עבודה זו מומנה (בחלקו) על ידי הלמהולץ ברית ICEMED - ההדמיה וריפוי מחלות מטבוליות הסביבה, באמצעות קרן היוזמה והרשת של הלמהולץ האיגוד, מענק מKroener-Fresenius הקרן אחרת, ומענק מForschungsgemeinschaft דויטשה ( SFB 655: תאים לרקמות).

העבודה שומרת על מגילת Helsinski והצהרת בעלי החיים ארוו. בעלי חיים המשמשים לאיסוף רקמות וכל השיטות הרלוונטיות היו במעקב על פי ההנחיות של מתקן בעלי החיים באוניברסיטת דרזדן. בעלי חיים טופלו ושוכנו על פי ההנחיות פדרלי הגרמנית לשימוש וטיפול בבעלי חיים במעבדה, והמחקר אושר על ידי דרזדן Landesdirektion. נא להתייעץ עם המדיניות של המוסד שלך וטרינרים (IACUC או לוח אחר) אודות המתודולוגיה המתת חסד מתאימה. ניתן למצוא מניות ספציפיות וריכוזים של חומרים כימיים עבודה בלוחות מגיב מלווים בפרוטוקול זה. 1. הכנת צלחת תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנות מעילים עם נפח מספיק של 75 מיקרוגרם / מיליליטר פולי-L-ornithine (כלומר 2 / טוב מיליליטר של צלחת 6 היטב) לילה בחממת תרבות תא 2 ימים לפני המועד המתוכנן לנתיחה. </li><li&gt; לשאוב פולי-L-ornithine למחרת ולשטוף היטב כל אחד 2x עם 3 מיליליטר של PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את לשטוף הסופי, ולאחר מכן להוסיף פיברונקטין (בדילול 1:250, 4 מיקרוגרם / מיליליטר PBS) לצלחת ומניח את הכלים באינקובטור במשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב פיברונקטין ביום לנתיחה ולשטוף את הכלים 2X עם PBS. החזר את הצלחות עדיין מכילות PBS הסופי לשטוף לחממה עד הרקמה ניתק מוכנה לculturing. באותו זמן, להסיר את PBS לפני ציפוי הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות חנות מצופות פולי-L-ornithinein החממה לתקופה של עד 3 שבועות. צלחות מצופים פיברונקטין יכולות להיות מאוחסנות במשך שבוע עד 1. ציפוי פיברונקטין יכול להיעשות קטן כמו 2 שעות אם דחוף. פיברונקטין הוא רגיש denaturation; לא להתסיס את הפתרון, או שמנות להתייבש. </li></ol> 2. נתיחה / ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה חל על השימוש של 3 חולדות מבוגרים (3-6 חודשים של גיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;ילl מוח חתך בלוק על קרח לפני והרדמת חסד החולדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צינור פלקון 15 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר של מדיום N2 עם bFGF הוסיף על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החולדות על פי מדיניות וטרינרי המוסד שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח מהגולגולת על ידי ביצוע חתך את קו האמצע של הראש. שימוש במלקחיים כדי לקלף את העצם ומאפשר למוח להיות מופק בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המוח לתוך צלחת פטרי המכילה 10 סנטימטר קר כקרח PBS. זו תסיר את כל שיער ודם שיורית. (איור 1 א) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המוח לבלוק חתך הצונן. (איור 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס סכין גילוח הנקי חדש אחד לבלוק כמו בתמונה באיור 1 ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס הזנב מ&quot;מ שני גילוח נקי להב 3 לראשון כפי שמודגם באיור 1D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רם בזהירות את הלהבים מהבלוק, לוקח איתם את החלק של ריבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהלוכה שניותtion את הלהב על ידי טבילתו בPBS. (איור 1E) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת קציר מהאזור של עניין (בדוגמא זו השתמשנו בהשליך קדמי, (ACA הקדמי), איור 1F) באמצעות # 5 מלקחיים ולאסוף לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מכיל בינוני N2 1 מיליליטר המכיל