עבודה זו נתמכה על ידי NIEHS R01ES014470 (KMZ).

לפני תחילת פרוטוקול זה, לאסוף עכברים בילוד בימים שלאחר הלידה 1-3 (P1-3) במכל סטרילי מקונן עם מצעי כלוב מקוריים להגנה וחמימות. חשוב לעבוד במהירות וביעילות באמצעות פרוטוקול זה כדי לייעל את תשואת microglial. אנא ראה טבלה 1 לרשימה מגיב מלאה. 1. הכנה של מכשירים, תרבות מדיה, וצלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מיליליטר / גור מדיה שלמה Microglia (MCM; 1x מינימאלי חיוני [ממ] של בינוני ארל בתוספת: 1 L-גלוטמין מ&quot;מ, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ,) גלוקוז D-(+ 0.6% v / v, 100 מיקרוגרם / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין (P / S), 4% v / v בסרום שור העוברי (FBS), 6% V / V סוסים סרום), ולהוסיף לכל בקבוק T-75 (בקבוק 1 / גור); כובע ומקום אופקי לתוך חממה (37 מעלות צלזיוס, CO 2 של 5%) לאזן במשך שעה 1. זה חיוני כדי לאזן את המדיה הזו בבקבוק (ים) לפני תחילת הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכשיריםמחדש, aliquot, וחם ב37 MCM אמבט המים C ° לנתיחה (6 מיליליטר / גור) ובMCM צינור חרוטי נפרד לתא resuspension (2 מיליליטר / גור). היכונו, aliquot, ומקרר על קרח ממינסינג מדיה (MM; HBSS בתוספת: 100 P מיקרוגרם / מיליליטר / S, M 0.01 HEPES; 3 מיליליטר / גור), וביתור מדיה (DM; MEM השלים עם 100 P מיקרוגרם / מיליליטר / S; 2 מיליליטר / גור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הכלים כירורגיים הבאים על ידי טבילה באתנול 70% עבור 10 דקות: מספריים # 1 (1; לערוף), מלקחי # 1 (2; כדי לאבטח את האף ולהסיר קליפת מוח), מספריים # 2 (1; קרקפת כדי לפתוח; nonangled ), מלקחיים # 2 (1; להסיר קרקפת), מלקחי 3 # (1; להסיר גולגולת), מלקחיים # 4 (2; להסרת קרומי המוח), מספריים # 3 (1; לבררתי ברקמת מוח). לאפשר לאוויר יבש על משטח סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את המיקרוסקופ תחנת עבודה ונתיחה האופקי-זרימת אוויר עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר DM לתוך 2 100 מ&quot;מ מנות סטרילי, פטרי ללכידת ראש (3 מיליליטר; מנה 1/3 גורים) ודיסקציה (1 מיליליטר;המנה 1 / גור; מקורר בקרח לפני דיסקציה). לוותר MM לתוך צלחת 1 סטרילי, 100 מ&quot;מ פטרי למיותר ברקמת מוח (1 מיליליטר; מנה 1 / גור). </li></ol> 2. Dissection רקמת המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני המתת חסד, בעדינות לטהר צוואר וראש של גור עם אתנול 70% באמצעות רקמות במעבדה. עם מספריים # 1, להרדים במהירות גור על ידי הסרת הראש; ראש ללכוד בצלחת פטרי שהוכנה קודם לכן. להרדים ולהשלים את הנתיחה של גור אחד לפני שתמשיך לחיה הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הראש לצלחת לנתיחה מקוררת; תחת מיקרוסקופ לנתיחה לאבטח את הראש על ידי צובט את האף באמצעות מלקחי # 1 (לחלופין, הראש יכול להיות מאובטח על ידי פירסינג המלקחיים דרך שקע העין); קרקפת פתוחה באמצעות מספריים מס &#39;2 על ידי יצירת לחתוך-Y: תתחיל מבסיס של ראש ובזווית לכיוון העיניים. השתמש במלקחיים 3 # להסיר בעדינות את הקרקפת על ידי קילוף רוחבי, חושף את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים # 3, בעדינות להסיר רקמת חיבור בבסיסראש. כאשר בסיס גולגולת חשוף גולגולת, בזהירות פתוחה על ידי השחלה זרוע אחת של מלקחיים שבבין המוח והגולגולת (בעקבות סדק המיספרי); אחיזה; משוך בעדינות את הגולגולת כלפי מעלה לקרוע פתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש את רקמת חיבור בצד הגחוני של המוח באמצעות מלקחי # 1, ולאחר מכן להסיר את המוח תוך שימוש באותו הכלי. הרם את המוח מתוך גולגולת באמצעות כוח כלפי מעלה מתחת לצד הגחוני של המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על