DNIC paradigm has evolved recently into a clinical tool and simple test and has been shown to be a predictor of post-operative pain.5 Since pregnancy is associated with decreased pain sensitivity and/or enhanced processes of pain modulation, using tests that investigate pain modulation should provide a better understanding of the pathways involved with pregnancy-induced analgesia and may help predict pain outcomes during labor and delivery. For those women delivering by cesarean section, a DNIC test performed prior to surgery along with psychosocial questionnaires and genetic tests should enable one to identify women prone to suffer severe post-cesarean pain and persistent pain. These clinical tests should allow anesthesiologists to offer not only personalized medicine to women with the promise to improve well-being and satisfaction, but also a reduction in the overall cost of perioperative and long term care due to pain and suffering. On a larger scale, these tests that explore pain modulation may become bedside screening tests to predict the development of pain disorders following surgery.

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain PPOP

Diffuse noxious inhibitory control, temporal summation and wound hyperalgesia testing are demonstrated in the obstetric patient. These tests evaluate inhibitory and excitatory mechanisms of pain processing and are here utilized to evaluate endogenous analgesia at different time-points during pregnancy and the peripartum period to help reveal individual s risk for persistent pain.

פרדיגמה ניסויית עבור חיזוי של הכאבים שלאחר הניתוח (PPOP)

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative ...

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

שיטה בידוד איילט Murine והשתלות כליה Subcapsular

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

להתמקד גיבוש: Assay מבוסס תאים כדי לקבוע את הפוטנציאל שבעור של ג&#39;ין

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and negatively impact patient quality of life and long term survival. Advances in the understanding of the biological pathways associated with normal tissue toxicities have allowed for the development of interventional drugs, however, current response studies are limited by a lack of quantitative metrics for assessing the severity of skin reactions. Here we present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe the instrumentation design of the DOS system as well as the inversion algorithm for extracting the optical parameters. Finally, to demonstrate clinical utility, we present representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema and compare the results with a commonly employed visual scoring. The described DOS method offers an objective, high through-put evaluation of skin toxicity via functional response that is translatable to the clinical setting.

We present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe DOS instrumentation design, optical parameters extraction algorithms and the animal handling procedures required to yield representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema.

מפוזר ספקטרוסקופיה אופטית עבור הערכה כמותית של רעילות העור לקרינה מייננת מושרה חריפה שימוש במודל של עכברים

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently inhibit viral replication, they have no direct effect on the expression of viral proteins transcribed from a viral covalently closed circular DNA (cccDNA). As high viral antigen load may play a role in this chronic and HBV-related carcinogenesis, the goal of HBV treatment is to eradicate viral proteins. HBV regulatory protein X (HBx) binds to the host DNA damage-binding protein 1 (DDB1) protein to degrade structural maintenance of chromosomes 5/6 (Smc5/6), resulting in activation of viral transcription from cccDNA. Here, using a split luciferase complementation assay system, we present a comprehensive compound screening system to identify inhibitors of the HBx-DDB1 interaction. Our protocol enables easy detection of interaction dynamics in real time within living cells. This technique may become a key assay to discover novel therapeutic agents for treatment of HBV infection.

Here, we present a method for screening anti-hepatitis B viral agents that inhibit the HBx-DDB1 interaction using a split luciferase assay system. This system allows easy detection of protein-protein interactions and is suitable for identifying inhibitors of such interactions.

זיהוי מעכבי של האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות פיצול לוציפראז מערכת המערכת

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

Quantification of Optic Nerve Cross Sectional Area on MRI: A Novel Protocol using Fiji Software

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic nerve cross-sectional assessment and quantification using 3 T MRI for image acquisition and ImageJ's Fiji software for image processing quantification. Image acquisition was performed using 3 T MRI, with proper instructions for the patient to ensure straight fixation during imaging. A T2-weighted fat suppressed sequence was used. A coronal cut taken 3 mm behind the globe and perpendicular to the optic nerve axis should be uploaded to the software. Using the threshold function, the white matter area of the optic nerve is selected and quantified, thus, eliminating inter-individual measurement bias. We also described the normal limits for the optic nerve cross-sectional area according to age, based on previously published literature. We used the described protocol to assess optic nerve of a suspected glaucoma patient. The optic nerve cross-sectional area was found to be within the normal limits, a finding further confirmed via optical coherence tomography of the optic nerve.

We provided a detailed protocol for a standardized method of optic nerve assessment and quantification using MRI, utilizing a widely available imaging sequence, and open access software for image analysis. Following this standardized protocol would provide meaningful data for comparison between different patients and different studies.

כימות אזור חתך עצב הראייה על MRI: פרוטוקול חדשני באמצעות תוכנת פיג'י

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic ...