bFGF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצינור לתוך מכסה המנוע הזרימה למינרית תרבות תא, בהמשך לשאר הפרוטוקול בתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכאני לנתק את הרקמות באמצעות פיפטה קצה מיליליטר 1 המצורף לpipettor P1000. כמה פעמים פיפטה מעלה ומטה (כ 20x בשיעור של מחזור pipetting 1 לשנייה) תוך כדי לחיצה על הפתיחה של קצה פיפטה נגד החלק התחתון של צינור חרוטי (איורים 1G 1-3). תפסיק טחינה דקה כאשר הפתרון הופך להיות הומוגנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הפתרון לשבת במשך 2 דקות, כדי לאפשר את כל רקמת nondissociated גדולה יותר כדי ליישב לתחתית. (איור 1G 4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף homogensupernatant eous ומקום לתוך צינור חרוטי המכיל 8.5 מיליליטר של תקשורת N2 תוספת 20 bFGF ng / ml, 500 Dll4 מיליליטר / ng, 500 ng / ml Ang2, ו200 nMJAK מונעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת אותם ל 3 בארות של צלחת 6 היטב באמצעות 3 מיליליטר של תמיסה מדוללת תא / כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת לתוך תא חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 5% O 2. </li></ol> 3. טיפול יומי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום על מנות התרבות עם N2 בינוני מכילות bFGF, Ang2, Dll4, וJAK מעכב 24 שעות לאחר ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף בולוס של bFGF, Dll4, Ang2, ומעכב JAK ביום שלמחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך בתהליך מתחלף זה של שינויים בתקשורת ותוספות גורם עבור סכום כולל של 10-14 ימים. </li></ol> 4. אינדוקציה של בידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסגת bFGF, Dll4, Ang2, ומעכב JAK מכיל בינוני ולהחליף אותו עם מדיום N2 שאינו מכיל גורמים נוספים בכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המדיום כל יום שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים לאחר 10 ימים ולבצע immunocytochemistry. </li></ol> 5. איתור Immunocytochemical <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום ולתקן צלחות תרבית תאים עם 2 מיליליטר של paraformaldehyde 4% עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2x עם 3 מיליליטר של PBS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS, אז permeabilize ולחסום את התאים על ידי הוספת 2 מיליליטר של PBS המכיל 5% בסרום נורמלי חמור (NDS) ו0.1% טריטון X-100 עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת הנוגדן העיקרית PBS המכילה 5% של NDS. נוגדן אנטי nestin יכול לשמש לזיהוי SCS, תוך Tuj1 (כיתה השלישית β-טובולין), ניתן להשתמש בם נוגדני GFAP, וCNPase יחד לצביעה משולשת של סמני בידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון החסימה ולהוסיף 1.5 מיליליטר של תערובת הנוגדן הראשונית היטב כל אחד. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוגדנים הראשוניים ולשטוף 2x עם 3 מיליליטר של PBS, ו1X עם 3 מיליליטר של PBS המכיל 5% NDS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Preparדואר הנוגדנים משני בPBS המכילים 5% של NDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את לשטוף הסופי ולהוסיף 1.5 מיליליטר של פתרון נוגדנים משני היטב כל אחד. דגירה בחושך במשך 40 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון נוגדנים משני ולהוסיף 2 מיליליטר של כתם DAPI מוכן טרי (500 / מיליליטר ng PBS). דגירה במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון DAPI לאחר מכן לשטוף 3x עם 3 מיליליטר של PBS במשך 5 דקות כל אחד. כעת ניתן דמיינו התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol>

