Bu araştırma kısmen Ulusal Bilim Vakfı (NSF 1.227.359), sırasıyla Ulusal Bilim Vakfı (EPS-1.003.907), Ulusal Bilim Vakfı (1.007.978) tarafından desteklenen WVU ADVANCE ofis ve WVU PSCoR tarafından finanse WVU EPSCoR programı, tarafından desteklenmiştir. Mikroimalat iş WVU Ortak Araştırma Olanakları (Temiz oda tesisleri) ve Batı Virginia Üniversitesi Chip Laboratuvarı (mikroçip Lab) üzerinde mikroakışkan Bütünleştirici Hücresel Araştırma yapıldı. Konfokal görüntüleme WVU Mikroskop Görüntüleme Tesisleri&#39;nde yapıldı.

1. Fotorezist Usta Kalıp Fotolitografi Fabrikasyon Aşağıdaki protokol, 30-60 mikron arasında çaplara sahip mikro imal etmek için işlemleri gösterir. Daha küçük bir çapı (en az 30 mikron), çeliğin tek bir spin kaplama olan bir mikrokanal elde etmek için gereklidir. <ol><li> Kullanmadan önce temiz oda, 24 saat için 4 ° C sıcaklıkta buzdolabında gelen yeniden akış fotorezist aktarın ve bu sırada oda sıcaklığına ısınmasına izin verir. </li><li> Bir silikon yonga temiz ve kurutmak için izin vermek için 150 ° C de bir saat boyunca pişirin. Dehidrasyon silikon substrat için ışığa yapışma yardımcı olacaktır. </li><li> Spin-kat fotorezist ilk katman aşağıdaki tarifi kullanarak: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Adım </td><td> Zaman (Saniye) </td><td> Hız (rpm) </td><td> Hızlanma </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 &lt;/ Td&gt; <td> 300 </td><td> en yüksek </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 10 </td><td> 0 </td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 300 </td><td> en yüksek </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 60 </td><td> 600 </td><td> en yüksek </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 10 </td><td> 500 </td><td> en yüksek </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 600 </td><td> en yüksek </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> Daha sonra, 90 saniye boyunca 110 ° C arasında bir sıcaklığa sahip bir ocak gofret fırında. Yumuşak fırında sonra ışığa kalınlığı 20-30 mikron olacaktır. </li><li> Kat ilk kat için kullanılan aynı tarifi takip ışığa bir ikinci kat Spin. </li><li> Yumuşak fırında 90 saniye 110 ° C lik bir sıcaklık ile bir ocak üzerine yerleştirerek tekrar gofret. Bu yumuşak fırında sonra ışığa kalınlığı 40-60 mikron olacaktır. </li><li> PhotoR açarak olumlu ana desenleri oluşturmakbir film maske ile 14.500 mJ / cm 2 bir maruz kalma doz UV ışığına esist. </li><li> Deiyonize (Dİ) su (01:02 (v / v)) ile geliştirici seyreltin. Desen tam gelişmiş kadar çözümünde tekrar tekrar gofret durulayın. Daha sonra DI su ile gofret yıkayın ve azot gazı kullanarak kurulayın. </li><li> Reflow: 4 dakika ve solvent buharlaşmasını önlemek için bir cam Petri kabı ile kapak için 120 ° C lik bir sıcaklık ile bir ocak yeri gofret. Ocak gelen gofret çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Reflow sonra ışığa kalınlığı 50-60 mikron olacaktır. </li></ol> 2. PDMS Mikrokanal Ağ Yumuşak Litografi Fabrikasyon <ol><li> 10:1 ağırlık oranı (baz: sertleştirici) de polidimetilsiloksan (PDMS) çözeltisi hazırlayın ve bir gezegen santrifüj mikser kullanarak iyice karıştırın. </li><li> Yeniden akıtılan çeliğin ana kalıp üzerine PDMS çözüm Cast. Gazdan arındırmak için 15 dakika boyunca bir desikatör içinde döküm PDMS yerleştirin. Gerekirse kalan kabarcıklarını çıkarmak için azot gazı kullanın. </li><li> Bunun tedavisi için izin vermek için, 3 saat boyunca 60 ° C arasında bir sıcaklıkta bir fırında PDMS pişirilir. Daha sonra ana kalıp tedavi PDMS katmanı kaldırmak. </li><li> Kanal ağı delik delme tarafından giriş / çıkış delikleri oluşturmak için bilenmiş zımba kullanın. Azot gazı kullanarak PDMS yüzeyini temizlemek. </li><li> 4,5 x 10 -2 Torr ve 3,5 m 3 / dk