本研究の一部は全米科学財団（NSF 1227359）、国立科学財団（EPS-1003907）、それぞれ国立科学財団（1007978）、およびWVU PSCoR、主催WVUのADVANCEオフィスによって資金を供給WVU EPSCoRプログラムによってサポートされていました。微細加工作業はWVU共用研究設備（クリーンルーム施設）とウェストバージニア大学のチップ研究所（マイクロチップラボ）でマイクロ流体統合セルラー研究で行われていた。共焦点イメージングは​​WVU顕微鏡イメージング施設で行われた。

1。フォトレジストマスターモールドのフォトリソグラフィ作製次のプロトコルは30-60ミクロンの直径とマイクロチャネルを作製するためのプロセスを示しています。小径（30μm未満）とマイクロチャネルを取得するには、フォトレジストのシングルスピンコーティングが必要とされている。 <ol><li>使用前に24時間クリーンルームに4℃で冷蔵庫からリフローフォトレジストを転送し、室温まで昇温することができます。 </li><li>シリコンウェハをきれいにし、それを脱水できるように150℃で1時間のためにそれを焼く。脱水は、シリコン基板上にフォトレジストの密着性を支援する。 </li><li>スピンコート次のレシピを使用してフォトレジストの第一層： </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 手順 </td><td> 時間（秒） </td><td> 回転数（rpm） </td><td> 加速 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 &lt;/ TD&gt; <td> 300 </td><td>最高</td></tr><tr><td> 2 </td><td> 10 </td><td> 0 </td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 300 </td><td>最高</td></tr><tr><td> 4 </td><td> 60 </td><td> 600 </td><td>最高</td></tr><tr><td> 5 </td><td> 10 </td><td> 500 </td><td>最高</td></tr><tr><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 600 </td><td>最高</td></tr></tbody></table><ol start="4"><li>その後、90秒110°Cの温度にホットプレート上でウェーハを焼く。ソフトベーク後のフォトレジストの厚さは20〜30程度になります。 </li><li>コー​​トの第一層に使用されるのと同じレシピに続く第2のフォトレジスト層をスピン。 </li><li>ソフトベーク90秒110°Cの温度にホットプレートの上に置くことによって、再びウェハ。このソフトベーク後のフォトレジストの厚さは40〜60程度になります。 </li><li> photor露光することによって正のマスターパターンを生成フィルムマスクを介し14,500 mJの個/ cm 2の露光量でUV光にesist。 </li><li>脱イオン（DI）水（1:2（v / v）の）で現像剤を希釈する。パターンが完全に開発されるまで、溶液中で繰り返しウエハを洗浄します。次いでDI水でウエハーを洗浄し、窒素ガスを用いて乾燥させる。 </li><li>リフロー：4分と溶媒の蒸発を防ぐために、ガラスのペトリ皿とカバーのため120°Cの温度にホットプレートの上に置き、ウェハを。ホットプレートからウェハを取り出し、それを室温まで冷却することができます。リフロー後のフォトレジストの厚さは50〜60程度になります。 </li></ol> 2。 PDMSマイクロチャネルネットワークのソフトリソグラフィーの作製<ol><li> 10:1の重量比（ベース：硬化剤）で、ポリジメチルシロキサン（PDMS）溶液を調製し、それを徹底的に自転·公転ミキサーを使って混ぜる。 </li><li>リフローされたフォトレジストマスターモールド上にPDMSソリューションをキャスト。ドガに15分間デシケーター中でキャストPDMSを置き。必要に応じて残りの気泡を除去するために窒素ガスを使用してください。 </li><li>それを治すために可能にするために3時間60°Cの温度でオーブンでPDMSを焼く。