מחקר זה נתמך על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 וSFB940 לSH

הערה: מידע מפורט לגבי מאגרים שצוינו בפרוטוקול נגיש בטבלה 1. 1. קיבוע של חלבונים אינטראקציות על ידי פורמלדהיד cross-linking בתאים חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל להכין את תקשורת צמיחה, פתרונות מניות וP1 החיץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 בינוני מיליליטר: הבינוני צריך לספק תנאים התומכים באינטראקציה בין חלבון פיתיון הממברנה וחלבונים טרף. בנוסף, ניסוי אחד צריכה להתבצע בתנאים בהם אין אינטראקציה צפויה (למשל ללא cross-linking). הערה: אנו משווים אינטראקציות בין חלבונים בחיידקים הדגישו ולא לחוצים. לכן, אנו מכינים 500 מיליליטר וריא Bertani בינוני (LB) (טבלת 1) שאנחנו משלימים עם סוכן וישכנע לחץ (למשל 0.5 M NaCl) בבקבוק 2 ליטר Erlenmeyer. לבקרה, אנו משתמשים במדיום LB נורמלי עם 0.17 M NaCl (pH 7.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טריס-חיץ (20 מ&quot;מ טריס-HCl; pH 8.0) ו0.1 M חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), פתרון ה-pH 8.0 המניה (טבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן P1 חיץ. ממיסים סוכרוז לריכוז סופי של 0.5 M בטריס-חיץ. לעקר P1 חיץ על ידי סינון ולאחסן אותו ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים המבטאים את חלבון פיתיון הקרום עם פיוז&#39;ן סטרפטוקוקוס תג טרמינל C-מוקטור. לגרום לביטוי של חלבוני קרום פיתיון למספיק זמן. הערה: אנו לגרום לביטוי של חלבוני פיתיון קרום חיידק בשלב מוקדם יומן (600 = 0.3) על ידי תוספת של 250 μl M 1 איזופרופיל-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) 500 מיליליטר בינוני (ריכוז סופי: 0.5 מ&quot;מ) . כדי לאפשר ביטוי מספיק, אנחנו דגירה החיידקים עד השלב מאוחר ביומן (600 = 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתכונן לכל תרבות שתי כוסות צנטריפוגות בהיקף מינימאלי של 300 מיליליטר כל אחד ומניח אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פורמלדהיד cross-linking. CAUTION: פורמלדהיד הוא רעיל ביותר אנו ממליצים לעבוד תחת מנדף בטיחות.. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כלי התרבות תחת מנדף בטיחות. פיצול כל דגימה לשתי דוגמאות, אחד השמטת cross-linking (- X) ואחד כולל פורמלדהיד cross-linking (+ X). הוסף 4 מיליליטר 37% תמיסת פורמלדהיד לתרבות מיליליטר 250 להגיע לריכוז סופי של .0.6%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כלי התרבות אחורה ולגדל תאים עבור 20 דקות נוספות כמו בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא תרבויותיך לתוך צינורות צנטריפוגה תחת מנדף בטיחות. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב3,000 XG במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ידי pipetting אותה בזהירות מתחת למכסה המנוע קטר בטיחות. איסוף supernatant המכיל פורמלדהיד הרעיל ולהיפטר ממנו כמו שצריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להגיע לתשואה אופטימלית במהלך הכנת חלבון קרום, להכין spheroplasts הראשונה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול להיווצרות spheroplast של חיידקים גראם שליליים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PreparP2 חיץ דואר (טבלה 1) מאבקת lyophilized. בעדינות לפזר 2 ליזוזים מ&quot;ג ב0.1 M EDTA, pH 8, בצינור 1.5 מיליליטר. תמיד להכין P2 חיץ טרי ליום של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טריס-חיץ עם מעכבי פרוטאז (P3 חיץ). ל10 מיליליטר של טריס-חיץ, להוסיף 0.1 מיליליטר 1 M phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) (טבלת 1) לריכוז סופי של 10 מ&quot;מ. השתמש במאגר באופן מיידי, על מנת להבטיח תפקוד תקין של PMSF כמעכב פרוטאז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי תא גלול ב10 מיליליטר טריס-חיץ עם מעכבי פרוטאז ופתרון טרנספר לצינור חרוטי 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת P2 חיץ מיליליטר 1 ו לדגור על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף spheroplasts ידי צנטריפוגה ב3,000 XG במשך 30 דקות וזורקים supernatant בזהירות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את כדורי spheroplast הלילה ב -20 ° C. </li></ol> 2. טיהור של חלבון ממברנה סטרפטוקוקוס תג (פיתיון) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח גלולה spheroplast על קרח. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הזמן את כדורי spheroplast להפשיר על קרח, להכין 10 מיליליטר P3 חיץ עבור כל הכנת spheroplast. בעדינות לפזר מ&quot;ג DNaseI 1 ב10 מיליליטר טריס-חיץ. הוסף 0.1 מיליליטר PMSF M 1 רק לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור ב 6 מיליליטר P3 מוכן טרי. Sonicate המדגם ארבע פעמים ל1 דקות ברציפות על קרח עם הפסקה 1 דקות בין כל פרץ, במטרה לשבש spheroplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם XG ב 10,000 במשך 10 דקות לפסולת תא קציר. מעביר את supernatant באמצעות פיפטה לצינור ultracentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה שבריר הקרום ב100,000 XG במשך 30 דקות. שטוף את הכדור בזהירות בטריס-חיץ ללא פירוקה. ייבש את הצינור עם ממחטת נייר (למשל קלינקס). הימנע מלהפריע גלולה בכל עת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור (= קרום) בזהירות ב1 מיליליטר טריס-חיץ. השתמש aliquot 20 μl כדי לקבוע את ריכוז החלבון על ידי assay BCA למשל. בשלב זה, את הקרומים ניתן הלם קפוא בliחנקן פאונד ומאוחסנים ב -80 ° C. </li></ol> 3. טיהור של סטרפטוקוקוס תג חלבון ממברנה פיתיון ו- SDS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את ריכוז החלבון של שבריר הקרום עד 5 מ&quot;ג / מיליליטר עם טריס-חיץ. קח 2.5 מיליליטר שבריר קרום (5 מ&quot;ג / מיליליטר) בצינור ultracentrifuge ולהוסיף 0.25 מיליליטר של 20% טריטון X-100 להגיע לריכוז סופי של 2%, על מנת solubilize החלבונים בממברנה. הוספת מוט מיקרו מגנטי ומערבבים על קרח במשך שעה 1. הערה: למרות שבאופן כללי יש לנו תוצאות טובות באמצעות טריטון X-100 כחומר ניקוי, זה יכול להיות שימושי כדי לשנות את חומר הניקוי לאופטימיזציה. במובן זה, יש לנו תוצאות הטובות ביותר עם ​​אלו חומרי ניקוי המשמשים לטיהור תפקודית של חלבון פיתיון קרום בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת ביצוע שלב 3.1, להכין 50 מיליליטר חיץ E W ו 5 מיליליטר חיץ מ( טבלה 1). מלא את 10 מיליליטר 5x ​​להתרכז W חיץ 50 מיליליטר ולהוסיף 150 μl 20% טריטון X-100. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא 1 מיליליטר 5x ​​buffeתרכיז r E ל10 מיליליטר ולהוסיף 30 μl 20% טריטון X-100. לאזן את זרימת עמודה הכבידה superflow סטרפטוקוקוס-Tactin 1 מיליליטר עם 8 וו מיליליטר החיץ שים לב: זה חיוני כדי להוסיף את חומר הניקוי המשמש לsolubilization בריכוז של פי 10 מעל הריכוז הקריטי micelle (CMC) בכל חיץ במהלך הליך הטיהור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מוט המייקר מגנטי ממדגם solubilization וultracentrifuge ב100,000 XG במשך 30 דקות, עד גלולה שבריר הקרום מסיס. הסר את supernatant באמצעות פיפטה לטיהור נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את supernatant לעמודה. הפעל את העמודה רק עם זרימת כוח הכבידה. לשטוף את העמודה עם 5 מיליליטר החיץ וו חזור על שלב זה הכביסה 5x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute חלבוני פיתיון קרום עם 1 מיליליטר חיץ א &#39;חזור על שלב elution זה 4x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרכז שברים elution 2, 3, ו4-300 μl עם יחידת מסנן צנטריפוגלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 200 μl של כל דגימה עם 50 μl 5x SDS-PAGטעינת צבע E. פיצול כל הכנה ב125 aliquots μl. מרתיחים aliquot אחד מכל הכנה ל20 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, כדי להפוך קישורים צולבים פורמלדהיד. בואו דגימות להתקרר לRT לפחות 10 דקות על גבי ספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 30 μl מכל מדגם לנתיב יחיד של polyacrylamide ג&#39;ל מתאים לimmunoblotting. השתמש סמן משקל מולקולרי prestained להתמצאות הטובה ביותר ולהפעיל-SDS 10. </li></ol> 4. Immunoblot ניתוח לאישור שותפי אינטראקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שצעד 3.8 הושלם, חלבוני העברה לממברנה ניטרוצלולוזה על ידי למשל semidry. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את הקרום כדי למנוע תיוג נוקב. הכן את חיץ חסימה על ידי שקילת אלבומין בסרום שור (BSA) כדי להשיג במשקל של 3% לכל נפח שבנאגר מלוח טריס בתוספת סופי ריכוז 0.05% 20-Tween (TBS-T). השתמש בנפח מספיק של חיץ חסימה כדי לכסות את הממברנה. לחסום את הקרום עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדללnd דגירה הנוגדן הראשון הספציפי חלבון טרף כרגיל. השתמש בנוגדן HRP צמוד כנוגדן השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח immunoblot באמצעות ערכת זיהוי chemiluminescent עם רגישות גבוהה. לנטר את האות באמצעות הליך עיבוד סרט קלאסי או ציוד הדמיה דיגיטלי. </li></ol> 5. ניסויי NanoLC-ESI-MS/MS רזולוציה גבוהה לזהות שותפי אינטראקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה שאין נוגדן ספציפי זמין עבור חלבון הטרף או שותפי אינטראקציה ידועים צריך להיות מזוהה, השתמש ספקטרומטריית מסה (MS) לצורך זיהוי. על מנת למנוע זיהום קרטין, השתמש ג&#39;לי precasted להפרדת חלבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסף להכתים-SDS באמצעות ערכת צביעת MS-תואם על פי הפרוטוקול של היצרן. לבצע את כל שלבי הצביעה ושטיפה במיכלי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקות ובהתאמה בלו לנתח אלה על ידי LC ברזולוציה גבוהה / 9 טרשת נפוצה. </li></ol>