המוח במצב האנטומי שלה: צד גב כלפי מעלה כדי להמחיש את קליפת המוח מתחת למיקרוסקופ לנתיחה; לאבטח את המוח במקום על ידי הוספת טיפים של מלקחיים בצומת של המוח התיכון וקליפת המוח; להסיר לחלוטין את קרומי המוח בקליפת המוח עם מלקחיים # 4, לאחר מכן להמשיך להסיר את קרומי המוח הגחון. ברגע שהקרומים המוח הוסרו לחלוטין, להפריד את קליפת המוח משאר המוח באמצעות מלקחיים # 4. זה חיוני כדי להסיר לחלוטין את רקמת קרום מוח למקסם את טוהר מיקרוגליה וyielד. </li></ol> 3. רקמת מוח ממינסינג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הקורטקס להכין בעבר מיותר מנה; תמשיך מיותר צעד באמצעות טכניקה סטרילית בClass II בטיחות הביולוגית קבינט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת בשר טחון מוח באמצעות מספריים # 3; רקמה טחונות העברת צינור חרוטי 15 מיליליטר;. לשטוף מספריים ומנה מיותרות עם 1 מיליליטר של MM כל אחד, לאסוף ולוותר על שטיפות לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל רקמה הטחון צעד שטיפה זה יהיה למקסם התשואה של מיקרוגליה על ידי הבטחה כי כל הרקמה שיורית מועברת לצינור חרוטי. השאר השעיה רקמות ללא הפרעה במשך 1-2 דקות, המאפשר רקמה טחונות להתיישב בחלק תחתון של צינור. האם לא יעלה על 2 דקות כMM אינו מכיל חומרים מזינים חיוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות וזורקים 2 מיליליטר של supernatant עם micropipettor 1,000 μl גנרית עם קצה פיפטה סטנדרטי, מה שהופך מסוימים לא לשבש התיישבו טחונות רקמות. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיליליטר של MCM לטחון רקמות; triturate הרקמה בכל כוח באמצעות micropipettor 1,000 μl גנרית עם קצה פיפטה סטנדרטי לא ניתן להבחין רקמה מוצקה צריכה להישאר כאשר טחינה דקה הושלמה.. להוסיף עוד 3 מיליליטר של MCM עם אותו קצה פיפטה, איסוף דגימת triturated שיורי מקצה פיפטה. </li></ol> 4. תאים בקליפת מוח גידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הרקמה הטחון עד גלולה תאים (XG 215; 5 דקות, RT; צנטריפוגות הקלינית עם הרוטור דלי מתנדנד). חזרו תאי pelleted לארון הבטיחות ביולוגית, להסיר ולבטל את supernatant; עדינות resuspend התא גלולה (2 מיליליטר / צינור; MCM); להוסיף resuspension התא לבקבוק שהוכן בעבר T-75; מכסה את הבקבוק ומניח אותו בצורה אופקית לתוך חממת humidified, סטנדרטית תרבית רקמה (37 ° C CO, 2 5%). אפשר התאים כדי לדגור על 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, לטפוח בעדינות בקבוק נגד כף היד לשבשפסולת רקמות. בדקו תאים לפני ואחרי ההקשה על מנת להבטיח הסרה מלאה של פסולת. בקבוק סט אנכי; להסיר ולסלק תקשורת; להוסיף MCM הטרי לתחתית של הבקבוק (12 מיליליטר; 37 מעלות צלזיוס); כובע ומניח בחזרה לתוך החממה, בצורה אופקית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו תאים מדי יום לזיהום וכדי לפקח על צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 17-21 בימים במבחנה (DIV), תאי microglial יהיו מוכנים לקציר מתרבות גליה המעורבת. כדי לקבוע אם תאים מוכנים, לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך. Microglia מוכן לקציר, כאשר ב ~ confluency 40%. הם מופיעים כתאים קטנים, בהירים, כדוריים, גדל כmonolayer על גבי גליה אחרת. </li></ol> 5. בידוד של Microglia ממעורב גלייה תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד מיקרוגליה, במרץ ברז בקבוק נגד ספסל מעבדה. תסיסה זו מסייעת מיקרוגליה נפרדים מתאי גליה אחרים בשל המאפיינים נמוך דבקות של מיקרוגליה. </li><li&gt; חותם T-75 כובעי בקבוק עם Parafilm ולסובב את תרבויות גליה המעורבות (200 סל&quot;ד; 37 מעלות צלזיוס; 5 שעות). שימוש, שייקר סיבובי nonhumidified טמפרטורה מבוקרת אל תאפשר לתאים כדי ללחוץ למשך זמן ארוך