עבודה זו נתמכה על ידי המועצה האוסטרלית הלאומית לבריאות והמחקר רפואי, קרן סטאר סיינטיפיק (אוסטרליה), תסמונת טורט האגודה (ארה&quot;ב), הטרשת הנפוצה טריש קרן מחקר והטרשת הנפוצה אוסטרליה מחקר, קרן Petre (אוסטרליה), ל &#39;רבקה קרן קופר למחקר רפואית (אוסטרליה). אנו מודים לכל חולים ובני משפחה שסיפקו דגימות למחקר שלנו.

<html> 1. Subcloning אסטרטגיה לבניית pIRES2-EGFP וקטור הקידוד D2R או NMDAR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג שיבוט cDNA באורך מלא של D2R אדם או למקטע NMDAR 1 (NR1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר וקטור ביטוי, כגון pIRES2-EGFP, אשר מתאים לביטוי של חלבונים הטרנסממברני עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר כתב (GFP) תחת שליטה של ​​אתר פנימי הריבוזום כניסה (IRES), מה שמאפשר שני אנטיגנים וGFP להיות coexpressed ב תאים בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subclone cDNA האנושי בתוך וקטור pIRES2-EGFP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לsubclone cDNA, השתמש אנזימי הגבלה מתאימים (לדוגמא NheI וXhoI לאדם D2R cDNA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cDNA לחתוך ולקשור להכניס בתוך וקטור pIRES2-EGFP מוגבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף ligated pIRES2-EGFP D2R או וקטור NMDAR כדי לבדוק אם הווקטור מכיל את הרצף הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר ולהגביר D2R pIRES2-EGFP או וקטור NMDAR לשימוש מאוחר יותר בtransfection. </li></ol></li></ol>itle &quot;&gt; 2. transfection תא HEK293 על ביטוי העצבי Antigen <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאי HEK293 בצלוחיות תרבית רקמה עם הנשר בינוני של Dulbecco הטרי השונה (1x) (DMEM) להשלים עם L / 4.5 גרם D-גלוקוז, L-גלוטמין ו110 מ&quot;ג / פירובט נתרן L בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ&quot;מ Glutamax, ו50 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאי HEK293 באמצעות טריפסין והעברת צינור חרוטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף ידי צנטריפוגה תאים ב 250 XG במשך 6 דקות ו resuspend התא גלולה ב DMEM המלא הטרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים זרע 6 צלחות גם בסביבות 8 x 10 5 תאים היטב / ותרבות הלילה בDMEM 2ml על 37 ° C ו 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהם הגיעו confluency סביב 70%, transfect HEK293 התאים עם pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 NMDAR + תאים), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + תאים), ו( HEK293 תאי CTL; בקרת וקטור) pIRES2-EGFP כדלקמן.<html> לשמור על כמה תאי HEK293 untransfected לפיצוי בשלב מאוחר יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הנפח הנדרש של תערובת transfection הכולל 2.5 מיקרוגרם DNA, 200 μl 0.9% נתרן כלורי ו4 מיקרוגרם / מיליליטר polyethylenimine / טוב (כל אחד המכיל 2 מיליליטר DMEM להשלים טרי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד מערבולת התערובת ל10 שניות ו דגירה בטמפרטורת חדר (RT) עבור 10 דקות, לפני שמוסיף נפח של תערובת transfection לבארות המתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הצלחת, לעטוף את הצדדים עם Parafilm, ו צנטריפוגות ב XG 280 למשך 5 דקות כדי לסייע transfection תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את Parafilm ולאחר מכן למקם בחממה לתרבות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף תקשורת תרבות 18 שעה מאוחר יותר עם DMEM המלא טרי, ולשמור בתרבות לעוד 72 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: לאחר transfection 72 שעה, ניתן לבחור תאי transfected על ידי התרבות בDMEM המלא בתוספת 250 מיקרוגרם / מיליליטר Geneticin, על מנת לקבל transfectant יציב polyclonal. </li></ol></li></ol>class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. לזרום assay המבוסס תא Cytometry לאיתור של נוגדנים לאנטיגנים במשטח עצביים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, וHEK293 תאי CTL על ידי דגירה עם 500 μl / טוב Versene למשך כ 5 דקות על 37 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב 2ml/well של PBS (-Ca 2 + /-Mg 2 +) בתוספת 2% FBS (PBS / FBS) והעברה ל15 מיליליטר או 50 מיליליטר צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים על ידי צנטריפוגה ב250 XG במשך 6 דקות ו resuspend התא גלולה ב 15-50 מיליליטר PBS / FBS. חזור על לשטוף 2x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים ולאחר מכן resuspend ב PBS / FBS ב1 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב תבנית 96, גם לרכישת cytometry הזרימה, בהתחשב בכך שHEK293 D2R + או HEK293 NMDAR + תאים, כמו גם תאי HEK293 CTL יהיו חייבים להיות הודגרו עם כל דגימת חולה או נוגדן ראשוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע בצלחת 96 היטב V-תחתון ב50,000 תאים /ll פי cytometry זרימת תבנית רכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים על ידי צנטריפוגה צלחת 96 היטב ב450 XG במשך 5 דקות ולהסיר בעדינות את supernatant באמצעות פיפטה רבה אלקטרונית או ידנית, מטה את הצלחת על זווית ונזהר שלא לשאוב את התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR +, וHEK293 תאי CTL עבור שעה 1 ב RT בחושך עם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילולים סדרתי של נוגדן ראשוני על מנת להעריך את הביטוי על פני השטח אנטיגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות חולה כדי לזהות נוגדנים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בזרימה מתאימה cytometry בקרות פיצוי, למשל. תאי HEK293 untransfected בלא כתם, ה-GFP + HEK293 תאים (AF647 -), וAF647 + HEK293 תאי untransfected (GFP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים על ידי צנטריפוגה ב450 XG במשך 5 דקות ו resuspend התא גלולה ב μl 170 PBS / FBS. חזור על שלב לשטוף פעמים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור h 1r ב RT בחושך עם 1:100 דילול של נוגדנים משני AF647 מצומדות (IgG אנטי אנושי לסרום מטופל ואנטי העכבר IgG לנוגדנים עיקריים נגד NR1 או אנטי D2R). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים שלוש פעמים, כמו בשלב 3.7, ו resuspend ב35 μl PBS / FBS עבור cytometry זרימת רכישת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת סמפלר התפוקה גבוהה (HTS) על cytometer הזרימה (BDLSRII). