Esta pesquisa foi apoiada por doações da Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 e SFB940 a SH

Nota: Informações detalhadas sobre tampões indicados no protocolo está disponível na Tabela 1. 1. Fixação de interações proteína-proteína por formaldeído Cross-ligando em células vivas <ol><li> Para começar a preparar meios de cultura, soluções de reserva e de tampão P1 <ol><li> Prepare 500 ml meio: O meio deve proporcionar condições que suportam a interação entre a proteína isca membrana e proteínas presas. Além disso, um experimento deve ser realizado sob condições em que se espera nenhuma interação (por exemplo, sem cross-linking). Nota: Nós comparamos interações proteína-proteína em bactérias estressados ​​e não-estressados. Portanto, podemos preparar 500 ml de Luria Bertani (LB) (Tabela 1) que complementar com um agente de indução de stress (por exemplo, NaCl a 0,5 M) num frasco de 2 L de Erlenmeyer. Para o controle, usamos meio LB normal com 0,17 M de NaCl (pH 7,0). </li><li> Preparar tampão Tris (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) e 0,1 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), pH 8,0 solução de estoque (Tabela 1). </li><li> Prepare tampão P1. Dissolve-se a sacarose a uma concentração final de 0,5 M em tampão Tris. Esterilizar tampão P1 por filtração e armazená-lo a 4 ° C. </li></ol></li><li> Crescer as células que expressam a proteína de membrana de isco com uma fusão C-terminal de Strep-tag de um vector. Induzem a expressão de proteínas de membrana de isco durante um tempo suficiente. Nota: Foram induzir a expressão de proteínas de membrana bacterianas isca em fase-log precoce (A 600 = 0,3) pela adição de 250 ul de 1 M isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) para 500 ml de meio (concentração final: 0,5 mM) . Para permitir uma expressão suficiente, que incuba-se as bactérias até à fase de fim de registo (A 600 = 1,2). </li><li> Prepare-se para cada uma cultura de duas provetas de centrifugação com um volume mínimo de 300 ml de cada um e colocá-las sobre gelo. </li><li> Realize formaldeído cross-linking. CAUÇÃO: O formaldeído é altamente tóxico Recomendamos trabalhando sob uma coifa de segurança.. <ol><li> Transfira o recipiente de cultura sob uma coifa de segurança. Dividir cada amostra em duas amostras, uma omissão de reticulação (- X) e uma incluindo o formaldeído de reticulação (+ X). Adicionar 4 ml de solução de formaldeído a 37% e 250 ml de cultura para atingir uma concentração final de 0,6%. </li></ol></li><li> Transfira os recipientes de cultura para trás e cultivar células por mais 20 min como antes. </li><li> Preencha seus culturas dentro dos tubos de centrífuga sob uma coifa de segurança. Recolher as células por centrifugação a 3000 xg durante 30 min. </li><li> Elimine o sobrenadante com cuidado pipetando-lo sob uma coifa de segurança. Colete tóxico sobrenadante contendo formaldeído e descartá-la adequadamente. </li><li> A fim de atingir o rendimento ideal durante a preparação de proteínas de membrana, preparar esferoplastos primeiro. Aqui, nós fornecemos um protocolo para a formação de esferoplastos de bactérias Gram-negativas: <ol><li> Prepartampão e P2 (Tabela 1) a partir de pó liofilizado. Suavemente dissolver 2 mg de lisozima em 0,1 M de EDTA, pH 8, num tubo de 1,5 ml. Sempre preparar tampão P2 na hora para o dia do experimento. </li><li> Prepare Tris-buffer com inibidor de protease (P3 buffer). A 10 ml de tampão Tris, adicionar 0,1 ml de 1 M de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (Tabela 1) para uma concentração final de 10 mM. Use o tampão imediatamente, para garantir o funcionamento adequado da PMSF como inibidor da protease. </li><li> Os sedimentos de células Ressuspender em 10 ml de tampão Tris com inibidor de protease e solução de transferência para um tubo de 15 ml. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão P2 e incubar em gelo durante 30 min. </li><li> Recolhe esferoplastos por centrifugação a 3000 xg durante 30 minutos e descartar o sobrenadante cuidadosamente. </li></ol></li><li> Incubar as pelotas de esferoplastos a noite a -20 ° C. </li></ol> 2. Purificação de Strep-tag Membrane Protein (Bait) <ol><li> Coloque esferoplasto pellet no gelo. &lt;/ Li&gt; <li> Durante o tempo dos peletes de esferoplastos descongelar em gelo, 10 ml de preparar P3 tampão para cada preparação de esferoplastos. Suavemente dissolver 1 mg ADNasel em 10 ml de tampão Tris. Adicionar 0,1 ml de 1 M de PMSF imediatamente antes da utilização. </li><li> Ressuspender o sedimento em 6 ml P3 preparada de fresco. Sonicar a amostra quatro vezes durante 1 min de forma contínua em gelo com 1 min de pausa entre cada explosão, de forma a interromper os esferoplastos. </li><li> Centrifugar a amostra a 10.000 xg durante 10 minutos para colher os detritos celulares. Transferir o sobrenadante