その後、マスターモールドから硬化PDMS層を除去。 </li><li>チャネルネットワークに穴をパンチすることにより入口/出口の穴を作成するために削っパンチャーを使用します。窒素ガスを用いたPDMSの表面を清掃してください。 </li><li> 4.5×10 -2トルの動作圧力でのプラズマクリーナーおよび3.5立方フィート /分の酸素流量内側に30秒間酸素プラズマを持つ2つのPDMS層を扱う。その後、光学顕微鏡下で手動でPDMSの表面を合わせます。アライメントのよりよい制御のために必要に応じて水を一滴も使用します。 </li><li>永久的な結合を実現するために30分間60℃のオーブンでデバイスを焼く。 </li></ol> 3。チップでHUVEC文化と種まき<ol><li>培養はL-グルタミンを有する培養培地でHUVECを、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した。目のために2〜5の電子実験通路を使用した。 </li><li> HUVECをが合流したら、37℃で2-6分間細胞をカウントし、最初のHEPESは（HEPES-BSS）緩衝生理食塩水で細胞を洗浄することによって、それらを収穫した後、トリプシン/ EDTAとインキュベートで細胞を扱うトリプシン処理が完了した後、トリプシン溶液で中和トリプシン/ EDTAを中和する。遠心分離し、それらを収集するために8％のデキストランを培養培地で細胞を懸濁する。デキストランは、良好な細胞播種や添付ファイルを助けるために媒体の粘度を増加させるために使用した。 </li><li> 5 4.5×10 -2トルの動作圧力とminと3.5の酸素流量フィート3 /分酸素プラズマでデバイスを扱う。その後、DI水でデバイスをロードし、殺菌のために層流バイオセーフティーフード内で8時間紫外線を扱う。 </li><li>細胞は準備ができて一日前に、1×リン酸塩を使用してデバイスを洗うフィブロネクチン（は100μg/ mlの、希でコート後、（1×PBS）緩衝生理食塩水1×PBSで貢献しました）、4℃で一晩冷蔵庫でインキュベート。 </li><li>フィブロネクチンコーティングした後、培養液でロードし1×PBSでデバイスを洗う。 15分間37℃の温度でデバイスをインキュベートする。 </li><li> 3-4×10 6細胞/ mlの細胞濃度を8％デキストラン培地でHUVEC細胞をロードする。デバイスの一つの入口で細胞20μlの液滴を置き、マイクロ流体チャネルに細胞を導入することを傾ける。 15-20分後、細胞は、チャネルの側壁に付着するために開始されます。デバイスの細胞のより均一な分布を作成するために15分毎に回転させます。必要に応じて、追加のローディングを行うことができる。 </li></ol> 4。長期灌流セットアップ静置培養の5-6時間後、添付されたHUVECを、完全に広げ始めます。 10μlの/時の定常流とリモコンシリンジポンプシステムを用いた灌流を設定します。灌流をfを調整することができる以上の流量、及び2週間〜4日の間の期間続くことができます。 5。細胞染色と顕微鏡の特性<ol><li>細胞はデバイス内部合流に到達すると、まず、徹底的にメディアを削除するには、1×PBSでデバイスを洗う。その後、希釈剤（4μL-1 ml）で希釈した赤色染料を使用してデバイスをロードします。セルローディング手順と同様の染料をロードします。室温で5分間、暗所で装置をインキュベートした後、染色を停止する培養液で装置を洗浄する。染料の長いインキュベーションは、細胞毒性とdisadhesionを引き起こす可能性があります。 </li><li> 1×PBS（1mL当たり2滴）で希釈し、青色色素をデバイスにロードします。室温で5分間、暗所でインキュベートし、その後完全に1×PBSで装置を洗浄する。 </li><li>倒立光学顕微鏡下で細胞染色を調べます。染色が良好であった場合は、（1×PBSで希釈した3.5％パラホルムアルデヒド）固定培地でマイクロチャネルをロード、その後水没培地と完全にアルミホイルでそれをカバーを固定でデバイス。 4℃の温度で冷蔵庫でデバイスを保管℃で乾燥し、退色からデバイスを防ぐことができます。固定デバイスは共焦点レーザ走査型顕微鏡によって行うことができる共焦点イメージングのための準備ができている。 </li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