<ol>
	<li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).</li><li>Bakheet, T. M., Doig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+identification+of+human+protein+drug+targets.">Properties and identification of human protein drug targets.</a> Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).</li><li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-target+network.">Drug-target network.</a> Nat. Biotechnol. 25, (2007).</li><li>Daley, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+membrane+proteins+into+complexes.">The assembly of membrane proteins into complexes.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).</li><li>Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histidine+kinases+and+response+regulators+in+networks.">Histidine kinases and response regulators in networks.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).</li><li>M&#252;ller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-SPINE:+An+improved+method+to+identify+protein-protein+interaction+partners+of+membrane+proteins+in+vivo.">Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo.</a> Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).</li><li>Herzberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPINE:+A+method+for+the+rapid+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions+in+vivo.">SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo.</a> Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).</li><li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions.">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).</li><li>Hernandez, P., M&#252;ller, M., Appel, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protein+identification+by+tandem+mass+spectrometry:+Issues+and+strategies.">Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies.</a> Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Hunke, S., Keller, R., M&#252;ller, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+by+the+Cpx-envelope+stress+system.">Signal integration by the Cpx-envelope stress system.</a> FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).</li><li>Weber, R. F., Silverman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cpx+proteins+of+Escherichia+coli+K12+:+Structure+of+the+CpxA+polypeptide+as+an+inner+membrane+component.">The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component.</a> J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