<ol>
	<li>Cajal, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comparative Study of Sensory Areas of the Human Cortex. , (1899).</li><li>Altman, J., Das, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+and+histological+evidence+of+postnatal+hippocampal+neurogenesis+in+rats.">Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats.</a> J. Comp. Neurol. 124, 319-335 (1965).</li><li>Kaplan, M. S., Hinds, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+adult+rat:+electron+microscopic+analysis+of+light+radioautographs.">Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs.</a> Science. 197, 1092-1094 (1977).</li><li>Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+in+adulthood.">Neuronal replacement in adulthood.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 457, 143-161 (1985).</li><li>Gould, E., Reeves, A. J., Graziano, M. S., Gross, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+neocortex+of+adult+primates.">Neurogenesis in the neocortex of adult primates.</a> Science. 286, 548-552 (1999).</li><li>Kornack, D. R., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuation+of+neurogenesis+in+the+hippocampus+of+the+adult+macaque+monkey.">Continuation of neurogenesis in the hippocampus of the adult macaque monkey.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5768-5773 (1999).</li><li>Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogeneity+of+adult+neural+stem+cells+and+the+emerging+complexity+of+their+niche.">The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 357-365 (2008).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricted+proliferation+and+migration+of+postnatally+generated+neurons+derived+from+the+forebrain+subventricular+zone.">Restricted proliferation and migration of postnatally generated neurons derived from the forebrain subventricular zone.</a> Neuron. 11, 173-189 (1993).</li><li>Lendahl, U., Zimmerman, L. B., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+stem+cells+express+a+new+class+of+intermediate+filament+protein.">CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein.</a> Cell. 60, 585-595 (1990).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neural+precursors+in+the+adult+brain+rescues+injured+dopamine+neurons.">Targeting neural precursors in the adult brain rescues injured dopamine neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13570-13575 (2009).</li><li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+dentate+subgranular+zone+and+rostral+subventricular+zone+after+focal+cerebral+ischemia+in+the+rat.">Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4710-4715 (2001).</li><li>Zhang, R. L., Zhang, Z. G., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+and+neurogenesis+in+the+subventricular+zone.">Ischemic stroke and neurogenesis in the subventricular zone.</a> Neuropharmacology. 55, 345-352 (2008).</li><li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+are+MSCs+therapeutic?+New+data:+new+insight.">Why are MSCs therapeutic? New data: new insight.</a> J. Pathol. 217, 318-324 (2009).</li><li>Goldman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor+cell-based+therapy+of+the+human+central+nervous+system.">Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system.</a> Nat. Biotechnol. 23, 862-871 (2005).</li><li>Sun, N., Longaker, M. T., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS+cell-based+therapy:+considerations+before+clinical+applications.">Human iPS cell-based therapy: considerations before clinical applications.</a> Cell Cycle. 9, 880-885 (2010).</li><li>Amariglio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-derived+brain+tumor+following+neural+stem+cell+transplantation+in+an+ataxia+telangiectasia+patient.">Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient.</a> PLoS Med. 6, e1000029 (2009).</li><li>Lindvall, O., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapeutics+in+Parkinson's+disease.">Cell therapeutics in Parkinson's disease.</a> Neurotherapeutics. 8, 539-548 (2011).</li><li>Kittappa, R., Bornstein, S. R., Androutsellis-Theotokis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+eNSCs+in+Neurodegenerative+Disease.">The Role of eNSCs in Neurodegenerative Disease.</a> Mo.l Neurobiol. , (2012).</li><li>Cattaneo, E., McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+manipulating+neuronal+stem+cells.">Identifying and manipulating neuronal stem cells.</a> Trends Neurosci. 14, 338-340 (1991).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).</li><li>Duarte, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosage-sensitive+requirement+for+mouse+Dll4+in+artery+development.">Dosage-sensitive requirement for mouse Dll4 in artery development.</a> Genes Dev. 18, 2474-2478 (2004).</li><li>Maisonpierre, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2,+a+natural+antagonist+for+Tie2+that+disrupts+in+vivo+angiogenesis.">Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis.</a> Science. 277, 55-60 (1997).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+regulates+stem+cell+numbers+in+vitro+and+in+vivo.">Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo.</a> Nature. 442, 823-826 (2006).</li><li>Alderson, R. F., Alterman, A. L., Barde, Y. A., Lindsay, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+increases+survival+and+differentiated+functions+of+rat+septal+cholinergic+neurons+in+culture.">Brain-derived neurotrophic factor increases survival and differentiated functions of rat septal cholinergic neurons in culture.</a> Neuron. 5, 297-306 (1990).</li><li>Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+factors+direct+the+differentiation+of+stem+cells+from+the+fetal+and+adult+central+nervous+system.">Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system.</a> Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).</li><li>Ourednik, J., Ourednik, V., Lynch, W. P., Schachner, M., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+display+an+inherent+mechanism+for+rescuing+dysfunctional+neurons.">Neural stem cells display an inherent mechanism for rescuing dysfunctional neurons.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1103-1110 (2002).</li><li>Ryu, J. K., Cho, T., Wang, Y. T., McLarnon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+cells+attenuate+inflammatory+reactivity+and+neuronal+loss+in+an+animal+model+of+inflamed+AD+brain.">Neural progenitor cells attenuate inflammatory reactivity and neuronal loss in an animal model of inflamed AD brain.</a> J. Neuroinflammation. 6, 39 (2009).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+factors+stimulate+growth+of+adult+neural+stem+cells.">Angiogenic factors stimulate growth of adult neural stem cells.</a> PLoS One. 5, e9414 (2010).</li><li>Park, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hes3+regulates+cell+number+in+cultures+from+glioblastoma+multiforme+with+stem+cell+characteristics.">Hes3 regulates cell number in cultures from glioblastoma multiforme with stem cell characteristics.</a> Sci. Rep. 3, 1095-1010 (2013).</li><li>Poser, S. W., Shostak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+5.">Ch. 5.</a> Cancer Stem Cells - The Cutting. , 89-110 (2011).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., Rueger, M. A., Mkhikian, H., Korb, E., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+controlling+neural+stem+cells+slow+progressive+brain+disease.">Signaling pathways controlling neural stem cells slow progressive brain disease.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 403-410 (2008).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

