Name: Video: Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices
Uploaded: 2014-01-14T14:15:00
Duration: 13 min 32 s

מחקר זה ממומן על ידי מערכת אירובית-ריאתי אשכול מצוינות.

<ol>
	<li>Weissmann, N., Akkayagil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+features+of+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+in+mice.">Basic features of hypoxic pulmonary vasoconstriction in mice.</a> Respir. Physiol. Neurobiol. 139, 191-202 (2004).</li><li>Leach, R. M., Hill, H. M., Snetkov, V. A., Robertson, T. P., Ward, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+roles+of+glycolysis+and+the+mitochondrial+electron+transport+chain+in+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+of+the+rat:+identity+of+the+hypoxic+sensor.">Divergent roles of glycolysis and the mitochondrial electron transport chain in hypoxic pulmonary vasoconstriction of the rat: identity of the hypoxic sensor.</a> J. Physiol. 536, 211-224 (2001).</li><li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation.">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> J. Appl. Physiol. 104 (2), 338-3346 (2008).</li><li>Sylvester, J. T., Shimoda, L. A., Aaronson, P. I., Ward, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+pulmonary+vasoconstriction.">Hypoxic pulmonary vasoconstriction.</a> Physiol. Rev. 92 (1), 367-520 (2012).</li><li>Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+cell+hypoxia:+role+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+signaling+in+triggering+responses.">Lung cell hypoxia: role of mitochondrial reactive oxygen species signaling in triggering responses.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 8 (6), 477-4784 (2011).</li><li>Paddenberg, R., K&#246;nig, P., Faulhammer, P., Goldenberg, A., Pfeil, U., Kummer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+vasoconstriction+of+partial+muscular+intra-acinar+pulmonary+arteries+in+murine+precision+cut+lung+slices.">Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices.</a> Respir. Res. 29 (7), 93-109 (2006).</li><li>Paddenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+complex+II+is+essential+for+hypoxia-induced+pulmonary+vasoconstriction+of+intra-+but+not+of+pre-acinar+arteries.">Mitochondrial complex II is essential for hypoxia-induced pulmonary vasoconstriction of intra- but not of pre-acinar arteries.</a> Cardiovasc. Res. 93 (4), 702-710 (2012).</li><li>Wang, L., Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+requires+connexin+40-mediated+endothelial+signal+conduction.">Hypoxic pulmonary vasoconstriction requires connexin 40-mediated endothelial signal conduction.</a> J. Clin. Invest. 122 (11), 4218-4230 (2012).</li><li>Archer, S. L., Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+distribution+of+electrophysiologically+distinct+myocytes+in+conduit+and+resistance+arteries+determines+their+response+to+nitric+oxide+and.">Differential distribution of electrophysiologically distinct myocytes in conduit and resistance arteries determines their response to nitric oxide and.</a> 78, 431-442 (1996).</li><li>Yamaguchi, K., Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+intra-acinar+pulmonary+microvessels+to+hypoxia,+hypercapnic+acidosis,+and+isocapnic+acidosis.">Response of intra-acinar pulmonary microvessels to hypoxia, hypercapnic acidosis, and isocapnic acidosis.</a> Circ. Res. 82, 722-728 (1998).</li><li>Bennie, R. E., Packer, C. S., Powell, D. R., Jin, N., Rhoades, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+contractile+response+of+pulmonary+artery+to+hypoxia.">Biphasic contractile response of pulmonary artery to hypoxia.</a> Am. J. Physiol. 261(2 Pt. 1, 156-163 (1991).</li><li>Glazier, J. B., Murray, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sites+of+pulmonary+vasomotor+reactivity+in+the+dog+during+alveolar+hypoxia+and+serotonin+and+histamine+infusion).">Sites of pulmonary vasomotor reactivity in the dog during alveolar hypoxia and serotonin and histamine infusion).</a> J. Clin. Invest. 50 (12), 2550-2558 (1971).</li><li>Bhattacharya, J., Staub, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+microvascular+pressures+in+the+isolated+perfused+dog+lung.">Direct measurement of microvascular pressures in the isolated perfused dog lung.</a> Science. 210, 327-328 (1980).</li><li>Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+assessment+of+pulmonary+vascular+responses.">Real-time imaging assessment of pulmonary vascular responses.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 8 (6), 458-4565 (2011).</li><li>Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Videomicroscopy+of+methacholine-induced+contraction+of+individual+airways+in+precision-cut+lung+slices.">Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices.</a> Eur. Respir. J. 9 (12), 2479-2487 (1996).</li><li>Grimminger, F., Spriestersbach, R., Weissmann, N., Walmrath, D., Seeger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+generation+and+hypoxic+vasoconstriction+in+buffer-perfused+rabbit+lungs.">Nitric oxide generation and hypoxic vasoconstriction in buffer-perfused rabbit lungs.</a> J. Appl. Physiol. 78, 1509-1515 (1995).</li><li>Ng, L. C., Kyle, B. D., Lennox, A. R., Shen, X. M., Hatton, W. J., Hume, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+alters+Ca2++entry+pathways+activated+by+store-depletion+or+hypoxia+in+canine+pulmonary+arterial+smooth+muscle+cells.">Cell culture alters Ca2+ entry pathways activated by store-depletion or hypoxia in canine pulmonary arterial smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294 (1), 313-323 (2008).</li><li>Fehr, D. M., Larach, D. R., Zangari, K. A., Schuler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Halothane+constricts+bovine+pulmonary+arteries+by+release+of+intracellular+calcium.">Halothane constricts bovine pulmonary arteries by release of intracellular calcium.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 277 (2), 706-713 (1996).</li><li>Oshima, Y., Ishibe, Y., Okazaki, N., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+inhibits+endothelium-mediated+nitric+oxide+relaxing+pathways+in+the+isolated+perfused+rabbit+lung.">Isoflurane inhibits endothelium-mediated nitric oxide relaxing pathways in the isolated perfused rabbit lung.</a> Can. J. Anaesth. 44 (10), 1108-1114 (1997).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulm. Pharmacol. Ther. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Replacing Animal Models: A Practical Guide to Creating and Using Culture-based Biomimetic Alternatives (Google eBook. , 57-68 (2012).</li><li>M&#252;ller-Redetzky, H. C., Kummer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermedin+stabilized+endothelial+barrier+function+and+attenuated+ventilator-induced+lung+injury+in+mice).">Intermedin stabilized endothelial barrier function and attenuated ventilator-induced lung injury in mice).</a> PLoS One. 7 (5), (2012).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique.">The Principles of Humane Experimental Technique.</a> Universities Federation for Animal Welfare. , (1959).</li><li>Held, H. D., Martin, C., Uhlig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+airway+and+vascular+responses+in+murine+lungs.">Characterization of airway and vascular responses in murine lungs.</a> Br. J. Pharmacol. 126 (5), 1191-1199 (1999).</li><li>K&#246;hler, D., Sch&#246;nhofer, B., Voshaar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumologie:+Ein+Leitfaden+f&#252;r+rationales+Handeln+in+Klinik+und+Praxis.">Pneumologie: Ein Leitfaden f&#252;r rationales Handeln in Klinik und Praxis.</a> Thieme Verlag. , 198-19 (2009).</li><li>Will, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pulmonary+Circulation.">The Pulmonary Circulation.</a> in Health and Disease. Elsevier Science, p49. , (1987).</li><li>Faro, R., Moreno, L., Hislop, A. A., Sturton, G., Mitchell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+endothelium+dependent+vasodilation+emerges+after+birth+in+mice.">Pulmonary endothelium dependent vasodilation emerges after birth in mice.</a> Eur. J. Pharmacol. 567 (3), 240-244 (2007).</li><li>Wright, J. L., Churg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+exposure+to+cigarette+smoke+induces+endothelial+dysfunction+in+small+intrapulmonary+arteries:+analysis+using+guinea+pig+precision+cut+lung+slices.">Short-term exposure to cigarette smoke induces endothelial dysfunction in small intrapulmonary arteries: analysis using guinea pig precision cut lung slices.</a> J. Appl. Physiol. 104, 1462-1469 (2008).</li></ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