<html> 1。マスターモールドの製造血管の形態計測のために設計し、指針の一つは、ネットワーク全体に血管径の分布は最小エネルギー配慮によって支配されていることを述べているマレーの法則16、として知られています。また、分岐で親血管の直径のキューブが娘血管の直径の立方体の和に等しいと述べている（ <img alt="式（1）" fo:content-width="0.9in" fo:src="/files/ftp_up...

循環系の一部として微小血管は、血液や組織の間の相互作用を媒介する、代謝活動を支援し、組織微小環境を定義し、多くの健康および病理学的条件において重要な役割を果たす。 in vitroでの機能的な微小血管の要約は、複雑な血管現象の研究のためのプラットフォームを提供することができます。しかしながら、このような内皮細胞の遊走アッセイ、内皮管形成アッセイ、およびラットおよびマウス大動脈輪アッセイなどのインビトロ微小血管アッセイ、従来の三次元（3D）ジオメトリおよび連続フロー制御に対してインビボ微小血管に再現することができない1-8。このような角膜血管新生アッセイ、ニワトリ絨毛尿膜血管新生アッセイ、およびマトリゲルプラグアッセイなどの動物モデルおよびin vivoアッセイを使用して、微小血管の研究は、多くの時間がかかり、コストが高く、観察や数量化に関して挑戦、および倫理的な問題1、9-13を上げる。 持っていないでしょうな、簡単かつ厳密に制御生物学的条件と動的流体環境などの研究14、、動物とし、 生体内での関連する高い実験的なコストと複雑さを節減しながらmicromanufacturingとマイクロ流体チップ技術の進歩は、生物医学科学の洞察の様々を有効にしている従来のマクロスケールの技術で可能であっ。 ここでは、 生体内微小血管内の3Dジオメトリを模倣し、フォトリソグラフィリフローフォトレジスト技術、ソフトリソグラフィー、マイクロフルイディクスとの組み合わせを使用して管理された連続的な灌流の流れの下で実行され内皮マイクロチャネルオンチップを構築するためのアプローチを提示する。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflow Photoresist</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>AZP4620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>AZ 400K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 131 Culture Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NacBlue Nuclei Staining</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH Red Stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MINI26 and PKH26GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHE0023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffered Saline Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizing Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Curing Agent</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diluent C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CGLDIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>BelArt Products</td>
			<td>999320237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump System</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD Ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Biosafety Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary Centrifugal Mixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-246-516GAQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Invertoskop 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne Cimarec</td>
			<td>SP131635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure for the development of multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip

インビボでの動物実験は、より時間がかかり、高価であり、観察および定量は非常に挑戦的であるための努力が微小血管の研究のためのin vitroアッセイの開発に焦点を当ててきた。 3次元（3D）ジオメトリに対してインビボ微小血管に表現し、連続的な流体の流れを提供する場合しかし、微小血管ビトロアッセイにおける従来は限界がある。フォトリソグラフィリフローフォトレジスト技術、ソフトリソグラフィー、マイクロフルイディクスとの組み合わせを使用して、我々は管理された連続灌流下で生体内微小血管および実行中の3Dジオメトリを模倣マルチ深円形の断面内皮マイクロチャネルオンチップを開発した流れ。ポジティブフォトレジストをリフロー半円形の断面マイクロチャンネルネットワークにマスターモールドを作製した。 replを2ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロチャネルの整列及び接合によるマスター型からicated、円筒マイクロネットワークが作成されました。マイクロチャネルの直径は十分に制御することができる。また、チップ内部で播種し、一次ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）は、細胞は4日〜2週間の間の時間期間の持続的な制御の下で灌流マイクロチャンネルの内面を内張りすることを示した。

マルチデプスマイクロチャネルネットワークを製造する当社のアプローチは、マイクロチャネルは、クロスセクション15を丸めていた、 生体内微小血管内の複雑な3D形状を模倣しています。さらに、チャネルと娘チャネルを分岐親の直径はおよそ全体のチャネル抵抗が低く、流動速度がネットワーク16-18全体より均一であるように要求されるレベルで流体の流れ?...

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Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

マイクロチャネル·オン·チップ·プラットフォームは、フォトリソグラフィリフローフォトレジスト技術、ソフトリソグラフィー、マイクロフルイディクスとの組み合わせによって開発されました。内皮マイクロチャネルプラットフォームは、 インビボにおける微小血管の3次元（3D）ジオメトリを模倣する制御された連続かん流の流れの下で実行され、高品質かつリアルタイムイメージングを可能にし、微小血管の研究に適用することができる。

マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

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13.8K ビュー.  West Virginia University. マイクロチャネル·オン·チップ·プラットフォームは、フォトリソグラフィリフローフォトレジスト技術、ソフトリソグラフィー、マイクロフルイディクスとの組み合わせによって開発されました。内皮マイクロチャネルプラットフォームは、 インビボにおける微小血管の3次元（3D）ジオメトリを模倣する制御された連続かん流の流れの下で実行?...