ניתוח עמוד שדרת ממברנה הוא גישה ביוכימית, המאפשרת אחד כדי לאשר ולזהות לשותפי שלב זה לא ידוע אינטראקציה של חלבונים בממברנה. עמוד שדרת קרום משלבת in vivo cross-linking ידי פורמלדהיד עם טיהור של חלבון פיתיון קרום סטרפטוקוקוס מתויג. שילוב עם immunoblotting מאפשר האישור של שותפי אינ?...

כדי להבין את תפקידו של חלבון זה חיוני לדעת שותפי האינטראקציה שלה. כמה טכניקות קלאסיות זמינות לזיהוי שותפי אינטראקציה של חלבונים מסיסים. עם זאת, טכניקות אלה אינן ניתנות להעברה בקלות לחלבוני קרום בשל האופי ההידרופובי שלהם 4. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו ניסוי האינטראקציה סטרפטוקוקוס חלבון ממברנה (ממברנה-עמוד שדרה) 6. היא מבוססת על שיטת עמוד השדרה, שהייתה מתאים רק לחלבונים מסיסים 7. יתרונות קרום עמוד שדרה משני יתרונות של פורמלדהיד סוכן cross-linking: ראשון, פורמלדהיד יכול לחדור בקלות ממברנות ולכן מייצר תמונת מצב מדויקת של interactome של תא חי 8. שנית, יכולים להיות הפוכים קישורים צולבים פורמלין על ידי הרתחת 9. הנה, שני יתרונות אלו משמשים לזיהוי לא רק-PPI קבוע, אלא גם הגנה של מחזור החולף של קרוםתוספות 6. בקיצור, סטרפטוקוקוס תג הוא קבע את C-הסופית של חלבון פיתיון קרום נפרד. תאים המבטאים את חלבון פיתיון הקרום מודגרת עם פורמלדהיד אשר חוצה קישורים לטרוף חלבונים לחלבון פיתיון קרום (איור 1). שינויים של חלבוני טרף אין צורך. בשלב הבא, את החלק יחסי הקרום מוכן. לכן, חלבוני קרום solubilized על ידי טיפול בחומרי ניקוי ופיתיון חלבונים הם שיתוף מטוהר עם חלבוני הטרף שלה באמצעות טיהור זיקה. בהמשך לכך, הקישור הצולב מתהפך על ידי רותחים, ואת הפיתיון והחלבונים טרף שיתוף eluted-מופרדים על ידי-SDS. לבסוף, ניתן לזהות חלבוני טרף על ידי ניתוח immunoblot או ספקטרומטריית מסה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="878">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:128px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">4979.1</td>
			<td style="width:271px;">Should not be older than one year</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DNaseI</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">DN25</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BCA protein assay kit</td>
			<td style="width:128px;">Pierce</td>
			<td style="width:137px;">23225</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Micromagnetic rod</td>
			<td style="width:128px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">0955.2</td>
			<td style="width:271px;">5 mm in length, 2 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:128px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">6683.1</td>
			<td style="width:271px;">standard detergent for solubilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">n-Dodecyl-&#946;-maltoside</td>
			<td style="width:128px;">Glycon</td>
			<td style="width:137px;">D97002-C</td>
			<td style="width:271px;">the best detergent to solubilze CpxA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column</td>
			<td style="width:128px;">IBA</td>
			<td style="width:137px;">2-1207-050</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Strep-tag protein purification buffer set</td>
			<td style="width:128px;">IBA</td>
			<td style="width:137px;">2-1002-001</td>
			<td style="width:271px;">Contains buffer W and buffer E</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Amicon Ultra-4 centrifugal filter</td>
			<td style="width:128px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">UFC803024</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:128px;">Pierce</td>
			<td style="width:137px;">34080</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">SilverQuest Silverstaining kit</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">LC6070</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">FireSilver Staining Kit</td>
			<td style="width:128px;">Proteome Factory</td>
			<td style="width:137px;">P-S-2001</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

membrane-spine: a biochemical tool to identify protein-protein interactions of membrane proteins in vivo