רבים מהשלבים קריטיים לבידוד מוצלח, הרחבה, והתמיינות של תאי גזע עצביים מהמוח הבוגר משותפים במשותף עם טכניקות תרבות תקן רקמות. המטרה לזכור היא שNSCs מבודד מהמוח המבוגר צריך לשמור על כמה שיותר מin vivo המאפיינים שלהם ככל האפשר (איור 2J). לעתים קרובות איזון בין זה?...

הדוגמה המרכזית לנוירוביולוגיה, שנקבעה על ידי התצפיות הבסיסיות של cytoarchitecture המוח שנעשה על ידי רמון קחל י &#39;לפני למעלה ממאה שנים, קבעה כי נוירוגנזה הייתה סבירה לאחר גיל ההתבגרות בהתחשב במורכבות של הרשתות עצביות שנמצאו במערכת העצבים המרכזית 1. למרות עבודתו של אלטמן ב1960s, ומאוחר יותר קפלן, הוכחת כי 3 H-תימידין אפשר היה לציין בתאים בוגרים מצביעים על כך שלמעשה היו נוירונים שנוצרו באזורים שונים של המוח הבוגר, הדוגמה המשיכה להחזיק 2, 3. ראיות המשיכו לעלות עם המחקר של Nottebohm המתאר את השינויים העונתיים במספר הנוירונים במוח של ציפור השיר נוכחי 4. זה לא היה עד 1999, כאשר גולד ואח&#39; עבודה. פורסם על הדור של נוירונים בהיפוקמפוס העליות עם הביצועים של משימות למידה אסוציאטיביות בחולדה, כמו גם התצפיות של הפגנות Kornack וRakicטינג המשיך נוירוגנזה במקוק המבוגר שהקונספט של מוח פחות נוקשה, פלסטיק יותר, הוכר 5, 6. החיפוש אחר המקור הסלולרי לדה נובו הנוירונים שנוצרו אלה להוביל לגילוי של אוכלוסייה נפרדת של תאי גזע (SCS) שמתגוררות באזורים במוח המכונה נישות 7. אזור subventricular והאזור גרעיני תת של ההיפוקמפוס נחשבים לשני האזורים העיקריים נוירוגנית 8,9. תאים מבודדים ממקומות אלה להציג את המאפיין הקלאסי של SCS נגזר עוברי או עוברי, התחדשות עצמית ואת פוטנציאל התמיינות. במקרה של תאי גזע עצביים (NSCs), הם יכולים להיות מובחנים לנוירונים, האסטרוציטים, וoligodendrocytes. בנוסף, SCS אלה להכתים חיוביים לסמני NSC עובריים כגון nestin חלבון נימה ביניים 10. עבודה מאוחרת יותר מדגישה כי SCs לא יכול להיות מוגבלת לאלה לאוו האזורים, והם למעשה מקומיים בכל רחבי המוח כאוכלוסייה במידה רבה שקטה של תאים בחוזקה הקשורים לכלי הדם 11. התצפיות שSCs מגויסים בתגובה לפציעה מציעה את האפשרות של להיות מסוגלים לנצל את התאים האלה למטרות משובי כדי לסייע בהחלמה מההפרעה ושבץ 12, 13 ניווניות. זה לא בניגוד לתפקיד שתאי גזע mesenchymal (MSCs) לשחק בריפוי של רקמות חיבור, אשר נמצא כתאי perivascular שיש לו את הפוטנציאל להפוך לosteoblasts, כונדרוציטים, ותאי שומן 14. עם זאת, לא יכול להיות שנקטפו NSCs באותו אופן כמו MSCs ממח עצם על ידי שאיפה שגרתית וטכניקות צנטריפוגה שיפוע צפיפות ומנוצל לאחר מכן בטיפולים בתאים מבוססים עצמיים. כתוצאה מכך, מקורות אחרים של תאים, כגון השימוש בNSCs העוברי או מבשרים עצביים הנגזר מEMBתאי גזע ryonic נחקרו בהרחבה במחלות בעלי חיים ומודלי פציעה בדרגות שונות של הצלחה 15 של. טכנולוגיות תא גזע pluripotent מושרה ניצול מקורות תא סומטי להציע עוד שדרת פוטנציאל לייצור טיפולים מבוססי תאים שימושיים טיפולית למגוון רחב של יישומים, להתגבר על הזמינות המוגבלת ודאגות אתיות בנוגע לשימוש בתאים עובריים וברקמות עובריות 16. עם זאת, תרגום קליני של ממצאים אלה הוכיח להיות משימה קשה, כפי שמודגם במאבקים של טיפול במצבים נוירולוגיים שונים עם טיפול מבוסס-SC גישות 17,18, כמו גם במסלול מפותל לאישור רגולטורים. כגישה חלופית, הקדמה של טיפולים תרופתיים ספציפיים יכולה לווסת את מספרי המל&quot;ל ולהקל על התאוששות במודלים של המחלה ושבץ 19 פרקינסון. לא משנה מה האסטרטגיה יכולה להיות, הבנה כיצד לתפעל ביעילות את התאים האלהדורש מערכת נגישה במבחנה. תרבויות של NSCs יכולות להתבצע גם כתרבויות כוללת, הידוע גם neurospheres, או כmonolayer 8,20. שני הטכניקות היו בשימוש נרחב, המאפשרות את הקמתה של תנאים מוגדרים תרבות, כלומר שימוש בעוריות Growth Factor (EGF) או בסיסי פיברובלסטים Growth Factor (bFGF) כמקור mitogen, המספקים להרחבה של מבשרי multipotent. בעוד תרבויות neurosphere עשויות להיות מתאימות יותר ללימוד יכולת התפשטות משובט של סוג תא מבודד, המערכת הוכח לייצר אוכלוסייה מעורבת של תאים במהלך התרחבות 21. בנוסף, המבנה הסגור של neurospheres עושה מניפולציה תרופתית של התאים לא מעשית, ואת הפרשנות של ההשפעה עשויים להיות גורמים אלה יכול להיות מבולבל בשל microenvironment הוקם בתוך neurosphere עצמו. תרבויות חד שכבתי, לעומת זאת, יכולות להיותמועסק במסכי תפוקה גבוהה של ספריות מולקולה קטנות, המספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את מנגנוני העברת אותות המווסתים את הגדילה והתמיינות SC ופותח את ההזדמנות לגלות תרכובות רומן שמתמקדים אוכלוסיית תא זה. כתוצאה מכך, את היכולת ליצור reproducibly תרבויות של NSCs המבוגר מאזורים השונים של עניין במוח יכולה לשמש במגוון רחב של יישומי מחקר, החל ממחקרים התפתחותיים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) לחקר גישות רפואת רגנרטיבית רומן . הפרוטוקול המובא כאן ממחיש כיצד לנתח ולהעריך את פוטנציאל ההתמיינות של SCS CNS מבודד מהמוח המכרסם המבוגר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">6-well tissue culture dishes</td>
			<td style="width:95px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">353934</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="190" rowspan="1" style="height:190px;width:216px;">Poly-L-ornithine</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">P-3655</td>
			<td style="width:167px;">
			5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 &#176;C).
			Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 &#176;C).
			</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:95px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">1030-Fn</td>
			<td style="width:167px;">Do not agitate stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Filtration Apparatus</td>
			<td style="width:95px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">430769</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:95px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">10-090-CV</td>
			<td style="width:167px;">See note below for complete N2 media preparation</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Apo-transferrin</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T-2036</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I-0516</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:216px;">Putrescine</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-5780</td>
