이 작품은 NIH 그랜트 NS065183 및 러트 거스 로버트 우드 존슨 의과 대학에서 창업 자금을 지원합니다.

1. 에어컨 미디어 및 성상 세포 신경 세포 공 배양에 쥐 성상 세포 문화를 준비합니다. <ol><li> (BSS 레시피 표 1 참조) 해부 버퍼를 준비하고 4 ° C에서 보관 사용 준비가 될 때까지. </li><li> 500 ㎖ 비이커에 이소 플루 란과 신생아 쥐 새끼 (P0-P2)를 마취. </li><li> 강아지가 움직 인 경우, 70 % 에탄올로 스프레이 목을 베다. </li><li> 뇌를 제거합니다. <ol><li> 뒤몽 # 5 포셉 한 쌍의 단단히 머리를 잡아, 피부와 두개골을 통해 중간 선 절개를 만들기 위해 미세 가위를 사용합니다. </li><li> 측면에 두개골을 반영하여 뇌를 노출, 차가운 BSS를 포함하는 접시에 두뇌를 제거합니다. </li></ol></li><li> 해부 범위에서 간뇌와 뇌간에서 대뇌 반구를 분리합니다. 조심스럽게 집게 일쌍과 조직을 안정화하고 부드럽게 포셉의 다른 쌍의 수막을 떼어 모든 수막을 제거합니다. </li><li> 모든 반구를 수집 IN 개의 60mm 접시. 작은 가위, 다진 조직과 같은 미세 가능한 한 사용. 그런 다음 50 ML 원뿔 튜브에 다진 조직을 전송합니다. </li><li> 1.5 1 % DNA 분해 효소 I ㎖ 및 1.5 ㎖의 2.5 % 트립신과 두뇌에 BSS (15ML의 총 부피)의 12 ML을 추가합니다. 37 ℃에서 15 분 동안 진탕 수조에서 부화 좋은 혼합을 보장하기 위해, 튜브는 손으로 5 분마다 소용돌이된다. </li><li> 새로운 50 ML 원뿔 관에 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 뜨는을 전송합니다. 이 상층에 3 ㎖의 FBS를 추가합니다. </li><li> 나머지 조각, 13.5 BSS ㎖ 및 1.5 ㎖의 2.5 % 트립신을 추가하고 또 다른 15 분 동안 진탕 수조에서 배양한다. </li><li> 셀 스트레이너를 통해 나머지 뜨는을 전송하고 단계 1.8에서 뜨는 결합. </li><li> 펠릿 세포 5 분 1,000 RPM에서 원심 분리기. </li><li> 아교 미디어 5 ㎖에 재현 탁 펠렛. 상청액 나머지 세포 펠렛을 다시 원심 분리 할 수​​있다. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. </li><li> 플레이트 CEL1 × 10 7 150cm 당 2 플라스크의 밀도로 LS. </li><li> 하루 도금 후 신선한 아교 미디어에 미디어를 변경합니다. 그 후, 아교 미디어 일주일에 두 번 세포를 공급. </li><li> 세포가&gt; 80 % 컨 플루 (약 십일 도금 후)에 도달했을 때, 90 % 말 혈청과 10 % DMSO에서 세포를 동결 액체 질소에 주식을 계속. 세포는 2 바이알 당 X 10 6 동결됩니다. 약 5 병 각 플라스크에서 고정 할 수 있습니다. </li><li> 대략 10-14 일 해마 문화를 설정하기 전에, glial 세포는 냉동 주식에서 도금된다. 우리는 일반적으로 해마 신경 세포의 90 커버 슬립 (물론 당 세 개의 15mm 라운드 커버 슬립)의 성장을 지원하기에 충분하다 다섯 6 - 웰 플레이트를, 접시. 우리는 또한 형질에 대한 조절 N2.1 매체에 사용되는 glial 세포의 추가 8 ~ 10 60mm의 요리를 접시. 하루는 신경 세포의 배양하기 전에, 세포 NB27 미디어가 공급되어야한다. 성상 세포는 이상적 일에서&gt; 90 % 합류해야한다지점입니다. 우리는 크게 동결하면 astroglial 문화에서 미세 아교 세포의 수를 줄일 것을 찾을 수 있습니다. 미세 아교 세포가 astroglial 문화에 존재하는 경우 증가 된 신경 독성이 관찰되기 때문에, 우리는 항상 신경 세포와 공 배양 냉동 주식에서 준비 astroglial 문화를 사용합니다. </li></ol> 2. 신경 세포 문화 <ol><li> 를 MilliQ 물 2 배 첫 번째 린스로 청소 유리 커버 슬립. 그 후, 2 시간의 전체에 걸쳐 적어도 5 회 24 시간 동안 진한 질산에 침지하고을 MilliQ 물 세정된다. coverslips는 6 시간 동안 225 ° C의 오븐에 굽고 건조 및 살균된다. </li><li> 전송 멸균 60mm 요리에 커버 슬립. 신경 세포 공 배양시 glial 세포에서 분리 유지하기 위해 각 coverslip에의 외부 가장자리 근처에 멸균 파라핀의 네 점을 놓습니다. </li><li> 37 ° C 배양기에서 하룻밤 0.1 M 붕산 버퍼 / ㎖ 폴리-L-라이신 1 MG와 코트 커버 슬립. </li><li> 다음 날, 멸균 m에 두 번 coverslips를 씻어적어도 15 분마다 illiQ 물. 그들은 다음 37 ° C 배양기에서 도금 미디어에서 하룻밤 배양된다. </li><li> 기흉 다음에 이소 플루 란 마취에 의해 임신 한 쥐 (E18)를 안락사, 그리고 잘린 배아 쥐를 안락사. 머리를 제거하고 상기 한 바와 같이 대뇌 반구를 해부하다. </li><li> 대뇌 반구에서 해마를 해부하다. 15 ML 원뿔 튜브에 모든 해마를 놓고 15 분 동안 37 ℃에서 0.25 % 트립신 (0.5 ml의 2.5 % 트립신, 4.5 ml의 BSS)과 소화. </li><li> 소화 해마는 5 분마다 BSS 배에 씻어서. 이들은이어서 유리 파스퇴르 피펫으로 분쇄하고, 세포 밀도는 혈구 계를 사용하여 결정된다. 뉴런이어서 60mm 디쉬 당 2 × 105 세포의 밀도로 시딩 하였다. </li><li> 대략 2-4 시간 도금 후, 전송이 신경 교세포으로 아래를 향하도록, astroglial 세포를 포함하는 요리에 연결된 뉴런의 coverslips. DIV3에서에 시토신 아라 비노 시드를 추가5 μM의 최종 농도에서 세포 glia의 증식을 정지합니다. </li></ol> 3. 칼슘 형질 <ol><li> glia의 형질 전날의 조건 N2.1 미디어. </li><li> 형질의 날, 아교 오프 에어컨 N2.1 미디어를 가지고 새로운 요리로 전송할 수 있습니다. 전송 에어컨 N2.1 미디어에 뉴런의 coverslips. 10 ~ 30 분 동안 인큐베이터에서 평형을 보자. </li><li> 멸균 튜브의 한 세트로, DNA의 1-4 μg, 100 μL의 총 볼륨에 대한 2 M 염화칼슘 12.5 μL, 멸균 H 2 O를 결합. 튜브의 두 번째 세트에 2 배 HBS 100 μl를 추가합니다. </li><li> 몇 초마다 볼 텍싱, 염화칼슘 / DNA 혼합물을 포함하는 튜브에 한번에 2X HBS의 ⅛ 체적 (12.5 μL)을 추가한다. 튜브가 15 분 동안 앉아 수 있습니다. </li><li> 15 분 배양 후, 세포에 형질 감염 혼합물 적가. 1.5 시간 동안 배양한다. 모래 같은 침전물 층이 볼 수 있어야합니다10X 목표를 사용하여 현미경. </li><li> 배양 후, 따뜻한 HBS 세척 버퍼로 두 번 커버 슬립을 씻어. </li><li> , 아교와 창작 요리로 커버 슬립을 반환 0.5 mm의 최종 농도 kynurenic 산을 추가합니다. </li><li> 형질 전환 된 뉴런의 이미지를 생성하거나 이미 다음 날 같은 면역 세포에 처리 할 수​​ 있습니다. 신경 세포는 형질 전환 후 3 주까지 살아남을 수 있습니다. </li></ol>