יותר מ -5 שעות ראייה לבדוק. מיקרוגליה שהרימו את משטח הבקבוק אחרי 5 שעות, תוך שימוש במיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך. Microglia בהיר, כדורי, תאים חופשיים צף. יהיה שכבת שיורי של האסטרוציטים וoligodendrocytes הקפדה על החלק התחתון של הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תקשורת supernatant המכילה מיקרוגליה לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי חרוטי; מיקרוגליה גלולה (215 XG; 5 דקות, מתנדנד הרוטור דלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדור microglial בmicroglial החם צמיחה בינונית (MGM; ממ בתוספת: פירובט נתרן 1 מ&quot;מ, 0.6% v / vglucose, L-גלוטמין 1 מ&quot;מ, 100 P מיקרוגרם / מיליליטר / S, 5% V / V FBS; ~ 2 מיליליטר / בקבוק), לקבוע את ריכוז התאים באמצעות hemocytometer, וצלחת 1 x 10 5 תאים / גם בפורמט צלחת 24 גם עלפלסטיק או תלושי סטרילי כיסוי זכוכית (500 μl / טוב; MGM). שימוש בהליך זה תשואת מיקרוגליה הממוצעת היא קליפת 7.5 x 10 5 תאים / גור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר ציפוי, להסיר את כל אמצעי התקשורת ובתאי refeed עם MGM הטרי (37 ° C) להסרת תאים ופסולת צפים. שלב זה הוא קריטי להישרדות תא ולשמור על מיקרוגליה שקטים. תאים עשויים להיות מנוצלים לניסויים מייד לאחר refeeding. </li></ol> 6. טיפולים לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף תאים ל10 ננוגרם / מיליליטר של פאם 3 צסק&quot;א 4 (פאם), 10 ng / ml lipopolysaccharide (LPS) או שליטה ברכב; דגירה עבור 2 או 24 שעות בחממת humidified (37 ° C CO, 2 5%). </li></ol> 7. ניתוח Microglia לפונקציונלי Ex vivo באמצעות Immunofluorescent הדמיה וImmunocytochemistry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טיפול, תקשורת ותרבות תא קציר בצינורות microfuge (1.5 מיליליטר) וcentrifuge באמצעות microcentrifuge שולחן (2 דקות; 900 XG) כדי לנקות את התקשורת. מעביר את supernatant לצינור microfuge נקי; assay באופן מיידי, או בחנות ב-20 ° C עד מוכן לשימוש. לנתח ריכוז TNF-α בsupernatant תרבית תאים באמצעות ערכת עכבר זמינה מסחרי α-TNF ELISA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS), ולתקן את התאים עם 4% (w / v) paraformaldehyde / 4% (w / v) pH סוכרוז / PBS 7.4 (PFA 4%; 15 דקות, RT). בעקבות קיבוע, לשטוף את התאים עם PBS במשך 5 דקות עם רעד עדין על שייקר מסלולית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunofluorescence / Immunocytochemistry. לאחר הקיבוע וPBS לשטוף, מיקרוגליה תהליך לimmunocytochemistry. כל הצעדים שבוצעו עם רעד עדין. Permeabilize תאים בPBS/0.1% טריטון X-100; תאי בלוק בPBS/10% נסיוב עזים נורמלים למשך שעה אחת. דגירה תאי O / N ב 4 ° C עם נוגדן ארנב נגד NF-κB (מקטע p65; 1/1, 250) או נוגדן ארנב נגד איבא-1 (1/750) בחסימת מאגר. חזותיize אנטיגן: נוגדן מורכב הבא דגירה עם עז מצומדות fluorescently נוגדנים נגד ארנב IgG משניים (1 שעות, 1/1, 000). הסר את שני נוגדנים מאוגדים על ידי שטיפה עם PBS/0.1% X-100 טריטון (3x 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי כתם דלפק עם 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole / PBS (DAPI; 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר). כדי להמחיש את גרעין התא כל מיקרוגליה נגזרים מ+ / CX3CR1-GFP - העכברים להביע את ה-GFP. לנצל מסנן גל 350 ננומטר לדמיין DAPI; מסנן 488 ננומטר אורך גל לדמיין GFP, ומסנן גל 594 ננומטר לדמיין p65 וייבא-1 immunocomplexes. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי ההר מחליק באמצעות פתרון הרכבה מימית ולדמיין מיקרוגליה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol>