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש 10,000 אירועים / טוב פי cytometry זרימת תבנית רכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצוא ולאחר מכן לנתח את הנתונים לניתוח באמצעות cytometry זרימת חבילת תוכנה, כגון v7.5 FlowJo: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, שער HEK293 התאים חיים המבוסס על קדימה (גודל) וצד (גרעיניות) מפזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי שער נוסף חיים HEK293 מבוססים על ה-GFP-חיוביות גבוהה לנתח רק את תאי transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את עוצמת הקרינה הממוצעת (MFI) של ערוץ AF647 בתוך התאים GFP חיובי בשידור חי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני יצוא לאקסל או פריזמה לניתוח: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש גoncentrations של נוגדן ראשוני (אנטי NMDAR או נוגדן אנטי D2R) לעומת MFI המתקבל מהתאים הודגרו עם נוגדנים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימת חולה ובקרה, לקבוע את ΔMFI ידי הפחתת MFI של HEK293 תאי CTL מMFI של HEK293 D2R + או HEK293 NMDAR + תאים, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הסף של חיוביות נוגדנים על ידי הוספת שלוש סטיות תקן מעל ΔMFI הממוצע של קבוצת הביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות בודדות עלילה קובצו לפי סוג הדם שלהם על גרף ומייצגות את הסף כקו. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encephalitis+and+antibodies+to+synaptic+and+neuronal+cell+surface+proteins.">Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins.</a> Neurol. 77, 179-189 (2011).</li><li>Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+associated+with+diseases+of+the+CNS:+new+developments+and+future+challenges.">Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges.</a> Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).</li><li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-NMDA-receptor+encephalitis:+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies.">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).</li><li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma.">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).</li><li>Dale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-methyl-D-aspartate+receptor+antibodies+in+pediatric+dyskinetic+encephalitis+lethargica.">N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica.</a> Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).</li><li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+the+GABA(B)+receptor+in+limbic+encephalitis+with+seizures:+Case+series+and+characterisation+of+the+antigen.">Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen.</a> Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).</li><li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+antibodies+in+limbic+encephalitis+alter+synaptic+receptor+location.">AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location.</a> Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).</li><li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+Kv1+potassium+channel-complex+proteins+leucine-rich,+glioma+inactivated+1+protein+and+contactin-associated+protein-2+in+limbic+encephalitis,+Morvan&#8217;s+syndrome+and+acquired+neuromyotonia.">Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan&#8217;s syndrome and acquired neuromyotonia.</a> Brain. 133, 2734-2748 (2010).</li><li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+LGI1+as+the+antigen+in+limbic+encephalitis+previously+attributed+to+potassium+channels:+a+case+series.">Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series.</a> Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).</li><li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+metabotropic+glutamate+receptor+5+in+the+Ophelia+syndrome.">Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome.</a> Neurol. 77, 1698-1701 (2011).</li><li>Dale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+surface+dopamine-2+receptor+in+autoimmune+movement+and+psychiatric+disorders.">Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders.</a> Brain. , (2012).</li><li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis:+an+observational+cohort+study.">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).</li><li>Hughes, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+synaptic+mechanisms+of+anti-NMDA+receptor+encephalitis.">Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis.</a> J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).</li><li>Bien, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathology+of+autoantibody-associated+encephalitides:+clues+for+pathogenesis.">Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis.</a> Brain. 135, 1622-1638 (2012).</li><li>Waters, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serologic+diagnosis+of+NMO:+a+multicenter+comparison+of+aquaporin-4-IgG+assays.">Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays.</a> Neurol. 78, 665-671 (2012).</li><li>McLaughlin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+B+Cell+Autoimmunity+to+a+Myelin+Surface+Antigen+in+Pediatric+Multiple+Sclerosis.">Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis.</a> J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).</li><li>Probstel, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+MOG+are+transient+in+childhood+acute+disseminated+encephalomyelitis.">Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis.</a> Neurol. 77, 580-588 (2011).</li><li>Cho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+Region+of+Dopamine+D2+Receptor,+a+Rhodopsin+Family+GPCR,+Regulates+Proper+Integration+into+Plasma+Membrane+and+Endocytic+Routes.">N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes.</a> British journal of pharmacology. , (2011).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pathogenic+antibody+response+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+multiple+sclerosis.">Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).</li><li>Brilot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+children+with+inflammatory+demyelinating+central+nervous+system+disease.">Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease.</a> Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).</li><li>Boronat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encephalitis+and+Antibodies+to+Dipeptidyl-Peptidase-Like+Protein-6,+a+Subunit+of+Kv4.2.">Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2.</a> Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).</li><li>Hinson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4-binding+autoantibodies+in+patients+with+neuromyelitis+optica+impair+glutamate+transport+by+down-regulating+EAAT2.">Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2.</a> J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).</li></ol>