ריאת העכבר המבודדת והמוזערת היא מודל מצוין לניתוח התגובה הפיזיולוגית של מערכת כלי הדם הריאה על שינויים באספקת החמצן ובין היתר מאפשרת מדידה רציפה של לחץ עורקי ריאתי1. עם זאת, מודל זה אינו מאפשר זיהוי וניתוח של מקטעי כלי דם אלה המציגים את התגובה החזקה ביותר להיפוקסיה. זהו היתרון של ניתוח videomorphometric שלנו של PCLS אשר מקל על מדידת HPV של עורקים בודדים עם קטרים פנימיים של 20-100 מיקרומטר. PCLS מייצגים מודל במבחנה אטרקטיבי שכן הם דומים מאוד לאיבר שממנו הם מוכנים. בניגוד למערכות תרבית התאים, כל סוגי התאים נמצאים בתצורת מטריצת הרקמות המקורית שלהם. יתר על כן, ריאה אחת מספיקה להכנת PCLS רבים, כך שלפחות באופן חלקי ניסויים יכולים להיות מתוקננים על ידי שימוש בקטעים מאותו עכבר. על פי מושג 3R (הפחתה, עידון והחלפה של חיות מעבדה במדעי החיים) של ראסל וברץ'23 עובדה זו טוענת גם לשימוש PCLS.
עם זאת, יש לזכור, כי הרקמה נפגעת על ידי חיתוך עם ויברטום איתות אורך למשל באמצעות תאי האנדותל כפי שהניח על ידי Kübler ואח '. 14 כבר לא אפשרי.
בתחילה, PCLS יושמו בעיקר עבור מחקרים ביוכימיים, פרמקולוגיים וטוקסיקולוגיים, אבל בינתיים הם משמשים גם למדידת התכווצות הסימפונות, תפקוד רירי ותגובות כלי דם (עבור ביקורות ראה סנדרסון20 ודיוויס21). מוחזק ואח '. ביצעו מחקר שבו הם השוו את המודלים של ריאות עכבר מבודדות ומאווררות ושל PCLS24. הם מצאו על ידי ניתוח של התגובות של דרכי הנשימה וכלי הריאות למגוון מתווכים אנדוגני כי מאפיינים חשובים של הריאה כולה נשמרו PCLS.
ב- PCLS, תנאים היפוקסיים אינם נקבעים דרך דרכי הנשימה כמו בריאה שלמה אלא על ידי דגירה של סעיף הריאות במדיום בגז היפוקסי. ניתחנו את הלחץ החלקי חמצן (pO2)של בינוני pregassed עם 1% O2, 5.3% CO2, 93.7% N2 ועם 21% O2, 5.3% CO2, 73.7% N2, בהתאמה, באמצעות מנתח גז דם. מיד לפני האכלתו לתוך תא זלוף, pO2 של MEM גז היפוקסי היה 40 מ"מ היג וזה של גז נורמוקסי בינוני 160 מ"מגרם 6.  בריאה שלמה HPV הוא המושרה כאשר pO מכתש2 טיפות מתחת 50 מ"מ-ח"ג25, מצב אשר ניתן לחקות ללא ספק על ידי יישום של מדיום בגז היפוקסי. הנתונים שלנו על היקף HPV תואמים היטב לתוצאות שהושגו בגישה ניסיונית שונה. ימגוצ'י ואח '. יש להחיל ריאות חולדה מבודדת לבחון microvessels עם קוטר של 20-30 מיקרומטר על ידי בזמן אמת confocal לייזר סריקת מיקרוסקופיה זוהר בשילוב למצלמה רגישות גבוהה עם מגבר תמונה10. הם הבחינו בירידה ממוצעת בקוטר של 2.7 מיקרומטר לאחר חשיפת הריאות להיפוקסיה. אפשר לחשב כי הפחתה של 20% של האזור הזוהר כפי שאנו מודדים אותו במערכת שלנו מתאים כ 15% ירידה בקוטר.
בניסויים שלנו סיווגנו את העורקים ככלי טרום ותוך אצ'יניאר, בהתאמה, עם קטרים פנימיים של 40-100 מיקרומטר ו 20-40 מיקרומטר. בבני אדם המעבר מעורקים שריריים לעורקים לא שריריים מתרחש בטווח הקוטר של 70-100 מיקרומטר. בעכברים, תאי שריר חלקים נמצאים עד לקוטר חיצוני של 20 מיקרומטר26. מסיבה זו לא ניתן לנתח עורקים עם קטרים מתחת 20 מיקרומטר שכן הם לא יכולים להיות אמינים להיות מזוהים בהתבסס על תמונת ניגודיות פאזה. בקצה השני של הסולם, כלי עם קטרים מעל 100 מיקרומטר הם בקושי למצוא PCLS ובדרך כלל הפשיט מן הרקמה שמסביב.
למעשה, מספר מועמדים מולקולריים נידונים כמו חיישני חמצן מולקולריים(s) או כמרכיב של מפל איתות וכתוצאה מכך HPV (לסקירה ראה סילבסטר ואח '. 4). פעם עכברי נוקאאוט מתאימים זמינים videomorphometry ניתן להשתמש לניתוח של vasoreactivity של העורקים טרום ותוך אצ'יניאר לעומת בעלי חיים מסוג בר. עם זאת, PCLS שימשו גם עבור בעיות אחרות: פארו ואח '. העסיק אותם כדי לאפיין את הפיתוח של תדרוך תלוי אנדותל בריאה לאחר הלידה29 ו PCLS מוכן שרקנים חשופים עשן או אוויר מדי יום במשך 2 שבועות שימשו כדי להדגים את ההשפעה של עשן סיגריות על vasoreactivity באמצעות אינדוקציה של תפקוד אנדותל30.
שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול
בניסויים שלנו סיווגנו את העורקים כקדם-acinar (קטרים פנימיים של 40-100 מיקרומטר) ו תוך-acinar (קטרים פנימיים של 20-40 מיקרומטר). במיוחד להכנת קטעי ריאות אשר יש להשתמש בהם לניתוח של כלי גדול יותר חשוב להוסיף נתרן nitroprusside למאגר זלוף. תרופה זו מונעת את התכווצות כלי הדם במהלך הכנת המדגם ובכך לקרוע שלהם מן הרקמה שמסביב המוביל vasodilation שלם. נתרן nitroprusside במאגר זלוף לא כל כך חשוב להכנת סעיף ריאות אשר יש להשתמש בהם לניתוח של עורקים קטנים כי הם מעוגנים בחוזקה ספטה מכתשי.
כל הניסויים צריכים להתחיל עם דגירות שבהן תגובתיות העורקים נבדקת. לעתים רחוקות, השגנו תכשירי ריאות שבהם לא ניתן היה לזהות תגובה של כלי שיט לקבלנים או ל מורחבים. אנחנו לא יודעים את הסיבה לכך: יכול להיות כי נפח של agarose מלא לתוך הריאות היה גדול מדי או נמוך מדי, כך חיתוך של האיבר לתוך PCLS לא היה אופטימלי. לחלופין, ניתן להעלות על הדעת כי agarose היה להתקרר מהר מדי במהלך הליך החדרה וכתוצאה מכך נזק ללחץ גזירה. במקרה שבמחשב PCLS בודד אין עורק בר קיימא ניתן לגילוי, יש להשליך את המקטע ולהחליף אותו בעורק אחר.
ההחלטה על הכדאיות של עורק התקבלה על סמך התגובה ל- U46619. יישום של U46619 בריכוז של 0.1 מיקרומטר גורם vasoconstriction אשר - לאחר פעילות גופנית מסוימת - גלוי ישירות ברצף התמונה על המסך. מאז יש כמה שונות vasoreactivity אנו חוקרים את ההשפעה של תרופה על HPV על ידי מדידת vasoresponse בקטעי ריאות חשופים לתרופה או למדיום לבד בתורו.
HPV של עורק בודד הוא לעתים קרובות בקושי לזיהוי במיקרוסקופ, ובממוצע זה גורם להפחתת האזור הזוהר של כ 20-30%. עם זאת, שינויים קטנים בקוטר של עורק יש קלט ברור על התנגדות זרימה. על פי המשוואה "R = 1/r4" עם R = התנגדות r = רדיוס, התנגדות הזרימה היא ביחס הפוך לכוח הרביעי של הרדיוס. תן לי לתת דוגמה: "עורק אידיאלי" המציג חתך מעגלי בקוטר של 40 מיקרומטר (r = 20 מיקרומטר) יש שטח לומינלי של כ 1,260 מיקרומטר2. כאשר האזור הזוהר מצטמצם ב -20%, אנו יכולים לחשב שקוטר הכלי מצטמצם ב -10.5% ל -35.8 מיקרומטר (r = 17.9 מיקרומטר). על פי המשוואה שניתנה לעיל, התנגדות הזרימה של כלי זה תגדל מ 6.25 x 10-6 ל 9.71 x 10-6 כי הוא על ידי כ 55%. במקרה של צמצום האזור הזוהר בכ-30% הרדיוס יקטן בכ-16%, אך עמידות הזרימה תגדל בכ-100%. למרות חישובים אלה הם פשטנות יתר שבה זרימת דם למינארית צורה של צינור נוקשה הם הניחו שזה מרמז על ההשפעה של שינויים קלים כבר של הקוטר על עמידות בפני זרימה.