com uma pipeta para um tubo de ultracentrifugação. </li><li> Sedimentar a fracção de membrana a 100.000 xg durante 30 min. Lavar o sedimento cuidadosamente em Tris-tampão sem dissolver. Seque o tubo com um lenço de papel (por exemplo, lenços de papel). Evitar perturbar o sedimento, em qualquer momento. </li><li> Ressuspender o sedimento (= membranas) cuidadosamente em 1 ml de tampão Tris. Use uma alíquota de 20 ul para determinar a concentração de proteína pelo ensaio de BCA por exemplo. Neste passo, as membranas podem ser congelados em choque liquid azoto e armazenada a -80 ° C. </li></ol> 3. Purificação de Strep-tag Membrana Isca proteína e SDS-PAGE <ol><li> Normalizar a concentração de proteína da fracção de membrana de 5 mg / ml com tampão Tris. Tome 2,5 ml da fracção de membrana (5 mg / ml) num tubo de ultracentrifugação e adicionar 0,25 ml de 20% Triton X-100 para se atingir uma concentração final de 2%, a fim de solubilizar as proteínas da membrana. Adicionar uma haste de micro-magnético e agita-se em gelo durante 1 hr. Nota: Apesar de, em geral, temos bons resultados com o Triton X-100 como detergente, pode ser útil para mudar o detergente para otimização. A este respeito, temos os melhores resultados com os detergentes utilizados para a purificação funcional da respectiva proteína isco membrana. </li><li> Embora a realização do passo 3.1, preparar 50 ml de tampão W e 5 ml de tampão E (Tabela 1). Encha-se 10 mL de 5x tampão W concentrado para 50 ml e adicionar 150 ul de 20% de Triton X-100. <ol><li> Encha-se 1 ml de 5x buffer E concentrado para 10 ml e adicionar 30 ul de 20% de Triton X-100. Equilibrar um Strep-Tactin coluna de fluxo de 1 ml superfluxo gravidade com 8 ml de tampão de W. Nota: É essencial para adicionar o detergente utilizado para a solubilização em uma concentração de 10 vezes acima da concentração micelar crítica (CMC) em qualquer solução durante o processo de purificação. </li></ol></li><li> Retirar a vareta micro-magnético a partir da amostra de solubilização e de ultracentrifugação a 100000 xg durante 30 minutos, para sedimentar a fracção de membrana insolúvel. Retirar o sobrenadante utilizando uma pipeta para purificação adicional. </li><li> Carrega-se o sobrenadante para a coluna. Executar a coluna só com fluxo por gravidade. Lavar a coluna com 5 ml de tampão W. Repetir esta etapa de lavagem 5x. </li><li> Eluir as proteínas de membrana de isca com 1 ml de tampão E. Repita este passo de eluição de 4x. </li><li> Concentra-se as fracções de eluição 2, 3 e 4, até 300 ml, com uma unidade de filtração centrífuga. </li><li> Misturar 200 ul de cada amostra com 50 mL de 5x de SDS-PAGCorante de carga de E. Divida cada preparação em 125 mL alíquotas. Ferver uma alíquota de cada preparação durante 20 min a 95 ° C, para reverter ligações cruzadas de formaldeído. Deixe as amostras arrefecer para a temperatura ambiente durante pelo menos 10 min, em cima da bancada. </li><li> Carga de 30 ul de cada amostra para uma única pista de um gel de poliacrilamida-gel adequado para imunoblotting. Use um marcador prestained peso molecular para uma melhor orientação e executar SDS-PAGE 10. </li></ol> 4. Análise Imunoblot para confirmar parceiros de interação <ol><li> Uma vez que o passo 3.8 for concluída, proteínas de transferência para uma membrana de nitrocelulose por exemplo semidry. </li><li> Bloquear a membrana para evitar a marcação não específica. Preparar o tampão de bloqueio por pesagem de albumina sérica bovina (BSA) para atingir o peso de 3% por volume em soro fisiológico tamponado com Tris suplementado com uma concentração final de 0,05% de Tween-20 (TBS-T). Utilizar um volume suficiente de tampão de bloqueio para cobrir a membrana. Bloquear a membrana durante 1 hora a RT. </li><li> Diluir umaª incubar o primeiro anticorpo específico da proteína presa como de costume. Usar um anticorpo ligado a HRP como o segundo anticorpo. </li><li> Desenvolver a imunotransferência utilizando um kit de detecção quimioluminescente com alta sensibilidade. Monitorar o sinal através de um procedimento de processamento de filmes clássicos ou equipamentos de imagem digital. </li></ol> 5. NanoLC-ESI-MS/MS de alta resolução Experimentos para identificar parceiros de interação <ol><li> No caso em que nenhum anticorpo específico está disponível para a proteína presa ou parceiros de interacção desconhecidos devem ser identificadas, utilizar a espectrometria de massa (MS) para a identificação. A fim de evitar a contaminação da queratina, usar géis precasted para a separação de proteínas. </li><li> Prata manchar a SDS-PAGE utilizando um kit de coloração MS-compatível de acordo com o protocolo do fabricante. Execute todas as etapas de coloração e lavagem de tanques de vidro. </li><li> Especiais de Consumo respectivas bandas e analisar estes de alta resolução por LC / MS 9. </li></ol>