			<td style="width:167px;">1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 &#176;C for 6 months)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:216px;">Sodium Selenite</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S-5261</td>
			<td style="width:167px;">500 &#181;M stock solution in ddH2O (Stable at -20 &#176;C for 6 months)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Progesterone</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-8783</td>
			<td style="width:167px;">100 &#181;M stock solution in ethanol (Stable at -20&#176;C for 6 months)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:95px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:95px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td>
			<td style="width:95px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">233-FB</td>
			<td style="width:167px;">Working concentration 20 ng/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Delta4 (Dll4)</td>
			<td style="width:95px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">1389-D4</td>
			<td style="width:167px;">Working concentration&#160; 500 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Angiopoetin 2 (Ang2)</td>
			<td style="width:95px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">623-AN</td>
			<td style="width:167px;">Working concentration&#160; 500 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">JAK Inhibitor</td>
			<td style="width:95px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">420099</td>
			<td style="width:167px;">Working concentration 200 nM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A-2058</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">15- and 50-ml Conical tubes</td>
			<td style="width:95px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">430053, 430829</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="243">
			<td colspan="4" height="243" style="height:243px;width:596px;">Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 &#176;C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 &#956;l of putrescine, 30 &#956;l of sodium selenite, 100 &#956;l of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.&#160; Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 &#176;C for up to 3 weeks and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Immunofluorescence Reagents Table</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:95px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D-9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D-8417</td>
			<td style="width:167px;">5 mg/ml stock solution in methanol</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Primary Antibody Table</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="1" style="height:43px;width:216px;">Nestin</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">Chemicon</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">MAB353</td>
			<td style="width:167px;">
			Dilution Factor: 1:400
			Species: Mouse IgG1
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="1" style="height:43px;width:216px;">Hes3</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">Santa Cruz</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">sc-25393</td>
			<td style="width:167px;">
			Dilution Factor: 1:100
			Species: Rabbit IgG
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="1" style="height:43px;width:216px;">Sox2</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">R&#38;D Systems</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">MAB2018&#160;</td>
			<td style="width:167px;">
			Dilution Factor: 1:100
			Species: Mouse IgG2a
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="1" style="height:43px;width:216px;">CNPase</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">Chemicon</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">MAB326</td>
			<td style="width:167px;">
			Dilution Factor: 1:200
			Species: Mouse IgG1
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="1" style="height:43px;width:216px;">&#946;-tubulin III (TUJ1)</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">R&#38;D Systems</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">MAB1195</td>
			<td style="width:167px;">
			Dilution Factor: 1:500
			Species: Mouse IgG2a
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="1" style="height:43px;width:216px;">Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">Dako North America</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">Z0334</td>
			<td style="width:167px;">
			Dilution Factor 1:500
			Species: Rabbit
			</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Secondary Antibody Table</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="1" style="height:64px;width:216px;">Alexa&#160;&#160; 568</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">Invitrogen</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">A-21124</td>
			<td style="width:167px;">
			Dilution Factor: 1:200
			Species: Goat anti Mouse IgG1
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="1" style="height:64px;width:216px;">Alexa 488</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">Invitrogen</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">A-21131</td>
			<td style="width:167px;">
			Dilution Factor: 1:200
			Species: Goat anti Mouse IgG2a
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="1" style="height:64px;width:216px;">Cy5</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">59883</td>
			<td style="width:167px;">
			Dilution Factor: 1:200
			Species: Goat anti Rabbit
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growing neural stem cells from conventional and nonconventional regions of the adult rodent brain