ברוב מיטות כלי הדם המערכתיים היפוקסיה גורמת vasodilatation, בהשוואה vasoconstriction הנגרמת על ידי היפוקסיה בכלי הדם ריאתי. תגובה ספציפית לריאות זו להורדת מתח החמצן נקראת vasoconstriction ריאתי היפוקסי (HPV), מתחיל בתוך שניות ומתהפך במהירות לאחר מעבר לאוורור נורמוקסי. למרות HPV ידוע במשך יותר מ 60 שנים, חיישני חמצן הסלולר(s) ואת מפל איתות(s) וכתוצאה מכך vasoconstriction עדיין נמצאים בדיון. יש הסכמה רחבה יחסית כי היפוקסיה עוררה redox ושינויים ROS חיוניים עבור HPV ופיתוח יתר לחץ דם ריאתי (נבדק סילבסטר ואח '. 4 ושומאקר ואח '. 5). הנתונים שלנו תומכים בתפקיד מרכזי של COMPLEX II של שרשרת הנשימה המיטוכונדרית ב- HPV6,7. לאחרונה, וואנג ואח '. הציגו מושג חדש לחלוטין עבור חישת חמצן HPV: בהתבסס על הנתונים שלהם הם מציעים כי היפוקסיה מכתשית הוא חש על ידי נימים סמוכים גורם depolarization קרום של תאי האנדותל. התגובה מופצת באמצעות צמתים קונקסיון 40 פער של תאי אנדותל המוביל התכווצות של תאי שריר חלקים של arterioles במעלה הזרם8.
עורקי הריאה פועלים לצד דרכי הנשימה, מסתעפים איתם, מקטיןים ללא הרף את קוטרם, ולבסוף מספקים דם למערכת נימי הממוקמת בקירות מכתש. זרימת עורקים זו מורכבת ממקטעים נפרדים מבחינה אנטומית ותפקודית. עורקי הצינור הפרוקסימליים, המאופיינים בשפע של סיבים אלסטיים בקירות, מלווים בעורקים תוך-ריאתי שריריים לחלוטין השולטים במידה רבה בהתנגדות כלי הדם הריאה. צעד אחר צעד, העורקים האלה עוברים למקטעים שבהם שכבת השריר הופכת ללא שלמה, ולבסוף כלי הדם נקיים מתאים חיסוניים חלקים בשרירים. העורק התוך-סינארי המאכיל אצינוס ריאתי בודד בדם מייצג קטע שרירי חלקית6. כמו כן, מערכת עורקי הריאות אינה מייצגת מבנה אחיד לגבי התגובה ההיפוקסית, אך מציגה מגוון אזורי מסומן9,10. לדוגמה, בעורקי ריאות פרוקסימליים מבודדים מריאות חולדה היפוקסיה גורם לתגובה biphasic, המציג התכווצות מהירה ראשונית של משך זמן קצר אשר - לאחר הרפיה חלקית - ואחריו התכווצות איטית שנייה אך מתמשכת11. בעורקי התנגדות מבודדים מפרנצ'ימה ריאות חולדה כמו חלוקה רביעית וחמישית של עורקי ריאות (קוטר חיצוני <300 מיקרומטר), היפוקסיה גורמת התכווצות מונופאזית9. כבר בשנת 1971 גלזייר ומורי הגיעו למסקנה ממדידות של שינויים בריכוז תאי הדם האדומים נימי בריאות של כלבים מאווררים בתערובות גז היפוקסי כי הגידול היפוקסיה הנגרמת על ידי התנגדות כלי הדם התרחשה בעיקר במעלה הזרם של נימים12. כיום, מיקרוסקופיה תוך-וורידית של ריאות שלמות של עכברים מורדמים ומאווררים מכנית מייצגת כלי רב עוצמה לניתוח המיקרו-וסקולטורה הריאתית13,14. כריתת חלון עגול בקיר בית החזה מעניקה גישה מיקרוסקופית לפני השטח של הריאה ומאפשרת ניתוח של כלי ריאות תת-פלורליים בקוטר של עד 50 מיקרומטר. על ידי שילוב טכניקה זו עם עירוי של FITC-dextran, Tabuchi ואח '. הראה כי רק arterioles בגודל בינוני עם קטרים של 30-50 מיקרומטר התערוכה תגובה ניכרת היפוקסיה אשר נמשך על פני תקופה של 60 דקות עם הנחתה קלה לאחר 30 דקות. לעומת זאת, עורקים קטנים עם קטרים של 20-30 מיקרומטר הראו רק תגובה מינורית להיפוקסיה3. עם זאת, טכניקה זו אינה מאפשרת ניתוח של עורקים בקוטר גדול יותר כי 50 מיקרומטר מאז כלי אלה ממוקמים עמוק מדי ברקמת הריאה.
על מנת לגשר על הפער בניתוח של עורקי ריאות גדולים וקטנים מאוד (כגון כלי תת-חלל) של ריאות מורין, אימצנו שיטה שתוארה על ידי מרטין ואח '. לניתוח התגובה של דרכי הנשימה15. בהתבסס על טכניקת החדרת ג'ל אגרוז, זה מקל על הכנת פרוסות ריאות לחתוך דיוק (PCLS) מאיבר רך יחסית זה אלסטי. בתוך vasoreactivity PCLS של העורקים חתך עם קוטר פנימי בין 20-100 מיקרומטר ניתן לראות ישירות על ידי videomicroscopy. יישום של תרופות במהלך הדגירה היפוקסית של PCLS מאפשר ניתוח של ההשפעות שלהם על HPV. יש חשיבות מיוחדת כי טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על עכבר מהונדס גנטית. בהתבסס על מיקומם בתוך הריאה, אנו מסווגים את העורקים ככלי טרום ותוך אצ'יניאר, עם קטרים פנימיים של 20-40 מיקרומטר ו 40-100 מיקרומטר, בהתאמה. תחת מבט פונקציונלי העורק התוך-אצינרי מספק אצינוס ריאתי בודד עם דם ואת העורק טרום acinar הוא קטעי כלי הקודם. הקלטת תמונות במצלמה דיגיטלית מאפשרת כימות הבא של vasoreaction. תכונה ברורה של מודל PCLS זה היא חוסר גזירה מתח הפועל על אנדותל. לעומת זאת, בכלי perfused חריפה HPV מוביל לעלייה בלחץ גזירה ובכך גרימת מנגנונים משניים כגון NO RELEASE16. בנוסף, השימוש ב- PCLS מאפשר מדידות של HPV ללא השפעות עצביות או הורמונליות. בניגוד למערכות תרבית התאים, למשל מוכנות מתאי שריר חלקים עורקיים של כלבים17, הארכיטקטורה ההיסטולוגית של קיר הכלי נשמרת כמעט לחלוטין.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק שיטה מועילה לניתוח חיישני חמצן מולקולריים פוטנציאליים ו/או מסלולים תאיים האחראים על HPV של עורקים תוך-ריאתיים עם קטרים פנימיים בין 20-100 מיקרומטר בתנאים ללא לחץ גזירה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Vibratome &#34;Microm HM 650 V&#34;</td>
			<td style="width:225px;">Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Microwave oven</td>
			<td style="width:225px;">Bosch, Frankfurt, Germany</td>
			<td style="width:209px;">HMT 702C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Heating cabinet</td>
			<td style="width:225px;">Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Flow-through superfusion chamber&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Hugo Sachs Elektronik, March, Germany</td>