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	<li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).</li><li>Bakheet, T. M., Doig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+identification+of+human+protein+drug+targets.">Properties and identification of human protein drug targets.</a> Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).</li><li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-target+network.">Drug-target network.</a> Nat. Biotechnol. 25, (2007).</li><li>Daley, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+membrane+proteins+into+complexes.">The assembly of membrane proteins into complexes.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).</li><li>Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histidine+kinases+and+response+regulators+in+networks.">Histidine kinases and response regulators in networks.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).</li><li>M&#252;ller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-SPINE:+An+improved+method+to+identify+protein-protein+interaction+partners+of+membrane+proteins+in+vivo.">Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo.</a> Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).</li><li>Herzberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPINE:+A+method+for+the+rapid+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions+in+vivo.">SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo.</a> Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).</li><li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions.">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).</li><li>Hernandez, P., M&#252;ller, M., Appel, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protein+identification+by+tandem+mass+spectrometry:+Issues+and+strategies.">Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies.</a> Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Hunke, S., Keller, R., M&#252;ller, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+by+the+Cpx-envelope+stress+system.">Signal integration by the Cpx-envelope stress system.</a> FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).</li><li>Weber, R. F., Silverman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cpx+proteins+of+Escherichia+coli+K12+:+Structure+of+the+CpxA+polypeptide+as+an+inner+membrane+component.">The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component.</a> J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Análise Membrane coluna vertebral é uma abordagem bioquímica que permite que se confirmar e identificar este ponto parceiros de interação desconhecidos de proteínas de membrana. Membrana COLUNA combina in vivo cross-linking por formaldeído com purificação de uma proteína de membrana isca Strep-marcado. A combinação com imunotransferência facilita a confirmação de parceiros de interacção previstas (Figura 2). Além disso, a combinação com análise MS permite a identificação ...