<ol>
	<li>Ranshoff, R. M. P. V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Physiology:+Unique+Stimuli,+Specialized+Responses.">Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39, 151-170 (1990).</li><li>Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+homeostasis+of+&amp;#34;resident&amp;#34;+myeloid+cells:+The+case+of+the+microglia.">Development and homeostasis of &amp;#34;resident&amp;#34; myeloid cells: The case of the microglia.</a> Glia. 61, 112-120 (2013).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).</li><li>Saijo, K., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cell+origin+and+phenotypes+in+health+and+disease.+Nature+reviews.">Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews.</a> Immunology. , 11-775 (2011).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li><li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+and+free+radical+production+by+porcine+microglia.">Cytokine and free radical production by porcine microglia.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).</li><li>Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors:+a+growing+family+of+immune+receptors+that+are+differentially+expressed+and+regulated+by+different+leukocytes.">Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes.</a> J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).</li><li>Lee, S. J., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+and+inflammation+in+the+CNS.">Toll-like receptors and inflammation in the CNS.</a> Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).</li><li>Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia-mediated+neurotoxicity:+uncovering+the+molecular+mechanisms.">Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).</li><li>Halle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NALP3+inflammasome+is+involved+in+the+innate+immune+response+to+amyloid-beta.">The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta.</a> Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).</li><li>Chen, G. Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation:+sensing+and+reacting+to+damage.">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li><li>Duewell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+inflammasomes+are+required+for+atherogenesis+and+activated+by+cholesterol+crystals.">NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals.</a> Nature. 464, 1357-1361 (2010).</li><li>Stewart, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+ligands+promote+sterile+inflammation+through+assembly+of+a+Toll-like+receptor+4.">CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4.</a> 11, 155-161 (2010).</li><li>Beraud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Synuclein+Alters+Toll-Like+Receptor+Expression.">alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression.</a> Front. Neurosci. 5, 80 (2011).</li><li>Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+of+microglia..">Cytotoxicity of microglia..</a> Glia. 7, 111-118 (1993).</li><li>Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Amyloid+stimulation+of+microglia+and+monocytes+results+in+TNF+alpha-dependent+expression+of+induciblenitric+oxide+synthase+and+neuronal+apoptosis.">beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis.</a> J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).</li><li>Kim, Y. S., Joh, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia,+major+player+in+the+brain+inflammation:+their+roles+in+the+pathogenesis+of+Parkinson's+disease.">Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).</li><li>Colton, C., Wilcock, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+activation+states+in+microglia.">Assessing activation states in microglia.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).</li><li>Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceramide+activates+microglia+to+enhance+the+production/secretion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF)+without+induction+of+deleterious+factors+in+vitro.">Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro.</a> J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).</li><li>Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparticipation+of+nuclear+factor+kappa+B+(NFkappaB)+in+the+signaling+cascade+of+c-JunN-terminal+kinase+(JNK)-+and+p38+mitogen-activated+protein+kinase+(p38MAPK)-dependent+tumor+necrosis+factor+alpha+(TNFalpha)+induction+in+lipopolysaccharide+(LPS)-stimulated+microglia.">Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia.</a> Brain Res. , 1073-1074 (2006).</li><li>Beraud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Activation+and+Antioxidant+Responses+Induced+by+the+Parkinson's+Disease+Protein+alpha-Synuclein.">Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein.</a> J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+activates+microglia+in+a+model+of+Parkinson's+disease.">Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).</li><li>Minghetti, L., Levi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+as+effector+cells+in+brain+damage+and+repair:+focus+on+prostanoids+and+nitric+oxide.">Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide.</a> Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).</li><li>Hirsch, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+and+Parkinson's+disease.">Glial cells and Parkinson's disease.</a> J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nitric+oxide+in+inflammation-mediated+neurodegeneration.">Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration.</a> Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).</li><li>Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+microglialinnate+immunity+in+Alzheimer's+disease+by+activation+of+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma.">Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer's disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma.</a> Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).</li><li>Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+in+Alzheimer's+disease+and+Parkinson's+disease:+are+microglia+pathogenic+in+either+disorder.">Neuroinflammation in Alzheimer's disease and Parkinson's disease: are microglia pathogenic in either disorder.</a> Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).</li><li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murinemicroglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry.">Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li><li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigenpresentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4++T+cells+compared.">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li><li>Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+digestion+with+dispase+substantially+reduces+lymphocyte+and+macrophage+cell-surface+antigen+expression.">Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression.</a> J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).</li><li>Pino, P. A., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+brain+and+spinal+cord+mononuclear+cells+using+percoll+gradients.">Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+microRNAs+in+microglia+by+real-time+PCR+in+normal+CNS+and+during+neuroinflammation.">Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+alpha-synuclein+overexpression+mediates+early+proinflammatory+activity.">Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity.</a> Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptorCX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li><li>Imai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+molecular+characterization+of+fractalkine+receptor+CX3CR1,+which+mediates+both+leukocyte+migration+and+adhesion.">Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion.</a> Cell. 91, 521-530 (1997).</li><li>Cardona, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+microglial+neurotoxicity+by+the+fractalkine+receptor.">Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor.</a> Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).</li><li>Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+microgliosis.">Reactive microgliosis.</a> Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).</li><li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus:immunophenotypic+and+functional+characteristics.">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי המחקר נערך בהעדר כל יחסים מסחריים או כספיים שיכול להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