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	<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li><li>Zeitelhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection.">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li><li>Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+delivery+of+RNAi+in+hippocampal+neurons.">Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons.</a> Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).</li><li>Graham, F. L., vander Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+adenovirus+5+DNA.">A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52, 456-467 (1973).</li><li>Craig, A. M., Banker, G. a. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+cultured+neurons.">Transfecting cultured neurons.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase.">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+synaptic+function+by+VAC14,+a+protein+that+regulates+the+phosphoinositides+PI(3,5)P(2)+and+PI(5)P.">Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P.</a> EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).</li><li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture.">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).</li><li>Goslin, K. A. H., Banker, G., Banker, G. a. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+Hippocampal+Neurons+in+Low-Density+Culture.">Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+convenient,+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons.">Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).</li><li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Ca2+-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures.">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).</li><li>Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+controlled+formation+of+a+DNA/calcium+phosphate+coprecipitate:+application+for+transfection+of+mature+hippocampal+neurons.">Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons.</a> J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

주의 깊게 지속적으로 성공적인 형질 (10, 11)에 대해 제어 할 필요가 몇 가지 주요 매개 변수가 있습니다. 칼슘 포스페이트 형질 감염에 대한 가장 중요한 매개 변수는 우리 손에 보통 7.10-7.15 사이에서 변화 2X HBS의 pH 값이다. 우리는 산도 미터 사이의 차이를 설명 할 수는 0.05 단위로 pH 값과 주식의 세 가지 배치를하는 것이 좋습니다. 또한, 클론 테크 포유류의 형질 전환 키트는 지속적으로...