מחקר שנערך לאחרונה מוכיח כי מערכת עצבים מרכזית התחדשות (CNS) וtumorigenesis כרוך אוכלוסיות של תאי גזע (SCS) תושב בתוך המוח הבוגר. עם זאת, מנגנוני תאים בדרך כלל שקטים אלה מעסיקים על מנת להבטיח תפקוד תקין של רשתות עצביות, כמו גם את תפקידם בהחלמה מפציעה וההפחתה של תהליכי ניוון עצבי הם הבינו מעט. תאים אלה מתגוררים באזורים המכונים &quot;נישות&quot; המספקות סביבה תומכת מעורבת אותות ויסות משני כלי הדם ומערכת חיסונית. הבידוד, התחזוקה, והבידול של SCS במערכת העצבים המרכזית בתנאי תרבות מוגדרים שלא לכלול גורמים לא ידועים, הופכים אותם נגיש לטיפול באמצעים תרופתיים או גנטיים, ובכך לספק תובנות על התנהגות in vivo שלהם. כאן אנו מציעים מידע מפורט על השיטות להפקת תרבויות של SCS מערכת העצבים המרכזית מאזורים שונים של המוח המבוגר וגישות להערכת דפוטנציאל ifferentiation לנוירונים, האסטרוציטים, וoligodendrocytes במבחנה. טכניקה זו מניבה אוכלוסיית תאים הומוגנית כתרבות monolayer שיכול להיות דמיינו ללמוד SCs פרט וצאצאיהם. יתר על כן, ניתן להחיל אותו על פני מערכות מודל של בעלי החיים שונות ודגימות קליניות, שהשתמש בעבר כדי לחזות את תגובות משובי במערכת העצבים למבוגרים הפגועה.