ההליך הנוכחי מציע שיטה יעילה לבידודה של מיקרוגליה בקליפת המוח של עכברים בילוד. הליך זה יש יתרון כפול של 1) immunophenotype מיקרוגליה לשמר ופונקציונליות, כפי שנקבע על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, וELISA; ו, 2) המאפשר למיקרוגליה להבשיל בנוכחות של תאים אחרים גליה (האסטרוציטים וoligodentr...

תאי microglial, מקרופאגים המעקב של parenchyma מערכת העצבים המרכזית, מהווים כ 12% מאוכלוסיית התאים הכוללת של המוח של היונקים הבוגרים. מיקרוגליה נגזרים מצק חלמון מיאלואידית מבשר תאים ולהשתנות בצפיפות תאים ומורפולוגיה באזורי cytoarchitectural שונים בתוך מערכת העצבים המרכזית הבוגר 1-5. במוח בוגר בריא, מיקרוגליה הם תאים קטנים, מסועפים או קוטב עם תהליכים עדינים ודינמיים. בניגוד למורפולוגיה מקרופאג היקפי, מיקרוגליה להפגין פנוטיפ במוחות בריאים שעלולות להופיע כחוסר פעילות הסלולר שקט, בפרופיל נמוך, עם זאת, במחקרי הדמיה vivo מראים כי תהליכי microglial דינמי להאריך ולחזור בו כדי לפקח microenvironment שלהם באופן המזכיר את &quot; דגימה ומדידות &quot;6,7. מיקרוגליה הם מאוד ואופן דיפרנציאלי מגיבים לשינויים סביבתיים וpathophysiological במוח, מיתוגממשגיח למדינות מדינות בדרך כלל נחשבים למנוחה שלהם והופעלו מפעיל, בהתאמה. מתג בהפעלה זו יכול להיות מתווך על ידי מעורבות של קולטני קרום הנכנס זיהוי תבניות (PRRs), כגון קולטנים כמו חיוג (TLRs), אשר מגיבים הלקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן (PAMPs), ליפופרוטאינים כלומר חיידקים ונגיפיים נגזרים , חומצות גרעין, ופחמימות 8-11. בנוסף לPAMPs, PRRs יש גם הוכח כדי לגרום להפעלת microglial נגד מולקולות סטרילי, nonpathogenic המכונים דפוסי סכנה / הקשורים לנזק מולקולרי (damps), המייצגות את הפרעות במערכת העצבים המרכזית הומאוסטזיס, כגון נזק לתאים 12-16. עוסק ברגע, PRRs ליזום תאית מפל איתות כי תוצאות שינויים בביטוי מורפולוגיה של תאים וגני microglial, במיוחד, מיקרוגליה הופעלו להתאים פנוטיפ כמו אמבואידית, translocate מקטע p65 NF-κB (p65) לגרעין התא, וupregulate production והפרשה של ציטוקינים מעודדי דלקת, כגון גורם-α גידול הנמק (TNF-α), β interleukin-1 (IL-1β), יחד עם מיני חמצן תגובתי (ROS) 16-24. אמנם נפרד בתגובה החיסונית המולדת של מערכת העצבים המרכזית, מולקולות המופרשות על אלה יש גם נמצאים להגדיל סטרס חמצונים עצביים, ובכך ישכנעו והחרפת ניוון מוחיים במדינות חולות כמו פרקינסון ואלצהיימר 25-29. עם זאת, המנגנונים של הפעלת microglial במצבים פתולוגיים שאינם מובן לחלוטין. לכן, בידוד של מיקרוגליה הוא כלי רב עוצמה לחקירת תהליכים ביולוגיים אלה, כפי שרבים בתכונות vivo של הפעלת microglial יכולים להיות סכמו בתרבות. מספר שיטות זמינות לבידוד מיקרוגליה, כולל בידוד באמצעות שיפוע Percoll הבא עיכול אנזימטי של רקמת מערכת העצבים המרכזית 30,31. עם זאת, עיכול אנזימטי יכול לשנותimmunophenotype של התאים על ידי הפחתה על פני קרום תא ביטוי אנטיגן 32, ותוצאות בתשואה נמוכה יותר לכל תא בבעלי חיים מאשר בשיטה שתוארה במסמך זה. באופן ספציפי, אנו מדווחים תשואת מיקרוגליה ממוצעת לקליפת גור של 7.5 x 10 5 תאים, בעוד שדווחו בעבר שיטות בידוד מכל מערכת העצבים המרכזית באמצעות תשואת שיפוע Percoll 3-5 x 10 5 תאים 30,33,34. ההליך הנוכחי עוקף את השימוש באנזימי עיכול על ידי בידוד מיקרוגליה המבוססים על המאפיינים נמוך דבקותם, ובכך לשמר את immunophenotype ופונקציונליות microglial. במחקר הנוכחי, אנו מתארים את הבידוד של תאי microglial מתרבויות גליה מעורבות נגזרו מCX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -) הטרוזיגוטיים בילוד, וC57BL / 6 הקורטקס עכברי באמצעות תסיסה מכאנית על שייקר סיבובי, הרחבה של העבר 24,35 שיטה שפורסם. אנו משתמשים בזן העכבר לשעבר להדמיה קלה של מיקרוגליה, כפיעכברים אלה מבטאים GFP תחת שליטתו של מוקד CX3CR1 אנדוגני - אמרגן מונוציטים הספציפיים 36-38. שיטה זו מייצרת תרבויות microglial טהורות מאוד עם השתמרו immunophenotype לשעבר, / 2 אגוניסטים TLR4 וTLR1 vivo כפי שהודגם על ידי שינויים מורפולוגיים, טרנסלוקציה הגרעינית של p65, והפרשה של TNF-α כאשר תיגר עם lipopolysaccharide חיידקים (LPS) או פאם 3 צסק&quot;א 4 , בהתאמה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:233px;">Glucose</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">G8270</td>
			<td style="width:143px;">Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 &#176;C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Sodium pyruvate 100 mM (100x)</td>
			<td style="width:149px;">Hyclone</td>
			<td style="width:155px;">SH30239.01</td>
			<td style="width:143px;">Store at 4 &#176;C. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x)</td>
			<td style="width:149px;">Gibco</td>
			<td style="width:155px;">15140-122</td>
			<td style="width:143px;">Store at -20 &#176;C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">L-glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td style="width:149px;">Gibco</td>
			<td style="width:155px;">25030-081</td>
			<td style="width:143px;">Store at -20 &#176;C. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Fetal Bovine Serum (Defined)</td>
			<td style="width:149px;">Hyclone</td>
			<td style="width:155px;">SH30070.03</td>
			<td style="width:143px;">Filter sterilize; store at -20 &#176;C. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:233px;">Minimum Essential Medium Earle&#39;s (MEM)</td>
			<td style="width:149px;">Cellgro</td>
			<td style="width:155px;">15-010-CV</td>
			<td style="width:143px;">Without L-glutamine. Contains Earle&#39;s salts. Used to make MCM, MGM, and DM.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Horse Serum</td>
			<td style="width:149px;">Gibco</td>
			<td style="width:155px;">16050</td>
			<td style="width:143px;">Filter sterilize; store at -20 &#176;C. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:149px;">Cellgro</td>