ניגוד עניינים: פטנט הוגש על ידי FB וRCD (אוניברסיטת סידני) בטענה D2R כמטרה לנוגדנים עצמיים.

מאמר זה מתאר יישום רומן של cytometry זרימת assay מבוסס תאים חיים כדי לזהות נוגדני מיקוד חלבונים עצביים תא שטח ספציפיים באמצעות סמפלר תפוקה גבוהה. באמצעות טכניקה זו, אנו מדווחים כי תת קבוצה של חולים שנפגעו במחלות במערכת העצבים המרכזית אוטואימוניות יש נוגדנים בסרום על פני הש?...

בשנים האחרונות, טפסים אוטואימונית של מערכת עצבים המרכזית מחלות (CNS) זוהו. הוכח כי מחלות אלה קשורים ומוגדרים על ידי הנוכחות של נוגדנים עצמיים. נוגדנים אלה נקשרים לקולטנים עצביים או חלבונים סינפטיים המעורבים ב1,2 העצבית. אנטיגנים שונים שכבר זוהו, כגון קולטן N-methyl-D-aspartate (NMDAR) 3-5, חומצת B קולטן γ-aminobutyric (GABA-B) קולטן 6, α-אמינו-3-hydroxy-5-methyl-4- קולטן חומצת isoxazolepropionic (AMPA) 7, ערוץ אשלגן תלוי מתח (VGKC) חלבונים הקשורים: חלבון לאוצין עשיר מופעלת גליומה 1 (LGL-1) וקשורים contactin החלבון 2 (capsr2) קולטן 8,9, גלוטמט 5,10 , ודופאמין-2 קולטן (D2R) 11. בעבר, הפרעות אלה אוטואימונית של מערכת העצבים המרכזית (בעיקר בשם דלקת קרום המוח) היו לעתים קרובות לא מאובחנים ואינם מטופלים. סמנים ביולוגיים נוגדנים אלה רומן, למשלנוגדן NMDAR או נוגדן D2R, השתפר באופן משמעותי אבחנה ומודעות, ופתח אפשרויות טיפול בחולים. ואכן, טיפול מוקדם עם immunotherapies קשור בתוצאות משופרות 11,12. שיטות מסורתיות לאיתור נוגדנים, כגון assay enzyme-linked immunosorbent (ELISA) וכתם מערבי שימשו לזיהוי של נוגדנים בסרום. עם זאת, הם לא בקלות יאפשר זיהוי של אפיטופים תאיים או משטח ו, ולא, עשוי לחשוף immunoreactivity כלפי epitope תאיים. יתר על כן, נוגדנים שנקשרים לתחום תאי של חלבונים חשובים המעורבים בהעברה עצבית עשויים להיות 2,3,7,13,14 פתוגניים. לכן, הפיתוח של מבחני מדויקים ורגישים כדי לגלות תא שטח רלוונטי או מטרות נוגדנים תאיים בחולים הוא בעל חשיבות עליונה. שיטת תקן זהב בתחום מתבססת על השימוש בתאים חיים, במה שמכונה &quot;תא-baמבחני SED &quot;. שיטה זו כרוכה בביטוי של אנטיגן על פני השטח של תאי יונקים (לרוב 293 תאים עובריים אנושיים בכליות (HEK293)) בצורה המקורית שלו על ידי transfection של וקטורים המכילים את רצף cDNA המלא של אנטיגן של עניין. לאחר מכן תאי nonpermeabilized בשידור חי מודגרת עם סרום מטופל מדולל ואחריו אימונוגלובולינים אנטי אנושיים fluorochrome מצומדות (איג) נוגדנים משני. העצמה או רמת הקרינה לאחר מכן זוהתה והיא קשורה לרמה של נוגדן מחייב. טכניקה זו היא ספציפית, אלא כאחד אנטיגן הוא ביטוי יתר בתאים. שימוש נרחב ביותר &quot;לקריאה מתוך&quot; כבר ניתוח מיקרוסקופיה confocal לאחר immunocytochemistry 4,5,8-10. עם זאת, cytometry זרימת מבחני מבוססי תאים שימשה בהצלחה לאיתור נוגדנים בחולים עם מחלות demyelinating 15-17. בפרט, ווטרס ואח&#39;. 15 לעומת זיהוי של נוגדנים באמצעות מחבתאל של שיטות לזיהוי נוגדנים כוללים מבחני מבוססי תאים ואחריו במיקרוסקופ או cytometry זרימת מנתח, והוכיח cytometry זרימת assay מבוסס תאים להיות השיטה רגישה ביותר, מדויקת ואמינה. לכן, cytometry זרימת assay מבוסס תאים היא יתרון כפי שהיא כמוני, לא חוקר תלוי, ואינו כרוכים בשימוש בחומר רדיואקטיבי. זה גם נוח שכן היא מאפשרת מחזורי מטופל גדולים להיות מאושרים בפרק זמן קצר. לאחרונה, יש לנו מותאם זרימת תפוקה גבוהה cytometry assay מבוסס תאים כדי לזהות נוגדני NMDAR ונוגדני D2R בחולים עם מחלות אוטואימוניות של מערכת העצבים המרכזית 11. הקבוצה שלנו לאחרונה זוהתה נוגדני NMDAR בסרה מטופל באמצעות cytometry זרימת assay מבוסס תאים. סרום הנוגדנים חיוביים NMDAR אלה נותחו בעבר באמצעות מיקרוסקופיה confocal ונמצא גם להיות חיובי 11. פרוטוקול זה מתאר cytometry זרימה assay מבוסס תאים לצורך זיהוי של גנוגדן onformation רגיש במערכת העצבים המרכזית בסרום חולה ניצול סמפלר תפוקה גבוהה אוטומטי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">pIRES2-EGFP vector</td>
			<td style="width:187px;">Clontech</td>
			<td style="width:136px;">6029-1</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA</td>
			<td style="width:187px;">Missouri S&#38;T cDNA Resource Centre</td>
			<td style="width:136px;">DRD020TN00</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">Gift from Prof A. Vincent&#160; (Oxford, UK)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)</td>