oksijen akış hızı bir çalışma basıncında bir plazma temizleyici içinde 30 saniye oksijen plazma ile iki PDMS katmanları davranın. Daha sonra, bir optik mikroskop altında elle PDMS yüzeyleri hizalayın. Bir damla su hizalama daha iyi bir kontrolü için gerekli kullanın. </li><li> 60 ° C de sürekli yapışma elde etmek için 30 dakika boyunca bir fırında pişirmeye cihaz. </li></ol> 3. Chip içinde HUVEC Kültür ve Yayımlama <ol><li> Kültür L-glutamin ile kültür ortamı ile HUVEC&#39;ler,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş. Th2 ile 5 arasında e deney pasajlar kullanılmıştır. </li><li> HUVEC&#39;lere birleşik bir kez, 37 ° C de 2-6 dakika hücreleri saymak ve ilk HEPES (HEPES-BSS) serum fizyolojik tamponlu ile hücreleri durulama bunları hasat ve sonra tripsin / EDTA ve inkübe ile hücrelerin tedavi Tripsinizasyon tamamlandıktan sonra, Tripsin çözeltisi ile nötralize tripsin / EDTA ile etkisiz hale getirir. Santrifüj ve toplamak için 8% dekstran ile kültür ortamı içinde hücre askıya. Dekstran iyi hücre tohumlama ve ek yardımcı olması için orta viskositesini artırmak için kullanılmıştır. </li><li> 5 4,5 x 10 -2 Torr bir çalışma basıncı ile dakika ve 3.5 bir oksijen akış hızı ft 3 / dk oksijen plazma cihazı tedavi. Daha sonra DI su ile cihaz yük ve sterilizasyon için bir laminer biyogüvenlik kaput 8 saat UV ışığı ile tedavi. </li><li> Hücrelerin hazır bir gün önce, 1x fosfat ile cihaz yıkayın fibronektin (100 mg / ml, dil ile kat sonra (1x PBS) tamponlu salin1X PBS ile uted) ve 4 ° C&#39;de bir gece boyunca buzdolabında inkübe edin. </li><li> Fibronektin kaplama sonra, 1x PBS sonra kültür ortamı ile yük cihazı yıkayın. 15 dakika boyunca 37 ° C arasında bir sıcaklıkta, cihaz inkübe edin. </li><li> 3-4 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir hücre konsantrasyonu ile% 8 dekstran kültür ortamı içinde HUVEC hücreleri yerleştirin. Cihazın bir girişine bir hücre 20 ul damlacık yerleştirin ve mikroakışkan kanal içine hücreleri tanıtmak için eğilme. 15-20 dakika sonra, hücreler kanallarının yan duvarlara bağlamak için başlayacaktır. Cihaz hücreleri daha homojen bir dağılım oluşturmak için her 15 dakika döndürün. Gerekirse ek yükleme yapılabilir. </li></ol> 4. Uzun vadeli Perfüzyon Kurulum Statik kültür 5-6 saat sonra, ekli HUVEC&#39;lere tam yaymak başlar. 10 ul / saat sürekli bir akış ile bir uzaktan kumandalı şırınga pompası sistemini kullanarak perfüzyon kurun. Perfüzyon F ayarlanabilirya da daha yüksek bir akış hızı, ve 2 hafta ile 4 gün arasında bir süre sürebilir. 5. Hücre Boyama ve Mikroskop Karakterizasyonu <ol><li> Hücre, cihazın içindeki birleştiği ulaştığında, ilk olarak, iyice ortam maddesinin ayrılması için 1X PBS ile yıkayın cihaz. Daha sonra bir seyreltici (4-ul, 1 ml) ile seyreltildi, kırmızı bir boya ile, cihazın yük. Hücre yükleme prosedürüne benzer boya yükleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karanlıkta inkübe cihazı ve daha sonra boyama durdurmak için kültür ortamı ile yıkayın cihaz. Boya uzun bir kuluçka hücresel toksisite ve disadhesion neden olabilir. </li><li> 1x PBS (ml başına 2 damlacıkları) ile seyreltilmiş mavi boya ile aracı yükleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karanlıkta inkübe sonra iyice 1X PBS ile yıkayın cihaz. </li><li> Ters bir optik mikroskop altında hücre boyama inceleyin. Boyama iyi ise, (1x PBS ile sulandırılmış% 3.5 paraformaldehid) sabitleme orta mikro yük, daha sonra batığınorta ve tamamen alüminyum folyo ile örtün sabitleme cihazı. 4 arasındaki bir sıcaklıkta buzdolabında cihazını ° C&#39;de kurutarak Photobleaching cihazın önlemek için. Sabit cihaz şimdi konfokal mikroskop bir lazer tarama yapılabilir konfokal görüntüleme, hazır. </li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