החלבונים בממברנה הם חיוניים ליכולת קיום של תאים ולכן הם מטרות טיפוליות חשובות 1-3. מאז הם פועלים במתחמים 4, שיטות לזיהוי ואפיון של האינטראקציות שלהם נחוצות 5. לשם כך, פיתחנו ניסוי ממברנה סטרפטוקוקוס חלבון האינטראקציה, הנקרא ממברנה עמוד השדרה 6. טכניקה זו משלבת in vivo cross-linking באמצעות פורמלדהיד צולב מקשר הפיך עם טיהור זיקה של חלבון פיתיון קרום סטרפטוקוקוס מתויג. במהלך ההליך, חלבוני טרף צולבים הם שיתוף מטוהר עם חלבון פיתיון הקרום ולאחר מכן הופרד על ידי רתחה. לפיכך, ניתן לבצע שתי משימות עיקריות בעת ניתוח אינטראקציות בין חלבונים (-PPI) של חלבונים בממברנה באמצעות ממברנה בעמוד שדרה: ראשון, האישור של שותף אינטראקציה שהוצע על ידי immunoblotting, ושנית, זיהוי שותפי אינטראקציה חדשים על ידי ניתוח ספקטרומטריית מסה . יתר על כן, גם אניow זיקה, PPIs החולף הוא לגילוי על ידי טכניקה זו. לבסוף, ממברנה שדרה להתאמה כמעט לכל סוג תא, מה שהופך אותו מתאים ככלי מיון רבי עוצמה כדי לזהות-PPI של חלבונים בממברנה.

ניתוח עמוד שדרת קרום מאפשר שיתוף הטיהור של חלבונים בממברנה ושותפי חלבון transiently אינטראקציה. שיתוף הטיהור מושגת על ידי השימוש בפורמלדהיד סוכן cross-linking. שני פרמטרים הם קריטיים כדי למנוע קישורים צולבים נוקבים: ריכוז הפורמלין וזמן cross-linking. השימוש מספק, אך לא מוגזם של פורמל?...

Watch this Scientific Journal Video about Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo at JoVE.com

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

גישת יוכימיים מתוארת לזהות באינטראקציות vivo חלבונים (PPI) של חלבונים בממברנה. השיטה משלבת צלב המקשר חלבון, טיהור זיקה וספקטרומטריית מסה, וניתנת להתאמה כמעט לכל סוג תא או האורגניזם. עם גישה זו, גם זיהוי של PPI החולף הופך לאפשרי.

קרום עמוד שדרה: ביוכימית כלי לזיהוי חלבונים אינטראקציות של חלבונים בממברנה<em&gt; בVivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

membrane-spine-biochemical-tool-to-identify-protein-protein

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

13.6K Views.  Universität Osnabrück.  גישת יוכימיים מתוארת לזהות באינטראקציות vivo חלבונים (PPI) של חלבונים בממברנה. השיטה משלבת צלב המקשר חלבון, טיהור זיקה וספקטרומטריית מסה, וניתנת להתאמה כמעט לכל סוג תא או האורגניזם. עם גישה זו, גם זיהוי של PPI החולף הופך לאפשרי. 