			<td style="width:187px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:136px;">556308</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">WH0001813M1-50UG</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">A31571</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">A21445</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">11995-065</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Foetal bovine serum</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">10099-141</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15710-072</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">35050-061</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15140-122</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Geneticin</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">10131-035</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">14190-144</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TrypLE Express (1x) with Phenol Red</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">12605-028</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">0.9% Sodium chloride</td>
			<td style="width:187px;">Baxter</td>
			<td style="width:136px;">AHF7975</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Polyethylenimine</td>
			<td style="width:187px;">Polysciences Inc</td>
			<td style="width:136px;">9002-98-6</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Versene</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15040-066</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">XhoI</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">10899194001</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NheI</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">10885843001</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PureLink PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">K3100-01</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">JetQuick Gel Extraction Spin Kit</td>
			<td style="width:187px;">Genomed</td>
			<td style="width:136px;">420050</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">10481220001</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">Plasmid&#160;Plus&#160;Maxi Kit</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td style="width:136px;">12963</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">Name of Equipment/Software</td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Model/Version</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Flow cytometer with high-throughput sampler system</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">BDLSRII with HTS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Electronic multichannel pipette (15-300 &#956;l)</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:136px;">613-2240P</td>
			<td style="width:173px;">12-channel Xplorer Plus</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:255px;">Excel</td>
			<td style="width:187px;">Microsoft</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Prism</td>
			<td style="width:187px;">GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">v4</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:255px;">FlowJo</td>
			<td style="width:187px;">Treestar</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">v7.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">50 ml polypropylene conical tubes</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">352070</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">6-well plate</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">353046</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tissue culture flask (T75)</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">353136</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Parafilm</td>
			<td style="width:187px;">Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td style="width:136px;">PM-992</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">V-bottom 96-well plate</td>
			<td style="width:187px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">651180</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput flow cytometry cell-based assay to detect antibodies to n-methyl-d-aspartate receptor or dopamine-2 receptor in human serum

