השימוש חסרי חוליות גלריה מלאבלה כמודל זיהום לחקור את מתחם שחפת של פטרת

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בגליה מלונלה כמודל זיהום אלטרנטיבי לחקר שחפת, מה שמקטין את מספר המודלים של יונקים המשמשים במחקר. בהשוואה למודלים קונבנציונליים של יונקים כגון עכברים, Mellonella גלריה הוא מודל זול יותר, מקובל מבחינה אתית, ונגיש יותר ללמוד שחפת. אופטימיזציה נוספת של מודל זה תאפשר סינון של יעילות התרופה האנטימקובקטריאלית המועמדת ורעילות ותתרום לפיתוח טיפולים חדשניים הדרושים בדחיפות לשחפת.

גלריה mellonella בעל מערכת חיסונית המולדת מורכבת דומה לזו של יונקים. המחקר של אינטראקציה מארח-פתוגן עשוי לחשוף עוד יותר את התפקיד של חסינות innate בשחפת. השימוש mellonella גלריה כמודל זיהום אינו מוגבל שחפת כבר בשימוש נרחב עבור פתוגנים חיידקיים ופטריות אחרים בעשור האחרון.

כדי להתחיל, להפשיר מלאי גליצרול קפוא 1.2 מיליליטר של Mycobacterium bovis BCG לוקס, זן החיסון במונטריאול השתנה עם המעבורת פלסמיד pSMT1 נושאת את הגנים luxAB. בבקבוק ארלנפייר 250 מיליליטר, לחסן 15 מיליליטר של מרק מידלברוק 7H9 עם aliquot מופשר 1.2 מיליליטר של לוקס BCG. מניחים את הבקבוק במיכל ביו-בטיחותי אטום ומאירים ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור שייקר מסלולי ב-220 סל"ד למשך 72 שעות.

לאחר הדגירה, הכינו דילול של 1:10 של התרבות בתמיסת מלח עם אגירת פוספט בצינורות לומינומטר, מערבולת, והעמיסו את צינורות הזוהר לתוך מד הזוהר. לטעון את המצע 1%n-decyl אלדהיד באתנול מוחלט לתוך פלטפורמת המזרק ולמדוד את הביולומינציה. המר את הביולומינציה ליחידות יוצרות מושבה כדי לבדוק את הצמיחה של תרבות לוקס BCG.

מעבירים את התרבות לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה ב 2, 175 פעמים גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה את התאים. השלך את העל-טבעי לחיטוי מתאים עם פעילות ידועה של מיקובקטריצ'ידאלית. לשטוף את גלולת התא פעמיים ב 50 מיליליטר של PBS-T על ידי צנטריפוגה ב 2, 175 פעמים גרם במשך 10 דקות כדי למנוע גושים חיידקיים.

לאחר הכביסה הסופית, decant הפסולת supernatant ולתלות מחדש את גלולת התא mycobacterial בנפח הנדרש של PBS-T כדי לדלל את ההשעיה mycobacterial לצפיפות התא הרצוי. לאחר מכן, הכינו דילול סדרתי פי 10 של ה-inoculum בצלחות של 24 בארות באמצעות PBS-T. צלחת החוצה 10 microliters של כל דילול על מידלברוק 7H11 צלחות אגר כפול כדי למנות ספירת CFU inoculum.

יש לשמור על הזחלים הנרכשים בחושך ב-18 מעלות צלזיוס עם ההגעה ולהשתמש בהם תוך שבוע מיום הרכישה. זהה ובחר זחלים בריאים לניסויים המבוססים על צבע קרם אחיד, גודל ומשקל מתאימים, תנועתיות גבוהה, ובעל יכולת לימין את עצמם כאשר התהפכו. בעזרת פינצטה קהה, סופרים בזהירות את הזחלים הבריאים לתוך צלחת פטרי מרופדת בשכבה של נייר סינון ומאחסנים בטמפרטורת החדר בחושך עד לשימוש.

הכן את פלטפורמת ההזרקה על-ידי הקשה על נייר סינון עגול בקוטר 94 מ"מ למשטח שטוח מוגבה. שאפו שלושה כרכים של 70% אתנול למיקרו-זירה של 25 מיקרוליטר כדי לחסן, להשליך ולשטוף עוד יותר בשלושה כרכים של PBS-T סטרילי. לאחר מכן, תוכלו למפות את ה-BCG lux inoculum המוכן ולשאוף 10 מיקרוליטרים למיקרו-מזנון הסטרילי.

השתמש במזרק נפרד כדי לשאוף PBS-T עבור פקד שלילי. לאחר 10 זריקות, יש להשתמש מחדש ב- BCG lux inoculum כדי להבטיח השעיית תאים אחידה. השתמש פינצטה להרים זחל אחד ולהמקום על פלטפורמת ההזרקה.