Video: Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural biology 1. In recent years, this method has achieved great success in studying structures of proteins and macromolecular complexes 2, 3. Compared with electron cryomicroscopy (cryoEM), in which frozen hydrated protein samples are embedded in a thin layer of vitreous ice 4, negative staining is a simpler sample preparation method in which protein samples are embedded in a thin layer of dried heavy metal salt to increase specimen contrast 5. The enhanced contrast of negative stain EM allows examination of relatively small biological samples. In addition to determining three-dimensional (3D) structure of purified proteins or protein complexes 6, this method can be used for much broader purposes. For example, negative stain EM can be easily used to visualize purified protein samples, obtaining information such as homogeneity/heterogeneity of the sample, formation of protein complexes or large assemblies, or simply to evaluate the quality of a protein preparation.
In this video article, we present a complete protocol for using an EM to observe negatively stained protein sample, from preparing carbon coated grids for negative stain EM to acquiring images of negatively stained sample in an electron microscope operated at 120kV accelerating voltage. These protocols have been used in our laboratory routinely and can be easily followed by novice users.

Visualizing protein samples by negative stain electron microscopy (EM) has become a popular structural analysis method. It is useful for quantitative structural analysis, such as calculating a 3D reconstruction of the molecules being studied, and also for qualitative examination of the quality of protein preparations. In this article we present detailed protocols for preparing the EM grids, staining the sample and visualizing the sample in an electron microscope. Novice users can follow these protocols easily and to utilize negative stain EM as a routine assay, in addition to other biochemical assays, for evaluating their protein samples.

לדמיין חלבונים מכלולים Macromolecular על ידי א.מ. כתמים שליליות: החל הכנה רשת הרכישה תמונה

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

קביעת תעריף הובלת xenobiotics ו ננו מעבר לשליה באמצעות<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; דגם זלוף שליה אנושי

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using affinity chromatography.&#160;While affinity chromatography using porous protein A agarose beads packed in columns is arguably the most common method of laboratory scale isolation of antibodies and recombinant proteins expressing Fc fragments of IgG, it can be a time consuming and expensive process.&#160;Time and financial constraints are especially daunting in small basic science labs that must recover hundreds of micrograms to milligram quantities of protein from dilute solutions, yet lack access to high pressure liquid delivery systems and/or personnel with expertise in bioseparations. Moreover, product quantification and characterization may also excessively lengthen processing time over several workdays and inflate expenses (consumables, wages, etc.).&#160;Therefore, a fast, inexpensive, yet effective protocol is needed for laboratory scale isolation and characterization of antibodies and other proteins possessing an Fc fragment.&#160;To this end, we have devised a protocol that can be completed by limited-experience technical staff in less than 9 hr (roughly one workday) and as quickly as 4 hr, as opposed to traditional methods that demand 20+ work hours. Most required equipment is readily available in standard biomedical science, biochemistry, and (bio)chemical engineering labs, and all reagents are commercially available.&#160;To demonstrate this protocol, representative results are presented in which chimeric&#160;murine galectin-1 fused to human Fc (Gal-1hFc) from cell culture supernatant was isolated using a protein A membrane adsorber.&#160;Purified Gal-1hFc was quantified using an expedited Western blotting analysis procedure and characterized using flow cytometry. The streamlined workflow can be modified for other Fc-expressing proteins, such as antibodies, and/or altered to incorporate alternative quantification and characterization methods.

Compared with traditional affinity chromatography using protein A agarose bead-packed columns, protein A membrane adsorbers can significantly speed laboratory-scale isolation of antibodies and other Fc fragment-expressing proteins.&#160;Appropriate analysis and quantification methods can further accelerate protein processing, allowing isolation/characterization to be completed in one workday, instead of 20+ work hours.

בידוד ואפיון של חלבונים דוברי Fc אנושיים כימריים באמצעות חלבון ספיחה ממברנה וזרימת עבודה יעילה

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

הארה תהודת אנרגיה העבר לחקר שינויי קונפורמציה בחלבונים בממברנה שבאו לידי ביטוי בתאי יונקים

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em&gt; In vivo</em&gt; דימות אופטי

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

כמו כריך microenvironments לרתום ניידים / חומרי אינטראקציות

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

ה-DNA צינוריות כמו כלי רב-תכליתי ללמוד פולימרים Semiflexible

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...