במהלך השנים האחרונות, נוגדנים כנגד פני השטח וחלבונים המעורבים בקונפורמציה העצבית זוהו במחלות של מערכת העצבים המרכזית אוטואימונית בילדים ומבוגרים. נוגדנים אלה היו בשימוש כדי להדריך את האבחון וטיפול. מבחני מבוססי תאים שיפרו את זיהוי של נוגדנים בסרום חולה. הם מבוססים על הביטוי על פני השטח של מוח אנטיגנים על תאי אוקריוטים, אשר לאחר מכן מודגרת עם סרה מטופל מדוללת ואחריו נוגדנים משני fluorochrome-מצומדות. לאחר כביסה, נוגדנים משני מחייבים מנותחים לאחר מכן על ידי cytometry זרימה. הקבוצה שלנו פיתחה זרימת תפוקה גבוהה cytometry assay מבוסס תאים חיים כדי לזהות באופן מהימן נוגדנים כנגד קולטני הנוירוטרנסמיטר ספציפי. שיטת cytometry זרימה זו היא ישר קדימה, כמוני, יעיל, והשימוש במערכת סמפלר תפוקה גבוהה מאפשר למחזורי מטופל גדולים להיות assayed בקלות בפרק זמן קצר של זמן. בנוסף, זו המבוססת על תא כלומר ניתן להתאים בקלות לאיתור נוגדנים למטרות רבות ושונות אנטיגני, שניהם ממערכת העצבים המרכזית והפריפריה. גילוי סמנים ביולוגיים נוגדן רומן נוספים יאפשר אבחון מהיר ומדויק ולשפר את הטיפול בהפרעות חיסונית בתיווך.