Para entender a função de uma proteína que é essencial conhecer os seus parceiros de interação. Várias técnicas clássicas estão disponíveis para a identificação de parceiros de interacção de proteínas solúveis. No entanto, estas técnicas não são facilmente transferíveis para a membrana proteínas, devido à sua natureza hidrofóbica 4. Para ultrapassar esta limitação, foi desenvolvido o Strep-proteína de membrana interacção experimento (Membrane-SPINE) 6. Ele baseia-se no método da coluna vertebral, que era apenas adequado para proteínas solúveis 7. Benefícios membrana da coluna vertebral de duas vantagens do formaldeído agente de reticulação: primeiro, o formaldeído pode facilmente penetrar as membranas e, consequentemente, gera uma imagem precisa da interactoma de uma célula viva 8. Em segundo lugar, formaldeído ligações cruzadas pode ser revertida por ebulição 9. Aqui, estas duas vantagens são usados ​​para identificar não só IPP permanentes, mas também transientes de prote membranains 6. Em resumo, um Strep-tag está fundido com o terminal C da proteína de membrana integral isca. As células que expressam a proteína de membrana de isca são incubadas com formaldeído, que as ligações cruzadas atacam proteínas para a proteína isco membrana (Figura 1). Modificações de proteínas presas não são necessários. Em seguida, a fracção de membrana é preparado. Portanto, as proteínas da membrana são solubilizados por tratamento com detergente e isca proteínas são co-purificados com suas proteínas presas utilizando a purificação por afinidade. Subsequentemente, a ligação transversal é invertida por ebulição, e o isco e suas proteínas presa co-eluidas são separadas por SDS-PAGE. Finalmente, as proteínas de presa pode ser identificado por análise de imunotransferência ou espectrometria de massa.

<table><tbody><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Roth</td><td>4979.1</td><td>Should not be older than one year</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Micromagnetic rod</td><td>Roth</td><td>0955.2</td><td>5 mm in length, 2 mm in diameter</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td>standard detergent for solubilization</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&amp;beta;-maltoside</td><td>Glycon</td><td>D97002-C</td><td>the best detergent to solubilze CpxA</td></tr><tr><td>1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column</td><td>IBA</td><td>2-1207-050</td><td></td></tr><tr><td>Strep-tag protein purification buffer set</td><td>IBA</td><td>2-1002-001</td><td>Contains buffer W and buffer E</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 centrifugal filter</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>SilverQuest Silverstaining kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr><tr><td>FireSilver Staining Kit</td><td>Proteome Factory</td><td>P-S-2001</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

membrane-spine: a biochemical tool to identify protein-protein interactions of membrane proteins in vivo

As proteínas da membrana são essenciais para a viabilidade celular e, portanto, são alvos terapêuticos importantes 1-3. Desde que funcionam nos complexos de 4, métodos para identificar e caracterizar as suas interacções são necessárias 5. Para isso, desenvolvemos a membrana Strep-proteína experimento interação, chamada de membrana-espinha 6. Esta técnica combina in vivo de ligação cruzada utilizando o formaldeído reversível de reticulação com a purificação por afinidade de uma proteína de membrana de isca Strep-tag. Durante o procedimento, as proteínas presa reticulados são co-purificados com a proteína de membrana de isca e, subsequentemente, separado por ebulição. Assim, duas grandes tarefas podem ser executadas quando se analisa as interações proteína-proteína (IBP) de proteínas de membrana usando Membrane-espinha: primeiro, a confirmação de um parceiro de interação proposto por immunoblotting e, segundo, a identificação de novos parceiros de interação através da análise de espectrometria de massa . Além disso, mesmo low afinidade PPIs transientes são detectáveis ​​por esta técnica. Finalmente, Membrane-espinha é adaptável a praticamente qualquer tipo de célula, tornando-o aplicável como ferramenta de triagem para identificar poderoso PPIs de proteínas de membrana.

A análise da membrana COLUNA permite co-purificação de proteínas da membrana e transitoriamente interagindo parceiros proteicos. O co-purificação é conseguido usando o agente formaldeído cross-linking. Dois parâmetros são críticos para evitar inespecíficas ligações cruzadas: a concentração de formaldeído e o tempo de reticulação. A utilização suficientes, mas não excessivas de formaldeído pode ser facilmente controlada por imunotransferência. Complexos proteicos formaldeído reticulado pode ser s...

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Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A abordagem bioquímica é descrita a identificação in vivo de interacções proteína-proteína (PPI), de proteínas de membrana. O método combina a proteína de ligação cruzada, de purificação por afinidade e espectrometria de massa, e é adaptável para quase qualquer tipo de célula ou organismo. Com esta abordagem, embora a identificação de IPP transientes torna-se possível.

Membrana-COLUNA: Uma Ferramenta bioquímicos na identificação de interações proteína-proteína de Proteínas de Membrana<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

membrane-spine-biochemical-tool-to-identify-protein-protein

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

13.7K visualizações.  Universität Osnabrück.  A abordagem bioquímica é descrita a identificação in vivo de interacções proteína-proteína (PPI), de proteínas de membrana. O método combina a proteína de ligação cruzada, de purificação por afinidade e espectrometria de massa, e é adaptável para quase qualquer tipo de célula ou organismo. Com esta abordagem, embora a identificação de IPP transientes torna-se possível. 