			<td style="width:209px;">PCLS-Bath Type: 847 SN:4017</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Upright inverted microscope equipped with 4X, 10X, 20X, and 40X objectives&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">CCD-camera&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Stemmer Imaging, Puchheim, Germany</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:216px;">Peristaltic pump Minipuls 3</td>
			<td style="width:225px;">Gilson, Limburg-Offheim, Germany</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:216px;">Water bath &#8220;Universal Wasserbad Isotem 205&#8221;</td>
			<td style="width:225px;">Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:209px;">9452450</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:216px;">Gas tight tubes Tygon R3603-13 &#160; &#160; &#160;&#216;i: 3/32 in, &#216;a: 5/32 in, wall: 1/32 in</td>
			<td style="width:225px;">VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Various scissors and forceps</td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Sewing cotton</td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2 ml Syringe&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">50 ml Syringe</td>
			<td style="width:225px;">Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;width:216px;">Flexible plastic pipe of an IV indwelling cannula &#8220;IntrocanR-W&#8221; (cannula 20 G x 1 &#188; in, 1.1 x 32 mm)</td>
			<td style="width:225px;">Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany</td>
			<td style="width:209px;">4254112B</td>
			<td style="width:167px;">For instillation of the agarose into the lung</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Cannula 21 G x 4 &#190; in; 0.8 x 120 mm</td>
			<td style="width:225px;">Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany</td>
			<td style="width:209px;">4665643</td>
			<td style="width:167px;">For bubbling of the medium</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Cannula Nr. 17, 24 G x 1, 0.55 x 25 mm&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Terumo, Eschborn, Germany</td>
			<td style="width:209px;">NN 2425 88DSF18</td>
			<td style="width:167px;">For lung perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:216px;">Normoxic gas mixture (21% O2, 5.3% CO2, 73.7% N2)</td>
			<td style="width:225px;">Linde, Hildesheim, Germany</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:216px;">Hypoxic gas mixture (1% O2, 5.3% CO2, 93.7% N2)</td>
			<td style="width:225px;">Linde, Hildesheim, Germany</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:225px;">Sigma, Deisenhofen, Germany</td>
			<td style="width:209px;">H 4034</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:225px;">Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:209px;">3957.1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:225px;">Merck, Darmstadt, Germany&#160;</td>
			<td style="width:209px;">1.04936.0500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:225px;">Merck, Darmstadt, Germany&#160;</td>
			<td style="width:209px;">1.05833.0250</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:225px;">Merck, Darmstadt, Germany&#160;</td>
			<td style="width:209px;">1.02382.0500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Glucose D-(+)</td>
			<td style="width:225px;">Sigma, Deisenhofen, Germany</td>
			<td style="width:209px;">G 7021</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Low melting point agarose&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Bio-Rad, Munich, Germany</td>
			<td style="width:209px;">161-3111</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Heparin-sodium</td>
			<td style="width:225px;">Ratiopharm, Ulm, Germany</td>
			<td style="width:209px;">5120046</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Phenolred-free minimal essential medium (MEM)</td>
			<td style="width:225px;">Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:209px;">5120046</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">70% EtOH for desinfection</td>
			<td style="width:225px;">Stockmeier Chemie, Dillenburg, Germany</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Superglue</td>
			<td style="width:225px;">UHU, B&#252;hl/Baden, Germany or from a supermarket</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">U46619 (a thromboxane analog)</td>
			<td style="width:225px;">Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:209px;">538944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sodium nitroprusside (Nipruss)</td>
			<td style="width:225px;">Schwarz Pharma, Monheim, Germany</td>
			<td style="width:209px;">5332804</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Optimas 6.5 software&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Stemmer, Puchheim, Germany</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SPSS 19</td>
			<td style="width:225px;">AskNet,&#160; Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices

היפוקסיה מכתשית חריפה גורמת vasoconstriction ריאתי (HPV) - הידוע גם בשם פון אוילר-Liljestrand מנגנון - אשר משמש כדי להתאים זלוף ריאות לאוורור. עד כה, המנגנונים הבסיסיים אינם מובנים במלואם. מגזר כלי הדם העיקרי התורם ל- HPV הוא העורק התוך-אציני. סעיף כלי זה אחראי על אספקת הדם של acinus בודדים, אשר מוגדר כחלק של דיסטל ריאות לסימפונות סופני. עורקים תוך-אצינריים ממוקמים בעיקר בחלק זה של הריאה שלא ניתן להגיע אליו באופן סלקטיבי על ידי מספר טכניקות נפוצות כגון מדידת לחץ עורק הריאה בריאות מבודדות או הקלטות כוח ממקטעי עורק ריאה פרוקסימליים מנותחים1,2. הניתוח של כלי subpleural על ידי מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית בזמן אמת מוגבל לכלי עם עד 50 מיקרומטר בקוטר3.
אנו מספקים טכניקה ללמוד HPV של עורקים תוך ריאתי מורין בטווח של 20-100 מיקרומטר קטרים פנימיים. הוא מבוסס על ניתוח וידאומורפומטרי של עורקים חתוכים בפרוסות ריאות חתוכות דיוק (PCLS). שיטה זו מאפשרת מדידה כמותית של vasoreactivity של עורקים פנים-acinar קטנים עם קוטר פנימי בין 20-40 מיקרומטר אשר ממוקמים ב gussets של ספטה מכתשית ליד תעלות מכתשיות של עורקים לפני acinar גדול יותר עם קטרים פנימיים בין 40-100 מיקרומטר אשר פועלים סמוך ברונכי ברונכיולים. בניגוד להדמיה בזמן אמת של כלי תת-חלל בעכברים מורדמים ומאווררים, ניתוח וידאומורפומטרי של PCLS מתרחש בתנאים ללא לחץ גזירה. במודל הניסיוני שלנו שני מקטעי העורקים מציגים HPV מונופאזי כאשר הם נחשפים לגז בינוני עם 1% O2 והתגובה נמוגה לאחר 30-40 דקות בהיפוקסיה.