זיהוי האזור של עניין שממנו לקצור תאי גזע עצביים הוא הצעד הראשון הקריטי ויגדיר את משך זמן שנדרש כדי לקבל צלחת ומחוברות של תאים. לדוגמא, SVZ הוא אזור נוירוגנית קלאסי ולכן יש חלקם יחסי גבוה יותר של תאי גזע עצביים. עם זאת, הטכניקה שהוצגה כאן ניתן להשתמש באזורים אחרים לא לעתי...

Watch this Scientific Journal Video about Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain at JoVE.com

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

תאי גזע עצביים שנקטפו מהמוח הבוגר מתרבים מנוצלים ביישומים החל המחקר הבסיסי של התפתחות מערכת עצבים לחקור יישומים קליניים פוטנציאליים ברפואת רגנרטיבית. זה הופך את השליטה קפדנית בתנאי הבידוד וculturing משמשים לגידול תאים אלה קריטיים להישמע תוצאות ניסוי.

גידול בתאי גזע עצבי מאזורים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים של המוח מכרסם מבוגרים

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

growing-neural-stem-cells-from-conventional-nonconventional-regions

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.1K Views.  University of Dresden.  תאי גזע עצביים שנקטפו מהמוח הבוגר מתרבים מנוצלים ביישומים החל המחקר הבסיסי של התפתחות מערכת עצבים לחקור יישומים קליניים פוטנציאליים ברפואת רגנרטיבית. זה הופך את השליטה קפדנית בתנאי הבידוד וculturing משמשים לגידול תאים אלה קריטיים להישמע תוצ?...