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Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Peptídeos biotinylated célula-penetrante para estudar interações da proteína-proteína intracelular

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Bioquímica

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein interactions in many cases is associated with significant experimental challenges. In particular, sorting receptors interact with their protein cargo in the lumen of the membrane compartments often in a detergent-sensitive fashion, making co-immunoprecipitation of these proteins unusable. Binding of the sorting receptor sortilin to glucose transporter GLUT4 may serve as an example of weak luminal interactions between membrane proteins. Here, we describe a fast, simple, and inexpensive assay to validate the interaction between sortilin and GLUT4. For that, we have designed and chemically synthesized the myc-tagged peptide corresponding to the potential sortilin-binding epitope in the luminal part of GLUT4. Sortilin tagged with six histidines was expressed in mammalian cells, and isolated from cell lysates using Cobalt beads. Sortilin immobilized on the beads was incubated with the peptide solution at different pH values, and the eluted material was analyzed by Western blotting. This assay can be easily adapted to study other detergent-sensitive protein-protein interactions.

We describe a protocol for detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins using binding of the sorting receptor, sortilin, to the first luminal loop of the glucose transporter protein, GLUT4, as an example.

Deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced that allow the proximity-dependent labeling of proteins in living cells. One such enzyme, BirA* (used in the BioID approach), mediates the biotinylation of proteins within a range of approximately 10 nm. Hence, when fused to a protein of interest and expressed in cells, it allows the labeling of proximal proteins in their native environment. As opposed to AP that relies on the purification of assembled protein complexes, BioID detects proteins that have been marked within cells no matter whether they are still interacting with the protein of interest when they are isolated. Since it biotinylates proximal proteins, one can moreover capitalize on the exceptional affinity of streptavidin for biotin to very efficiently isolate them. While BioID performs better than AP for identifying transient or weak interactions, both AP- and BioID-mass spectrometry approaches provide an overview of all possible interactions a given protein may have. However, they do not provide information on the context of each identified PPI. Indeed, most proteins are typically part of several complexes, corresponding to distinct maturation steps or different functional units. To address this common limitation of both methods, we have engineered a protein-fragments complementation assay based on the BirA* enzyme. In this assay, two inactive fragments of BirA* can reassemble into an active enzyme when brought in close proximity by two interacting proteins to which they are fused. The resulting split-BioID assay thus allows the labeling of proteins that assemble around a pair of interacting proteins. Provided these two only interact in a given context, split-BioID then allows the analysis of specific context-dependent functional units in their native cellular environment. Here, we provide a step-by-step protocol to test and apply split-BioID to a pair of interacting proteins.

We provide a step-by-step protocol for split-BioID, a protein fragments-complementation assay based on the proximity-labeling technique BioID. Activated on the interaction of two given proteins, it allows the proteomics analysis of context-dependent protein complexes in their native cellular environment. The method is simple, cost-effective and only requires standard laboratory equipment.

Split-BioID — Proteomic análise de complexos de proteínas específicas do contexto em seu ambiente nativo do celular

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

Avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análise de interação proteína-proteína de membrana

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

In vivo Detecção de interações proteína-proteína em Micro-padrão Superfícies

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Biologia

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imagem interações proteína-proteína In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

Protein Assay Overlay membrana: um protocolo para testar Interação entre proteínas solúveis e insolúveis In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Biotinylated Cell-Penetrating Peptide Probe to Detect Protein-Protein Interactions

Source: Jara&#237;z-Rodr&#237;guez, M. et al., <a href="https://app.jove.com/v/56457">Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique that uses biotinylated cell-penetrating peptides to detect intracellular protein-protein interactions. The cell-penetrating peptides facilitate the conjugated peptide to enter a cell and specifically bind to its interacting proteins. The biotin, after binding to avidin, allows purification of the interacting proteins&#8217; complex from a cell lysate.

Sonda de peptídeo penetrante de células biotiniladas para detectar interações proteína-proteína

Source: Jara&#237;z-Rodr&#237;guez, M. et al., Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions. J. Vis. Exp. ...

Membrana-COLUNA: Uma Ferramenta bioquímicos na identificação de interações proteína-proteína de Proteínas de Membrana

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