באיור 1 ניתנות תוצאות המדידה של HPV של עורק קדם-סינארי גדול ובאיור 2 של עורקים תוך-אצינריים קטנים. בתמונות ניגודיות הפאזה (איורים 1A ו- 2A) מתברר כי ניתן להפלות את 2 סוגי העורקים האלה על סמך מיקומם בתוך רקמת הריאה: עורקים טרום-אצ'יניים פועלים בשכונה קרובה לסמפונצ'י וברונצ'ולי(איור 1A),ואילו העורקים התוך-סינאריים ממוקמים בגוסטות של ספטה מכתשית ומוקפים מכתשית(איור 2A). עם קצת תרגול אפשר לראות את השינויים באזור הזוהר בתגובה U46619 על תמונות ניגוד פאזה (איורים 1A ו 2A). עם זאת, vasoconstriction ריאתי היפוקסי הוא לעתים קרובות לא כל כך בולט ומתברר רק לאחר הערכה מלאה של השינויים של האזורים הזוהרים (איורים 1B, 1C, 2B, ו, 2C). מסיבה דידקטית נתנו דוגמה של עורק טרום acinar אשר מראה vasoconstriction בולט במיוחד. בממוצע, HPV תוצאות 20-30% הפחתה של האזור הזוהר.
באיור 2 ההקלטות של עורקים תוך-אצ'יניים קטנים עם מדיום בגז היפוקסי עם או בלי 50 μM pinacidil (פותחן לא אלקטיבי של תעלות אשלגן רגישות ל-ATP מיטוכונדריאלי) מוצגות וההשפעה המעכבת של התרופה הופכת גלויה בבירור. החלק האחרון של הניסוי מדגים את הסלקטיביות של הפעולה של התרופה על HPV: Vasoconstriction המושרה על ידי U46619 אנלוגי thromboxane אינו משתנה על ידי תוספת של pinacidil. אכן, העקומה עבור העורק חשפה את pinacidil פועל נמוך באופן מובהק מאשר שני האחרים, אבל היקף ההפחתה של האזור הזוהר על ידי U46619 לבד הוא דומה. במקרה זה היה זה היפוך לא שלם של HPV אשר גורם להבדל בין העקומות. בגרף זה גם עורק שנחשף למדיום גז נורמוקסי נכלל כבקרה נוספת. בתנאי זה, לא ניתן לזהות שינויים באזור הזוהר.
באיור 3 מוצגים נתוני סדרת המדידות המלאה על השפעת פינצ'ידיל על HPV. לשם השוואה בין שתי הקבוצות להבדלים סטטיסטיים, נותחו ערכות הנתונים של נקודות הזמן שצוינו עם מבחן קרוסקל-וואליס ומבחן מאן-וויטני. HPV בוטל בבירור בנוכחות פינצ'ידיל ואילו התכווצות הנגרמת על ידי U46619 לא השתנתה.
לחלופין, ניתן לזהות הבדלים בין קבוצות על ידי השוואת השטח מתחת לעקומה כמתואר מולר-רדצקי ואח '. 22 (22)
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50970/50970fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50970/50970fig1.jpg"> איור 1. מדידה של HPV של עורק קדם-אצינרי גדול. (A)תמונות ניגודיות פאזה של עורק טרום-אצינרי חתך (א) הפועל בשכונה קרובה לברונכי חתך רוחב(B). התמונות מצולמות בנקודות הזמן שצוינו ב- (B) על ידי עיגולים: בתחילת המדידה (א), בסוף הטיפול עם U46619 (ב), בסוף החשיפה לניברוס (c), לאחר 30 או 40 דקות במדיום בגז היפוקסי (ד, ה), לאחר שטיפה עם מדיום גז נורמוקסי (ו), ואחרי היישום הסופי של U46619 (ז). בגרף (B) שינויים באזור הזוהר מותווים כנגד הזמן ואילו האזור הזוהר בתחילת הניסוי מוגדר כ- 100% ו vasoconstriction/-dilatation ניתנים כערכים יחסיים. במקרה זה היפוקסיה גורם 60% הפחתה של האזור הזוהר. (C) להצגה ברורה יותר של התגובה ההיפוקסית, השלב הראשוני של הניסוי שבו נבדקה vasoreactivity אינו כלול, אבל הערך המתקבל מיד לפני החשיפה לחמצן מופחת מוגדר 100% (ראה גם איור 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50970/50970fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50970/50970fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50970/50970fig2.jpg"> איור 2. ההשפעה של פינקידיל (פותחן לא נבחר של ערוצי אשלגן רגישים ל-ATP מיטוכונדריאלי; mitoKATP) על HPV של עורקים תוך-סינאריים קטנים. (A)עורקים תוך-אצ'יניים (א) ממוקמים ב gussets של ספטה מכתש. אלב = אלבולוס. רצף התנאים הבודדים המיושמים בניסויים אלה ניתן בכותרת הגרף (B). חשיפה היפוקסית מבוצעת בנוכחות או היעדר 50 μM פינצ'ידיל. הדגירה הבקרה נעשית עם מדיום גז נורמוקסי. תמונות המוצגות ב- (A) מצולמים בתחילת המדידה (a, a', a"), בסוף הטיפול עם U46619 (ב, b', b"), בסוף החשיפה לנייפרוס (c, c', c"), לאחר 30 או 40 דקות במדיום גז היפוקסי או נורמוקסי (d, d', d"; e', e"), לאחר שטיפה עם מדיום בגז נורמוקסי (f, f', f"), ולאחר היישום הסופי של U46619 (g, g', g"). להצגה ברורה יותר של התגובה לנורמוקסיה/היפוקסיה/היפוקסיה+פינצ'ידיל, הערכים המתקבלים מיד לפני החשיפה למדיום נורמוקסי/היפוקסי-גז מוגדרים כ- 100% (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50970/50970fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50970/50970fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50970/50970fig3.jpg"> איור 3. עיכוב של HPV על ידי פינצ'ידיל. ההקלטות של עורקים פנים-acinar קטנים חשופים בינוני גז היפוקסי עם או בלי 50 μM pinacidil מסוכמים ומוצגים כאמצעי ± SEM. ב -( A) ההקלטות המלאות ניתנות, ב - (B) הנתונים היחסיים ביחס לערך בתחילת הדגירה ההיפוקסית מוצגים. לא ניתן לזהות vasoreactivity ב- PCLS אשר נחשפים למדיום היפוקסי-גז המכיל פינצ'ידיל. Vasoconstriction המושרה על ידי U46619 אינו מושפע על ידי התרופה. "n" בסוגריים מתייחס למספר העורקים/ מספר בעלי החיים שממנו נוצרו PCLS. במילים אחרות, המספר הראשון מתאר את ספירת מקטעי הריאות שנותחו והמספר השני נותן את ספירת העכברים שממנה הוכנו מקטעים אלה. בנקודות הזמן הנתון ההבדלים בין שתי הקבוצות נבחנים למשמעות. n.s.: לא משמעותי, *: p≤0.05, **: p≤0.01, ***: p≤0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50970/50970fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50970/50970fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50970/50970fig4.jpg"> איור 4. מבט כולל סכמטי על פעולת השירות. בקצרה, עכברים נהרגים על ידי נקע בצוואר הרחם. לאחר פתיחת החזה, הריאות מלאות בנקודת התכה נמוכה agarose ולאחר קירור לחתוך לפרוסות ריאות 200 מיקרומטר דיוק עבה לחתוך (PCLS). לאחר הסרת agarose ב 37 °C (70 °F) PCLS אחד מועבר לתוך תא זרימה דרך superfusion שבו הוא נחשף בינוני נורמוקסי או בינוני גז עם 1% O2. Vasoreactivity נרשם כשינויים באזור הזוהר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50970/50970fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices at JoVE.com