A Real-World High-Intensity Interval Training Protocol for Cardiorespiratory Fitness Improvement

High-Intensity Interval Training (HIIT) has emerged as an interesting time-efficient approach to increase exercise adherence and improve health. However, few studies have tested the efficiency of HIIT protocols in a &#34;real world&#34; setting, e.g., HIIT protocols designed for outdoor spaces without specialized equipment. This study presents a &#34;real world&#34; training protocol, named &#34;beep training&#34;, and compares the efficiency of a HIIT regiment versus a traditional long-duration Moderate-Intensity Continuous Training (MICT) regiment using this beep training protocol on VO2 max of overweight untrained men. Twenty-two subjects performed outdoor running with MICT (n = 11) or HIIT (n = 11). Cardiorespiratory fitness was assessed before and after training protocols using a metabolic analyzer. Both training protocols were performed 3 days a week for 8 weeks using the Beep Test results. The MICT group performed the exercise program at 60%-75% of the maximum speed of the 20 m shuttle test (Vmax) and with a progression of the distance of 3,500-5,000 m. The HIIT group performed the interval exercise with 7-10 bouts of 200 m at 85%-100% of the maximum speed of the 20 m shuttle test (Vmax), interspersed with 1 min of passive recovery. Although the HIIT group presented a significantly lower training volume than the MICT group (p &#60; 0.05) after 8 weeks of beep training, HIIT was superior to MICT in improving VO2 max (MICT: ~4.1%; HIIT: ~7.3%; p &#60; 0.05). The &#34;real world&#34; HIIT regiment based on beep training protocol is a time-efficient, low-cost, and easy-to-implement protocol for overweight untrained men.

This study presents a low-cost and easy-to-implement "real world" high-intensity interval training (HIIT) protocol for scientific research and discusses its efficiency for cardiorespiratory fitness.

פרוטוקול אימון אינטרוולים בעצימות גבוהה בעולם האמיתי לשיפור כושר לב-ריאה

High-Intensity Interval Training (HIIT) has emerged as an interesting time-efficient approach to increase exercise adherence and improve health. However, ...

Network Pharmacology Prediction and Metabolomics Validation of the Mechanism of Fructus Phyllanthi against Hyperlipidemia

Hyperlipidemia has become a leading risk factor for cardiovascular diseases and liver injury worldwide. Fructus Phyllanthi (FP) is an effective drug against hyperlipidemia in Traditional Chinese Medicine (TCM) and Indian Medicine theories, however the potential mechanism requires further exploration. The present research aims to reveal the mechanism of FP against hyperlipidemia based on an integrated strategy combining network pharmacology prediction with metabolomics validation. A high-fat diet (HFD)-induced mice model was established by evaluating the plasma lipid levels, including total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C). Network pharmacology was applied to find out the active ingredients of FP and potential targets against hyperlipidemia. Metabolomics of plasma and liver were performed to identify differential metabolites and their corresponding pathways among the normal group, model group, and intervention group. The relationship between network pharmacology and metabolomics was further constructed to obtain a comprehensive view of the process of FP against hyperlipidemia. The obtained key target proteins were verified by molecular docking. These results reflected that FP improved the plasma lipid levels and liver injury of hyperlipidemia induced by a HFD. Gallic acid, quercetin, and beta-sitosterol in FP were demonstrated as the key active compounds. A total of 16 and six potential differential metabolites in plasma and liver, respectively, were found to be involved in the therapeutic effects of FP against hyperlipidemia by metabolomics. Further, integration analysis indicated that the intervention effects were associated with CYP1A1, AChE, and MGAM, as well as the adjustment of L-kynurenine, corticosterone, acetylcholine, and raffinose, mainly involving tryptophan metabolism pathway. Molecular docking ensured that the above ingredients acting on hyperlipidemia-related protein targets played a key role in lowering lipids. In summary, this research provided a new possibility for preventing and treating hyperlipidemia.

The present protocol describes an integrated strategy for exploring the key targets and mechanisms of Fructus Phyllanthi against hyperlipidemia based on network pharmacology prediction and metabolomics verification.

חיזוי פרמקולוגיה ברשת ותיקוף מטבולומיקה של מנגנון פרוקטוס פילנתי נגד היפרליפידמיה

Hyperlipidemia has become a leading risk factor for cardiovascular diseases and liver injury worldwide. Fructus Phyllanthi (FP) is an effective drug ...

גילוי סמנים ביולוגיים לא פולשניים לפרוטאומיקה של דמעות באמצעות LC-MS

A Protein Suspension-Trapping Sample Preparation for Tear Proteomics by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for several ocular diseases and conditions. The suspension trapping column has been reported to be an efficient and user-friendly sample preparation workflow for the broad application of downstream proteomic analysis. Yet, this strategy has not been well-studied in the analysis of human tear proteome. The present protocol describes an integrated workflow from clinical human tear samples to purified peptides for non-invasive tear protein biomarker research using mass spectrometry, which provides insights into disease biomarkers and monitoring when combined with bioinformatics analysis. A protein suspension trapping sample preparation was applied and demonstrated the discovery of tear proteome with fast, reproducible, and user-friendly procedures, as a universal, optimized sample preparation for human tear fluid analysis. In particular, the suspension trapping procedure outperformed in-solution sample preparation in terms of peptide recovery, protein identification, and shorter sample preparation time.

מחבר זרקור: קידום ניתוח נוזל הדמעות באמצעות פרוטוקול סטנדרטי לחקר פרוטאומיקה 

This protocol describes a method for collecting tear samples using Schirmer strips and an integrated quantitative workflow for discovering non-invasive tear protein biomarkers. The suspension trapping sample preparation workflow enables fast and robust tear sample preparation and mass spectrometric analysis, resulting in higher peptide recovery yields and protein identification than standard in-solution procedures.

הכנת דגימה ללכידת תרחיף חלבונים עבור פרוטאומיקה של דמעות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for ...