			<td style="width:155px;">21-021-CV</td>
			<td style="width:143px;">Without calcium and magnesium. Store at 4 &#176;C. Used to make MM.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">HEPES 1 M</td>
			<td style="width:149px;">Gibco</td>
			<td style="width:155px;">15630-031</td>
			<td style="width:143px;">Store at 4 &#176;C. Used to make MM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">T-75 Flask</td>
			<td style="width:149px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">430641</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, dilactate (DAPI)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:155px;">D3571</td>
			<td style="width:143px;">Used to stain cell nucleus.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Rabbit anti-Iba1</td>
			<td style="width:149px;">Wako</td>
			<td style="width:155px;">019-19741</td>
			<td style="width:143px;">Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Rabbit anti-NF&#954;B (p65)</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:155px;">7970</td>
			<td style="width:143px;">Used at 1/1250 dilution for ICC staining for p65.</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:233px;">Alexafluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:155px;">A11012</td>
			<td style="width:143px;">Used at 1/1000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">10 ml Disposable Serological Pipet</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">13-678-11E</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">50 ml Disposable Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">05-539-8</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">15 ml Disposible Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">05-539-12</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Sterile Polystyrene Petri Dish</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">875713</td>
			<td style="width:143px;">100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1)</td>
			<td style="width:149px;">Roboz Surgical</td>
			<td style="width:155px;">RS-6010</td>
			<td style="width:143px;">1; 5 inch; used for removing head</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Scissor: Vannas 
			(scissor #2)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">15000-08</td>
			<td style="width:143px;">1; non-angled; 2.5mm cutting edge; used to open scalp</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Scissor: Student Vannas (scissor #3)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">91501-09</td>
			<td style="width:143px;">1; curved; used to mince brain tissue</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Forcep: Dumont #7 
			(forcep #1)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">91197-00</td>
			<td style="width:143px;">2; used to secure nose and remove cortices&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Forcep: Dumont #2 
			(forcep #2)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">11223-20</td>
			<td style="width:143px;">1; used to remove scalp</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Forcep: Dumont #3 
			(forcep #3)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">11231-30</td>
			<td style="width:143px;">1; used to remove skull</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Forcep: Dumont #5a 
			(forcep #4)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">11253-21</td>
			<td style="width:143px;">1; used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Table of specific equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:149px;">Name of Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:143px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Zoom Stereo Dissection Microscope&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Olympus</td>
			<td style="width:155px;">SZ4060</td>
			<td style="width:143px;">Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Laminar-Horizontal Flow Cabinet</td>
			<td style="width:149px;">Nuaire</td>
			<td style="width:155px;">NU-201-330</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:149px;">Labconco</td>
			<td style="width:155px;">3440001</td>
			<td style="width:143px;">Class II</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:233px;">Water-Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>97025-836</td>
			<td style="width:143px;">Set to 37 &#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Swing-out buckets</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td>75006441</td>
			<td style="width:143px;">To be used with Swing-out rotor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Swing-out Rotor</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td>75006445</td>
			<td style="width:143px;">Max Radius: 19.2 (cm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Sorvall Legend RT+ Centrifuge 
			(clinical centrifuge)</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td>75-004-377</td>
			<td style="width:143px;">With swing-out rotor</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">AccuSpin Micro 17 microcentrifuge 
			(tabletop microcentrifuge)</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S98645</td>
			<td style="width:143px;">With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; 
			Cat #: 75003524)&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cortical microglia with preserved immunophenotype and functionality from murine neonates