על הרציף, להפוך את הזחל על גבו ולשתק על ידי אבטחת הראש והזנב עם פינצטה. אתר את הפרולג השמאלי האחרון, ספירה לאחור מראש הזחל והכנס בזהירות את קצה המחט בעומק של חמישה עד שישה מילימטרים בזווית של 10 עד 20 מעלות למישור האופקי. להזריק את inoculum מהמזרק.

לאחר כל זיהום, להעביר את הזחל הנגוע לתוך צלחת פטרי מרופד בשכבה של נייר מסנן. צלחת פטרי אחת של 94 מ"מ יכולה להכיל עד 30 זחלים. אחסן את צלחת פטרי בקופסה חשוכה ומאווררת בתוך אינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

לפקח על הישרדות הזחלים כל 24 שעות. זחלים נחשבים מתים כאשר הם אינם מצליחים לנוע בתגובה למגע. לתעד את ההישרדות ולהעריך את המשמעות הסטטיסטית עם מבחן מנטל-קוקס.

כל 24 שעות, בחר באקראי חמישה זחלים נגועים ולהשתמש ספוג ניצן כותנה ספוג 70% אתנול כדי לעקר בעדינות את משטחי הזחל. מניחים את הזחלים בנפרד לתוך צינורות מטריצה lysing שני מיליליטר המכיל 800 microliters של PBS סטרילי. לאחר מכן, השתמש homogenizer כדי הומוגניזציה הזחלים במשך 60 שניות בשישה מטרים לשנייה.

צנטריפוגה צינורות lysing ב 3, 500 פעמים גרם במשך חמש שניות כדי להסיר את homogenate מן המכסים בזהירות decant הומוגנית לתוך חמישה צינורות לומינומטר סטרילי בנפרד. שמור 100 מיקרוליטרים של הומוגונט בצינור תגובה סטרילי של 1.5 מיליליטר. לשחזר כל הומוגנית שנותרה על ידי שטיפת צינורות מטריצה lysing עם מיליליטר אחד של PBS-T ו pipette לתוך צינורות זוהר המתאים.

מערבולת צינורות הזוהר ולמדוד את הביולומינציה של homogenates על לומינומטר. לאחר מכן, הכינו דילול סדרתי פי 10 של 100 המיקרוליטרים השמורים של הומוגונטים בצלחות תרבות של 24 בארות באמצעות PBS-T. פיפטה 10 מיקרוליטרים של הדילול על כל צלחת אגר מידלברוק 7H11 ולהשתמש מפזר צלחת סטרילית להתפשט.

דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שבועיים. לאחר מכן, לספור יחידות להרכיב מושבה. קבע את יחס RLU ל- CFU של לוקס BCG בעקבות זיהום vivo.

בניסוי זה, ארסיות תלוית מינון לוקס BCG נצפתה בזחלי G.mellonella על פני תקופת דגירה של 96 שעות. המינון הקטלני הנדרש לתמותה של 50% זחל נקבע להיות אחד פעמים 10 לכוחו של שבעה CFU. קבוצות ביקורת מוזרק עם מנה 10 מיקרוליטר של PBS-T או אלה פשוט נדקר הדמיה פציעות מחט לא השפיעו על בריאות הזחל או להוביל לעלייה בתמותה.

עבור זחלים נגועים פעמיים 10 לעוצמה של שבעה מינון CFU של לוקס BCG, מלניזציה של קו הגב הזחל נצפתה מ 48 שעות לאחר זיהום מלניזציה מערכתית נצפתה מ 96 שעות לאחר ההדבקה. זיהום עם פעם אחת 10 לעוצמה של שבעה מינון CFU של לוקס BCG הביא לירידה ראשונית של bioluminescence בתוך 72 השעות הראשונות לאחר ההדבקה. עם זאת, לאחר 72 שעות לאחר ההדבקה, הביולומינציה של לוקס BCG החלה לרמה, מה שמצביע על הקמת זיהום מתמשך.

במערכת זיהום מסוימת זו, יחס ה-vivo של RLU ו- CFU נע בין 2:1 ל- 5:1 עם ממוצע של 4:1 במהלך 168 שעות. במהלך ההזרקה, זכרו לאבטח את הזחלים כך שהסיכון של התהזנה יתר ממוזער. ניקוב מקרי של המעיים עלול להוביל לתמותה מוגברת.

על ידי ביצוע ניתוח היסטופתולוגי, הקדמה של mycobacteria עם התאים המארחים ניתן לדמיין. ניתוח תעתיק נוסף יכול לחשוף את האינטראקציה ברמה הגנומית. השימוש במודל זיהום זה עשוי לאפשר בדיקה מהירה של מועמדים לתרופות חדשניות בשלב מוקדם בפיתוח, מה שמקטין באופן משמעותי את מספר בעלי החיים המשמשים להקרנת סמים.

מודל זיהום זה דורש שימוש במזרק, אשר יכול להיות קשור לפציעה מקל מחט. אנו ממליצים על השימוש בטכניקת ההזרקה שלנו כדי למזער את הסיכון הזה.