תאי חי HEK293 D2R + וHEK293 CTL נרכשו בcytometer הזרימה באמצעות סמפלר תפוקה גבוהה. במהלך ניתוח, תאים היו מגודרות המבוססים על פיזור קדימה (גודל) ופיזור בצד פרמטרים (גרעיניות) (איורים 1 א ו1D). HEK293 תאי transfected הביעו מולקולת הכתב, ה-GFP, בציטופלסמה, ותאי untransfected הוצאו מנית...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum at JoVE.com

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

במהלך השנים האחרונות, מבחני מבוססי תאים חיים כבר השתמשו בהצלחה כדי לזהות נוגדנים כנגד פני השטח ואנטיגנים קונפורמציה. כאן, אנו מתארים שיטה באמצעות זרימת cytometry תפוקה גבוהה המאפשר הניתוח של קבוצות גדולות של חולים. זיהוי של נוגדני רומן ישפר את האבחון וטיפול בהפרעות חיסונית בתיווך.

Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

high-throughput-flow-cytometry-cell-based-assay-to-detect-antibodies

Research

JoVE Journal

Medicine

16.0K Views.  The University of Sydney.  במהלך השנים האחרונות, מבחני מבוססי תאים חיים כבר השתמשו בהצלחה כדי לזהות נוגדנים כנגד פני השטח ואנטיגנים קונפורמציה. כאן, אנו מתארים שיטה באמצעות זרימת cytometry תפוקה גבוהה המאפשר הניתוח של קבוצות גדולות של חולים. זיהוי של נוגדני רומן ישפר את ...

Video: High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

המדידה והטיפול בדיכוי בעין עצלה

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after stroke. These myeloid cell subpopulations can display different phenotypes and functions and need to be distinguished and characterized to study their regulation and contribution to tissue damage. This protocol provides two different methodologies for brain immune cell characterization: a precise stereological approach and a flow cytometric analysis. The stereological approach is based on the optical fractionator method, which calculates the total number of cells in an area of interest (infarcted brain) estimated by a systematic random sampling. The second characterization approach provides a simple way to isolate brain leukocyte suspensions and to characterize them by flow cytometry, allowing for the characterization of microglia, infiltrated monocytes and neutrophils of the ischemic tissue. In addition, it also details a cerebral ischemia model in mice that exclusively affects brain cortex, generating highly reproducible infarcts with a low rate of mortality, and the procedure for histological brain processing to characterize infarct volume by the Cavalieri method.

Brain myeloid cells characterization following stroke can be performed by stereology using the optical fractionator method, or by a flow cytometric analysis of brain leukocytes suspensions. Both are useful techniques to perform an accurate phenotypical distinction of the main myeloid cell subsets found in the ischemic brain.

Stereological וcytometry זרימת אפיון תת-אוכלוסיות יקוציט במודלים של חולף או קבוע מוחין איסכמיה

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Adapting Human Videofluoroscopic Swallow Study Methods to Detect and Characterize Dysphagia in Murine Disease Models

This study adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating translational dysphagia research. Successful outcomes are dependent upon three critical components: test chambers that permit self-feeding while standing unrestrained in a confined space, recipes that mask the aversive taste/odor of commercially-available oral contrast agents, and a step-by-step test protocol that permits quantification of swallow physiology. Elimination of one or more of these components will have a detrimental impact on the study results. Moreover, the energy level capability of the fluoroscopy system will determine which swallow parameters can be investigated. Most research centers have high energy fluoroscopes designed for use with people and larger animals, which results in exceptionally poor image quality when testing mice and other small rodents. Despite this limitation, we have identified seven VFSS parameters that are consistently quantifiable in mice when using a high energy fluoroscope in combination with the new murine VFSS protocol. We recently obtained a low energy fluoroscopy system with exceptionally high imaging resolution and magnification capabilities that was designed for use with mice and other small rodents. Preliminary work using this new system, in combination with the new murine VFSS protocol, has identified 13 swallow parameters that are consistently quantifiable in mice, which is nearly double the number obtained using conventional (i.e., high energy) fluoroscopes. Identification of additional swallow parameters is expected as we optimize the capabilities of this new system. Results thus far demonstrate the utility of using a low energy fluoroscopy system to detect and quantify subtle changes in swallow physiology that may otherwise be overlooked when using high energy fluoroscopes to investigate murine disease models.