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

איזוקונסטריאקציה ריאתי היפוקסית (HPV) היא תופעה פיזיולוגית חשובה שבאמצעותה ב זלוף ריאות היפוקסיה מכתשי מותאם אוורור. מגזר כלי הדם העיקרי התורם ל- HPV הוא העורק התוך-אציני. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו לניתוח של HPV של כלי ריאות מורין עם קטרים של 20-100 מיקרומטר.

ניתוח וידאומורפומטרי של Vasoconstriction ריאתי היפוקסי של עורקים תוך ריאתי באמצעות מוריס דיוק לחתוך פרוסות ריאות

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

videomorphometric-analysis-hypoxic-pulmonary-vasoconstriction-intra

Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K Views.  Justus-Liebig-University. איזוקונסטריאקציה ריאתי היפוקסית (HPV) היא תופעה פיזיולוגית חשובה שבאמצעותה ב זלוף ריאות היפוקסיה מכתשי מותאם אוורור. מגזר כלי הדם העיקרי התורם ל- HPV הוא העורק התוך-אציני. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו לניתוח של HPV של כלי ריאות מורין עם קטרים של 20-100 מיקרומטר.

Video: Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

Bronchial Thermoplasty:  A Novel Therapeutic Approach to Severe Asthma

Bronchial thermoplasty is a non-drug procedure for severe persistent asthma that delivers thermal energy to the airway wall in a precisely controlled manner to reduce excessive airway smooth muscle. Reducing airway smooth muscle decreases the ability of the airways to constrict, thereby reducing the frequency of asthma attacks. Bronchial thermoplasty is delivered by the Alair System and is performed in three outpatient procedure visits, each scheduled approximately three weeks apart. The first procedure treats the airways of the right lower lobe, the second treats the airways of the left lower lobe and the third and final procedure treats the airways in both upper lobes. After all three procedures are performed the bronchial thermoplasty treatment is complete.
Bronchial thermoplasty is performed during bronchoscopy with the patient under moderate sedation. All accessible airways distal to the mainstem bronchi between 3 and 10 mm in diameter, with the exception of the right middle lobe, are treated under bronchoscopic visualization. Contiguous and non-overlapping activations of the device are used, moving from distal to proximal along the length of the airway, and systematically from airway to airway as described previously. Although conceptually straightforward, the actual execution of bronchial thermoplasty is quite intricate and procedural duration for the treatment of a single lobe is often substantially longer than encountered during routine bronchoscopy. As such, bronchial thermoplasty should be considered a complex interventional bronchoscopy and is intended for the experienced bronchoscopist. Optimal patient management is critical in any such complex and longer duration bronchoscopic procedure. This article discusses the importance of careful patient selection, patient preparation, patient management, procedure duration, postoperative care and follow-up to ensure that bronchial thermoplasty is performed safely.
Bronchial thermoplasty is expected to complement asthma maintenance medications by providing long-lasting asthma control and improving asthma-related quality of life of patients with severe asthma. In addition, bronchial thermoplasty has been demonstrated to reduce severe exacerbations (asthma attacks) emergency rooms visits for respiratory symptoms, and time lost from work, school and other daily activities due to asthma.

Bronchial thermoplasty is a non-drug procedure for severe persistent asthma that delivers thermal energy to the airway wall in a precisely controlled manner to reduce excessive airway smooth muscle. Reducing airway smooth muscle decreases the ability of the airways to constrict, thereby reducing the frequency of asthma attacks.

Thermoplasty הסימפונות: גישה טיפולית חדשנית כדי מאסטמה קשה

Bronchial thermoplasty is a non-drug procedure for severe persistent asthma that delivers thermal energy to the airway wall in a precisely controlled ...

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

באנגיוגנזה ריאות עכברוש איסכמי

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Increasing Pulmonary Artery Pulsatile Flow Improves Hypoxic Pulmonary Hypertension in Piglets

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a disease affecting distal pulmonary arteries (PA). These arteries are deformed, leading to right ventricular failure. Current treatments are limited. Physiologically, pulsatile blood flow is detrimental to the vasculature. In response to sustained pulsatile stress, vessels release nitric oxide (NO) to induce vasodilation for self-protection. Based on this observation, this study developed a protocol to assess whether an artificial pulmonary pulsatile blood flow could induce an NO-dependent decrease in pulmonary artery pressure. One group of piglets was exposed to chronic hypoxia for 3 weeks and compared to a control group of piglets. Once a week, the piglets underwent echocardiography to assess PAH severity. At the end of hypoxia exposure, the piglets were subjected to a pulsatile protocol using a pulsatile catheter. After being anesthetized and prepared for surgery, the jugular vein of the piglet was isolated and the catheter was introduced through the right atrium, the right ventricle and the pulmonary artery, under radioscopic control. Pulmonary artery pressure (PAP) was measured before (T0), immediately after (T1) and 30 min after (T2) the pulsatile protocol. It was demonstrated that this pulsatile protocol is a safe and efficient method of inducing a significant reduction in mean PAP via an NO-dependent mechanism. These data open up new avenues for the clinical management of PAH.

Pulmonary hypertension is associated with a significant reduction in pulmonary artery pulsatility, contractility and elasticity, contributing to an increase in pulmonary artery pressure and pulmonary resistance. Using a hypoxic piglet model, this study demonstrated that improving pulmonary artery plasticity using a newly developed pulsatile catheter improves hypoxic pulmonary hypertension.

עורק ריאת הגדלת pulsatile תזרים משפר חוסר חמצן יתר לחץ דם ריאה בחזירונים

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a disease affecting distal pulmonary arteries (PA). These arteries are deformed, leading to right ventricular ...

Use of Electromagnetic Navigational Transthoracic Needle Aspiration (E-TTNA) for Sampling of Lung Nodules

Lung nodule evaluation represents a clinical challenge especially in patients with intermediate risk for malignancy. Multiple technologies are presently available to sample nodules for pathological diagnosis. Those technologies can be divided into bronchoscopic and non-bronchoscopic interventions. Electromagnetic navigational bronchoscopy is being extensively used for the endobronchial approach to peripheral lung nodules but has been hindered by anatomic challenges resulting in a 70% diagnostic yield. Electromagnetic navigational guided transthoracic needle lung biopsy is novel non-bronchoscopic method that uses a percutaneous electromagnetic tip tracked needle to obtain core biopsy specimens. Electromagnetic navigational transthoracic needle aspiration complements bronchoscopic techniques potentially allowing the provider to maximize the diagnostic yield during one single procedure. This article describes a novel integrated diagnostic approach to pulmonary lung nodules. We propose the use of endobronchial ultrasound transbronchial needle aspiration (EBUS-TBNA) for mediastinal staging; radial EBUS, navigational bronchoscopy and E-TTNA during one single procedure to maximize diagnostic yield and minimize the number of invasive procedures needed to obtain a diagnosis. This manuscript describes in detail how the navigation transthoracic procedure is performed. Additional clinical studies are needed to determine the clinical utility of this novel technology.

Use of Electromagnetic Navigational Transthoracic Needle Aspiration E-TTNA for Sampling of Lung Nodules

We describe the novel use of electromagnetic navigational guided transthoracic needle aspiration for the pathologic assessment of human lung nodules.

שימוש באלקטרומגנטית ניווט Transthoracic מחט שאיפה (E-TTNA) לדגימה של גושים ריאות

Lung nodule evaluation represents a clinical challenge especially in patients with intermediate risk for malignancy. Multiple technologies are presently ...

Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting and sustaining this phenotype is critically important in normal alveolar growth and gas exchange throughout life. Several in vitro studies have characterized the role of key regulatory proteins, signaling molecules, and steroid hormones that can influence the rate of lung fluid clearance. However, in vivo examinations must be performed to evaluate whether these regulatory factors play important physiological roles in regulating perinatal lung liquid absorption. As such, the utilization of real time X-ray imaging to determine perinatal lung fluid clearance, or pulmonary edema, represents a technological advancement in the field. Herein, we explain and illustrate an approach to assess the rate of alveolar lung fluid clearance and alveolar flooding in C57BL/6 mice at post natal day 10 using X-ray imaging and analysis. Successful implementation of this protocol requires prior approval from institutional animal care and use committees (IACUC), an in vivo small animal X-ray imaging system, and compatible molecular imaging software.