Video: Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These animals also resist ischemic injury to the brain in vivo 2,3 and oxygen-glucose deprivation in vitro 4,5. These unique qualities provided the impetus to isolate AGS neurons to examine inherent neuronal characteristics that could account for the capacity of AGS neurons to resist injury and cell death caused by ischemia and extremely cold temperatures. Identifying proteins or gene targets that allow for the distinctive properties of these cells could aid in the discovery of effective therapies for a number of ischemic indications and for the study of cold tolerance. Adult AGS hippocampus contains neural stem cells that continue to proliferate, allowing for easy expansion of these stem cells in culture. We describe here methods by which researchers can utilize these stem cells and differentiated neurons for any number of purposes. By closely following these steps the AGS neural stem cells can be expanded through two passages or more and then differentiated to a culture high in TUJ1-positive neurons (~50%) without utilizing toxic chemicals to minimize the number of dividing cells. Ischemia induces neurogenesis 6 and neurogenesis which proceeds via MEK/ERK and PI3K/Akt survival signaling pathways contributes to ischemia resistance in vivo7 and in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., in preparation). Further characterization of these unique neural cells can advance on many fronts, using some or all of these methods.

Neural stem cells were prepared from the hippocampus of adult non-hibernating yearling Arctic ground squirrels (AGS). These neural stem cells can be expanded through numerous passages, differentiated and maintained as a nearly 50:50 neuron to glial culture.

גדילה והתמיינות של מבוגרים בהיפוקמפוס סנאי הארקטי קרקע תאים גזע עצביים

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

מיון תא של תאי גזע ועצביים ממבוגרי עכבר Subventricular האזור וחי-הדמיה של Dynamics תא המחזור שלהם

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions in the immature and adult brain. Here we describe a zinc histochemical staining procedure that reveals differences in staining patterns among different layers and brain regions. Others have utilized this procedure not only to reveal the distribution of zinc-containing neurons and circuits in the brain, but also to successfully delineate areal and laminar boundaries in the developing and adult brain in several species. Here we illustrate this staining procedure with images from developing and adult ferret brains. We reveal a zinc-staining pattern that serves as an anatomical marker of areas and layers, and can be reliably used to distinguish visual cortical areas in the developing and adult visual cortex. The main goal of this protocol is to present a histochemical method that allows the accurate identification of layers and regions in the developing and adult brain where other methods fail to do so. Secondarily, in conjunction with densitometric image analysis, this method allows one to assess the distribution of synaptic zinc to reveal potential changes throughout development. This protocol describes in detail the reagents, tools, and steps necessary to successively stain frozen brain sections. Although this protocol is described using ferret brain tissue, it can easily be adapted for use in rodents, cats, or monkeys as well as in other brain regions.

We describe a histochemical procedure that reveals characteristic laminar and areal zinc staining patterns in different brain regions. The zinc-staining pattern may be used in conjunction with other anatomical markers to reliably distinguish layers and regions in the developing and adult brain.

השימוש להסטולוגיה אבץ סינפטית כדי לחשוף אזורים שונים שנבזזו במוח המתפתח, למבוגרים

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex (mPFC) or nucleus accumbens. The challenge in this work is to dissect the correct area while preserving the microenvironment to be examined. In this paper, we describe a simple, low-cost method using resources readily available in most labs. This method preserves nucleic acid and proteins by keeping the tissue frozen throughout the process. Brains are cut into 0.5&#8211;1.0 mm sections using a brain matrix and arranged on a frozen glass plate. Landmarks within each section are compared to a reference, such as the Allen Mouse Brain Atlas, and regions are dissected using a cold scalpel or biopsy punch. Tissue is then stored at -80 &#176;C until use. Through this process rat and mouse mPFC, nucleus accumbens, dorsal and ventral hippocampus and other regions have been successfully analyzed using qRT-PCR and Western assays. This method is limited to brain regions that can be identified by clear landmarks.

This procedure describes the collection of discrete frozen brain regions to obtain high-quality protein and RNA using inexpensive and commonly available tools.

אוסף של אזורים קפואים המוח מכרסם עבור ניתוח במורד הזרם

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

משלוח פנים-עורקי של תאי גזע עצביים למוח עכברוש ועכבר: יישום איסכמיה מוחין

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...