This study successfully adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating translational dysphagia research.

התאמת שיטות סנונית Videofluoroscopic אדם מחקר כדי לזהות ולאפיין בליעה במודלי Murine מחלות

This study adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating ...

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective mining of the information in the large-scale datasets that are obtained from gene expression microarrays, deep sequencing experiments or metabolic profiling is essential to uncover and then effectively target the critical regulators of diseased cell phenotypes. Estrogen Receptor &#945; (ER&#945;) is one of the master transcription factors regulating the gene programs that are important for estrogen responsive breast cancers. In order to understand to role of ER&#945; signaling in breast cancer metabolism we utilized transcriptomic, cistromic and metabolomic data from MCF-7 cells treated with estradiol. In this report we described generation of samples for RNA-Seq, ChIP-Seq and metabolomics experiments and the integrative computational analysis of the obtained data. This approach is useful in delineating novel molecular mechanisms and gene regulatory circuits that are regulated by a particular transcription factor which impacts metabolism of normal or diseased cells.

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

ביולוגית מערכות ויסות חילוף חומרים על ידי איתות קולטן אסטרוגן לסרטן השד

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

תפוקה גבוהה, Multiplexed וממוקדת proteomic CSF Assay לכמת Biomarkers ניווניות ו אפוליפופרוטאין E isoforms סטטוס

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include well-validated targets for therapeutic intervention. Discovery of lead compounds, including small synthetic molecules, that specifically inhibit the receptor&#39;s function, is an important initial step in drug development and relies on sensitive, specific, and robust cell-based assays. Here, we describe a kinetic cellular assay with a fluorescent readout primarily designed to identify receptor-specific antagonists that inhibit the intracellular Ca2+ release evoked upon the activation of the CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) by its endogenous ligand, the CXC chemokine ligand 12 (CXCL12). A key advantage of this method is that it also enables screening of compounds endowed with intrinsic agonistic properties (i.e., compounds eliciting an increase in intracellular Ca2+ concentration in the absence of CXCL12) or compounds modulating the receptor&#39;s function via interaction with allosteric binding sites (i.e., positive and negative allosteric modulators (PAMs and NAMs, respectively)). On the down side, autofluorescent compounds might interfere with the assay&#39;s readout, thereby hampering reliable data interpretation. Most likely this assay can be implemented, with minimal adaptations, as a generic drug discovery assay for many other GPCRs of which the activation leads to a release of intracellular Ca2+.

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

The described cellular assay is designed for the identification of CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interacting agents that inhibit or stimulate, either competitively or allosterically, the intracellular Ca2+ release initiated by CXCR4 activation.

קינטי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית Ca2 + גיוס Assay לזהות את G-חלבון בשילוב קולטן אגוניסטים היריבים, מאפננים Allosteric

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

אפיון של תאים חיסוניים בתוך רקמת שומן אנושי באמצעות Cytometry זרימה

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

וזמינותו מבוססי Cytometry זרימה מודדים פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי של תאי שריר הלב לאחר היפוקסיה/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

תפוקה גבוהה התווית על-ידי Nitrobenzoxadiazole כולסטרול בזרימת Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. However, a specific immunoglobulin E (IgE) measurement system with a high price-performance ratio is lacking in mainland China, especially in the primary care hospitals. This paper describes the principle and operation procedures of using a microfluidic cartridge-based chemiluminescence system to detect allergen-specific IgE in serum. The results were compared with those from ImmunoCAP (System 1), the industrial standard, and the reproducibility of the system to detect patients sensitized to common allergens is evaluated. The results showed that in comparison with ImmunoCAP (System 1), the BioIC System (System 2) has good precision and sensitivity in detecting serum-specific IgE against various inhalant and food allergens but with a significantly lower cost. It can serve as a good alternative to System 1 in primary care hospitals in mainland China who have lower financial affordability.

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E sIgE

This paper presents a protocol for detecting serum-specific immunoglobulin E with a microfluidic cartridge-based chemiluminescence system and the evaluation of its usefulness in allergy diagnoses.

יישום של טכנולוגיה Microfluidic ביו-שבב על סרום לזהות אלרגן ספציפיים אימונוגלובולין E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. ...