בידוד של מיקרוגליה מרקמת מערכת העצבים המרכזית הוא כלי חקירה רב עוצמה המשמש ללימודי ביולוגיה microglial vivo לשעבר. השיטה הנוכחית פרטי הליך לבידודה של מיקרוגליה מקליפת המוח העכברי ילוד על ידי תסיסה מכאנית עם שייקר סיבובי. בידוד מיקרוגליה זה תשואות שיטת מיקרוגליה בקליפת המוח טהורים מאוד כי תערוכת מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים מעידים על מיקרוגליה שקטים בתנאים רגילים, nonpathological in vivo. הליך זה גם משמר את immunophenotype microglial והפונקציונליות ביוכימיים כפי שהודגם על ידי האינדוקציה של שינויים מורפולוגיים, טרנסלוקציה הגרעינית של למקטע p65 של NF-κB (p65), והפרשה של ציטוקינים מעודדי דלקת סימן היכר, גורם-α נמק גידול (TNF-α ), על lipopolysaccharide (LPS) ופאם 3 4 צסק&quot;א (פאם) אתגרים. לכן, הליך הבידוד הנוכחי משמר את immunophenotype של שניהם שקטים וactiמיקרוגליה vated, מתן שיטה ניסיונית של חקירת ביולוגיה מיקרוגליה בתנאי vivo לשעבר.