차 뉴런들이 postmitotic이며 마이크로 환경 변화에 매우 민감하다 같이 트랜 어려운 세포 유형의 하나이다. 이러한 세포 1 외인성 유전자와 짧은 헤어핀 RNA를 (shRNAs)의 표현 방법의 네 가지 일반적으로 사용되는 유형이있다. 각각은 자신의 장점과 단점이 있습니다. 세포 형질 감염을위한 큐벳에 전송해야 예를 들어, 전기 천공은 일반적 갓 절연 뉴런이 수행된다. 바이러스 감염은 일반적으로 매우 높은 효율 3를 달성하지만, 더 노동 집약적 인 운영과 위험하다 할 수 있습니다. 많은 지질 매개 형질 전환 시약은 신경 세포와 세포 독성의 다른 수준에있는 성공의 학위를 변화와 함께, 상업적으로 이용 가능하다. 인산 칼슘 형질 감염은 뉴런에 외래 유전자를 도입하기위한 편리하고 경제적 인 방법을 나타낸다. 첫번째 방법은 포유 동물 CEL에 아데노 바이러스 DNA를 도입하기 위해 사용 하였다그레이엄과 반 데르 EB를 (1973)에 의해 LS 4. 형질 포스페이트 완충액에서의 재조합 DNA와 염화 칼슘을 혼합함으로써 수행되었다. 이것은 서서히 세포 단층 상에 떨어질 때 DNA / 칼슘 포스페이트의 형성은 세포 표면에 부착, 엔도 사이토 시스에 의해 다루어 최종적 핵 5를 입력되며, 이는 석출물 허용한다. 이 과정은 표적 세포에 도입 된 외래 유전자의 발현을 초래할 것이다. 0.5-5 % 6-8 사이 인산 칼슘 형질 범위의 전형적인 효율성. 그러나, 조심 최적화 실험 프로토콜의 일관된 실행을, 거의 50 %의 형질 감염 효율에 도달 할 수있다. 여기에서 우리는 샌드위치 형식 9 astroglial 세포와 공 배양하는 기본 해마 신경 세포의 칼슘 형질 전환을위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="879">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:284px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14090-09</td>
			<td>straight / sharp 8.5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Vannas-Tubinger spring scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15008-08</td>
			<td>angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Standard pattern forceps</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11000-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Student surgical scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91401-14</td>
			<td>blunt / 14.5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15006-09</td>
			<td>angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:207px;">Webster Veterinary</td>
			<td style="width:119px;">14043-225-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">100 mM Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Glucose</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">1 M HEPES, pH 7.3</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>21130-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">2.5% Trypsin</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">DNase I</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">DN-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Cytosine arabinoside</td>
			<td style="width:207px;">Calbiochem/EMD Millipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">251010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Kynurenic acid</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium phosphate transfection of primary hippocampal neurons

인산 칼슘 침전은 배양 된 세포의 형질 전환을위한 편리하고 경제적 인 방법입니다. 최적화로, 일차 뉴런 같은 어려운 형질 세포에이 방법을 사용하는 것이 가능하다. 여기에서 우리는 astroglial 세포와 공 배양 된 해마 신경 세포의 칼슘 형질 전환을위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명합니다.

형질의 다른 매개 변수를 최적화하고 신중하게 실험 실험에서 제어하는 경우, 최대 50 %의 형질 전환 효율을 얻을 수있다. 1 DIV4에 GFP 형질 전환 된 뉴런의 필드를 보여줍니다. 필드 (16)가 형​​질 전환 된 가운데 28 뉴런의 전체를 포함한다. 이것은 50 %의 효율을 나타냅니다. 동일한 커버 슬립에 다른 필드의 샘플링은 전체적인 효율 (데이터 미도시) 주변의 50 %이다. astroglia...

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Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

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25.0K 조회수.  Rutgers University.  인산 칼슘 침전은 배양 된 세포의 형질 전환을위한 편리하고 경제적 인 방법입니다. 최적화로, 일차 뉴런 같은 어려운 형질 세포에이 방법을 사용하는 것이 가능하다. 여기에서 우리는 astroglial 세포와 공 배양 된 해마 신경 세포의 칼슘 형질 전환을위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명합니다. 