<html> 1. Ana kalıp imalat Vasküler morfometri için tasarımı ve yol gösterici ilkelerinden biri ağ boyunca damar çapları dağılımının minimum enerji dikkate tarafından yönetilir belirten Murray yasası 16, olarak bilinir. Ayrıca bir çatallanma bir ana geminin çaplarının küp kızı gemilerin çapları küp toplamına eşittir belirtiyor ( <img alt="Denklem 1" fo:content-width="0.9in" fo:src="/files/ftp_upload/50771/50771eq1.jpg" src="/files/ftp_upload/50771/50771eq...

Mikrodamarlar, dolaşım sisteminin bir parçası olarak, kan ve dokular arasındaki etkileşimi aracılık metabolik faaliyetlerini desteklemek, doku mikro tanımlamak, ve birçok sağlık ve patolojik durumlarda önemli bir rol oynamaktadır. In vitro fonksiyonel mikrodamarlar tekrarlama kompleks vasküler olayların çalışma için bir platform sağlayabilir. Ancak, bu tür endotelyal hücre göçü deneyleri, endotel tüp oluşumu deneyleri, sıçan ve fare aort halkası tahlilleri gibi in vitro mikro-damar deneyleri, geleneksel üç boyutlu (3D) geometrisi ve sürekli bir akış kontrolü ile ilgili olarak, in vivo olarak yeniden kılcal mümkün değildir 1-8. Hayvan modelleri ve bu kornea anjiojen deneyleri, civciv chorioallantoic membran anjiyogenez tahlil ve Matrigel fiş test olarak in vivo deneyleri,, kullanarak mikrodamarlar çalışmaları daha, zaman alıcı maliyeti yüksek, gözlem ve sayımsal ile ilgili zorlu ve olanetik konular 1, 9-13 yükseltmek. Olmazdı böyle kolay ve sıkı kontrol biyolojik koşulları ve dinamik akışkan ortamlar olarak çalışmaları 14, hayvanlarla ve in vivo ilgili yüksek deneysel maliyetleri ve karmaşıklığı yavaşlatmada ise micromanufacturing ve mikroakışkan çip teknolojileri gelişmeler biyomedikal bilimler bakış açıları çeşitli etkin geleneksel makro tekniklerle mümkün. Burada, bir endothelialized oluşturmak için bir yaklaşım mevcut mikro--a-chip in vivo mikrodamarlar içinde 3 boyutlu geometri taklit ve fotolitografik reflowable ışığa tekniği, yumuşak litografi ve Mikroakiskan kombinasyonu kullanarak kontrollü sürekli perfüzyon akış altında çalışır.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflow Photoresist</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>AZP4620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>AZ 400K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 131 Culture Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NacBlue Nuclei Staining</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH Red Stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MINI26 and PKH26GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHE0023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffered Saline Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizing Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Curing Agent</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diluent C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CGLDIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>BelArt Products</td>
			<td>999320237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump System</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD Ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Biosafety Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary Centrifugal Mixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-246-516GAQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Invertoskop 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne Cimarec</td>
			<td>SP131635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure for the development of multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip

In vivo hayvan çalışmaları daha zaman alıcı, pahalı ve gözlem ve miktar çok zor olduğu, çünkü çabaları mikrodamarlar çalışma için in vitro tayinlerde geliştirmeye odaklanmıştır. Üç boyutlu (3D) geometrisi ile ilgili in vivo kılcal temsil eden ve sürekli sıvı akışı sağlayan Ancak, in vitro mikro-damar tahlillerde geleneksel sınırlamaları vardır. Fotolitografik reflowable fotorezist tekniği, yumuşak litografi ve Mikroakiskan bir arada kullanarak, bir çok derinlemesine dairesel kesit endothelialized geliştirdik kontrollü sürekli perfüzyon altında in vivo mikrodamarlar içinde 3 boyutlu geometri taklit ve çalışan, mikro--a-chip akış. Pozitif reflowable ışığa yarım daire kesit Mikrokanallı ağı ile bir ana kalıp imal etmek kullanıldı. Repl iki polidimetilsiloksan (PDMS) mikro uyum ve yapıştırma tarafındanana kalıp gili, silindirik bir Mikrokanallı ağ oluşturuldu. Mikrokanalların çapları iyi kontrol edilebilir. Buna ek olarak, bir çip içerisinde tohumlanmıştır Primer insan göbek bağı damarı endotel hücrelerinin (HUVEC&#39;ler) sonra hücreler, 4 gün ile 2 hafta arasında bir süre boyunca sürekli olarak kontrol edilen perfüzyon altında mikro iç yüzeyi kaplı olduğunu gösterdi.

Çok derinlemesine Mikrokanallı ağ imal yaklaşımımız mikro kesitler 15 yuvarlak var olduğu, in vivo mikrodamarlar içinde karmaşık 3D geometrileri taklit eder. Ayrıca, ana dallanma kanallarının çapları ve kızı kanalları yaklaşık genel kanal direnci düşüktür ve akım hızları ağ 16-18 boyunca daha düzgün böylece gerekli düzeyde sıvı akışı korumak için Murray yasası uyun. Yarım daire şeklinde bir fotorezist ana kalıp, imalat ve dairesel bir yar...

Watch this Scientific Journal Video about Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip at JoVE.com

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Bir mikro-on-a-chip platformu fotolitografik reflowable ışığa tekniği, yumuşak litografi ve Mikroakiskan kombinasyonu tarafından geliştirilmiştir. Endothelialized mikro platformu, in vivo mikrodamar içinde üç boyutlu (3D) geometrisi ile taklit eden sürekli perfüzyon kontrollü akış altında çalışan, yüksek kaliteli ve gerçek zamanlı görüntü sağlar ve mikrovasküler araştırma için uygulanabilir.

Çok derinlemesine Dairesel kesit Endothelialized mikro kanallar-on-a-chip Geliştirme Prosedürü

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

procedure-for-development-multi-depth-circular-cross-sectional

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.8K Görüntüleme.  West Virginia University.  Bir mikro-on-a-chip platformu fotolitografik reflowable ışığa tekniği, yumuşak litografi ve Mikroakiskan kombinasyonu tarafından geliştirilmiştir. Endothelialized mikro platformu, in vivo mikrodamar içinde üç boyutlu (3D) geometrisi ile taklit eden sürekli perfüzyon kontrollü akış altında çalışan, yüksek kaliteli ve gerçek zamanlı görüntü sağlar ve mikrovasküler araştırma için uygulanabilir. 