שמירה על immunophenotype ופונקציונליות של מיקרוגליה vivo לשעבר בבידוד היא קריטית כדי להיות מסוגל לנצל את התאים האלה כמודל חקירה לביולוגיה microglial. על מנת להדגים את השימור המוצלח של immunofunctionality מיקרוגליה תוך שימוש בשיטה הנוכחית, אנו מבודדים מיקרוגליה בקליפת המוח מילודי P3 (CX3...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates at JoVE.com

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק&quot;א 4 (פאם).

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

isolation-cortical-microglia-with-preserved-immunophenotype

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K Views.  Georgetown University Medical Center.  מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, וה...

Video: Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique and important tissue to study immune mechanisms because it is involved in host immune response against oral biofilm that might cause periodontal diseases. Furthermore, the close proximity of the gingiva to alveolar bone tissue enables also studying bone remodeling under inflammatory conditions. Our method yields large amount of immune cells that allows analysis of even rare cell populations such as Langerhans cells and T regulatory cells as we demonstrated previously 1. Employing mice to study local immune responses involved in alveolar bone loss during periodontal diseases is advantageous because of the availability of various immunological and experimental tools. Nevertheless, due to their small size and the relatively inconvenient access to the murine gingiva, many studies avoided examination of this critical tissue. The method described in this work could facilitate gingival analysis, which hopefully will increase our understating on the oral immune system and its role during periodontal diseases.

This study describes an efficient technique to isolate and process gingival tissues from the mouse oral cavity in order to produce a single-cell culture. The resulting cells can be further used for flow cytometry analysis and molecular studies.

בידוד, עיבוד וניתוח של תאי חניכיים Murine

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

בידוד והשתלה של שתלי הרתי Murine בני שונים.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during physiological and pathological states. The isolation of EVs continues to be a major challenge in this field, due to limitations intrinsic to each technique. The differential ultracentrifugation with density gradient centrifugation method is a commonly used approach and is considered to be the gold standard procedure for EV isolation. However, this procedure is time-consuming, labor-intensive, and generally results in low scalability, which may not be suitable for small-volume samples such as bronchoalveolar lavage fluid. We demonstrate that an ultrafiltration centrifugation isolation method is simple and time- and labor-efficient yet provides a high recovery yield and purity. We propose that this isolation method could be an alternative approach that is suitable for EV isolation, particularly for small-volume biological specimens.

Here, we describe two extracellular vesicle isolation protocols, ultrafiltration centrifugation and ultracentrifugation with density gradient centrifugation, to isolate extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid samples. The extracellular vesicles derived from murine bronchoalveolar lavage fluid by both methods are quantified and characterized.