We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology.

הדמית רנטגן בזמן אמת של כרכי נוזל ריאות עובריות עכבר ריאות

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse models of lung cancer are being used to study the mechanism of cancer development and to experiment with various therapeutic strategies. However, the absence of a real-time technique to identify the development of tumor nodules in mice lungs and to monitor the changes in their size in response to various experimental and therapeutic interventions hampers the ability to obtain an accurate description of the course of the disease and its timely response to treatments. In this study, a method using a micro-computed tomography (CT) scanner for the detection of the development of lung tumors in a mouse model of lung adenocarcinoma is described. Next, we show that monthly follow-up with micro-CT can identify dynamic changes in the lung tumor, such as the appearance of additional nodules, increase in the size of previously detected nodules, and decrease in the size or complete resolution of nodules in response to treatment. Finally, the accuracy of this real-time assessment method was confirmed with end-point histological quantification. This technique paves the way for planning and conducting more complex experiments on lung cancer animal models, and it enables us to better understand the mechanisms of carcinogenesis and the effects of different treatment modalities while saving time and resources.

We describe a method for the detection of tumor nodule development in the lungs of an adenocarcinoma mouse model using micro-computed tomography and its use for monitoring changes in nodule size over time and in response to treatment. The accuracy of the assessment was confirmed with end-point histological quantification.

באמצעות טומוגרפיה מיקרו שחושבת הערכת התפתחות גידול ומעקב של תגובה לטיפול במודל עכברי של סרטן הריאות

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

Murine Echocardiography of Left Atrium, Aorta, and Pulmonary Artery

The present methodology teaches the investigator how to measure and use the LAV as a surrogate of chronic elevations in Left Ventricular diastolic pressure through echocardiography, as well as to obtain measurements of the Aorta and PA diameter in mice.
Mice older than 10 d of age can be analyzed using the present technique. The technique is composed of 3 main steps: set-up, image acquisition, and image analysis. The set-up step consists of getting the mouse anesthetized with 1% isoflurane, shaving it, and taping it in a supine position to a heated EKG board where the image acquisition will take place. The image acquisition step consists of learning to identify the cardiac structures and obtaining all the required images with its correspondent probe and axis in order to be able to calculate volumes and diameters. The image analysis step consists of measuring the previously acquired images with the aid of computer software.
Advantages of the proposed technique include a fast (15 min) procedure that would allow the researcher to evaluate interventions in a non-invasive, non-terminal approach and therefore follow the same mouse over time; each mouse can be used as its own control. This fact plus having the same operator perform all the acquisition and analysis for the entire experiment minimizes the limitation of operator-dependency. The present methodology is useful for mouse researchers in cardiovascular and pulmonary medicine.

The following protocol describes the methodology for the acquisition and analysis of echocardiographic images used to obtain the Left Atrial Volume (LAV), Aorta (Ao) diameter, and Pulmonary Artery (PA) diameter in mice. This technique is a non-invasive, non-terminal procedure that allows assessment of the cardiopulmonary function.

אקו Murine של השמאל אטריום, אבי העורקים, ו עורק הריאה

The present methodology teaches the investigator how to measure and use the LAV as a surrogate of chronic elevations in Left Ventricular diastolic ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the human respiratory tract. NA is a non-invasive technique which absorbs fluid from the inferior turbinate, and causes minimal discomfort. NA has yielded reproducible results with the ability to frequently repeat sampling of the upper airway. 
By comparison, alternative methods of sampling the respiratory mucosa, such as nasopharyngeal aspiration (NPA) and conventional swabbing, are more invasive and may result in greater data variability. Other methods have limitations, for instance, biopsies and bronchial procedures are invasive, sputum contains many dead and dying cells and requires liquefaction, exhaled breath condensate (EBC) contains water and saliva, and lavage samples are dilute and variable.
BA can be performed through the working channel of a bronchoscope in clinic. Sampling is well tolerated and can be conducted at multiple sites in the airway. BA results in MLF samples being less dilute than bronchoalveolar lavage (BAL) samples.
This article demonstrates the techniques of NA and BA, as well as the laboratory processing of the resulting samples, which can be tailored to the desired downstream biomarker being measured. These absorption techniques are useful alternatives to the conventional sampling techniques used in clinical respiratory research.

This manuscript describes the use of nasal and bronchial absorption techniques, specifically using synthetic absorptive matrices (SAM) to sample the mucosal lining fluid (MLF) of the upper and lower airway. These methods provide better standardization and tolerability than existing respiratory sampling techniques.

ספיגת נוזלים באף ובסימפונות: דגימה מדויקת של רירית מערכת הנשימה האנושית, מעבדה בעיבוד של דגימות

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of the fresh gas entering a lung region divided by the region&#8217;s end-expiratory volume &#8213; in the human lung, using only inhaled oxygen as a contrast agent. Regional quantification of specific ventilation has the potential to help identify areas of pathologic lung function. Oxygen in solution in tissue shortens the tissue&#8217;s longitudinal relaxation time (T1), and thus a change in tissue oxygenation can be detected as a change in T1-weighted signal with an inversion recovery acquired image. Following an abrupt change between two concentrations of inspired oxygen, the rate at which lung tissue within a voxel equilibrates to a new steady-state reflects the rate at which resident gas is being replaced by inhaled gas. This rate is determined by specific ventilation. To elicit this sudden change in oxygenation, subjects alternately breathe 20-breath blocks of air (21% oxygen) and 100% oxygen while in the MRI scanner. A stepwise change in inspired oxygen fraction is achieved through use of a custom three-dimensional (3D)-printed flow bypass system with a manual switch during a short end-expiratory breath hold. To detect the corresponding change in T1, a global inversion pulse followed by a single shot fast spin echo sequence was used to acquire two-dimensional T1-weighted images in a 1.5&#160;T MRI scanner, using an eight-element torso coil. Both single slice and multi-slice imaging are possible, with slightly different imaging parameters. Quantification of specific ventilation is achieved by correlating the time-course of signal intensity for each lung voxel with a library of simulated responses to the air/oxygen stimulus. SVI estimations of specific ventilation heterogeneity have been validated against multiple breath washout and proved to accurately determine the heterogeneity of the specific ventilation distribution.

Specific ventilation imaging is a functional magnetic resonance imaging technique that allows for quantification of regional specific ventilation in the human lung, using inhaled oxygen as a contrast agent. Here, we present a protocol to collect and analyze specific ventilation imaging data.

מיפוי כמותי של אוורור ספציפי בריאה האנושית באמצעות דימות תהודה מגנטית פרוטון וחמצן כסוכן ניגודיות

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

מורנה דיוק-גזור פרוסות הכבד כמודל Vivo Ex של ביולוגיה של הכבד

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...