עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NHLBI מענק R01 HL082689 לסקוט א סיימון אנתוני ג Passerini.

1. התא התרבות הכנת התשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 3 אינץ&#39; מצעים מעגליות של 100 x 20 מאכל רקמת התרבות מ&quot;מ (BD פלקון) באמצעות מחרטה. לעקר מצעים ידי והשקיעה אתנול 70%. מקום בצלחת פטרי ומעיל עם קולגן 4 מ&quot;ל סוג אני (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל) עבור שעות 1 בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף עם 4 x 1 מ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות אדם לתאי אנדותל אבי העורקים (HAEC, מעבר 4-6) בשעה 6.5x10 5 תאים למ&quot;ל וזרעי על ידי יישום 1 מ&quot;ל ישירות המצע. מקום 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור ולאפשר התאים להיצמד למצע עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9 מ&quot;ל של צמיחה האנדותל בינוני-2 (EGM-2) להשלים את הפתרון לאנטיביוטיקה antimycotic 1x אל התאים. לשנות את התקשורת כל 2 ימים עד שהתאים מגיעים 90% confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על THP-1 התאים במדיום 1640 RPMI השלימו עם 10% FBS ו 1x לאנטיביוטיקה antimycotic פתרון. המעבר התאים כאשר הם מגיעים צפיפות 10 6 תאים למ&quot;ל. </li></ol> 2. שירינג תא פרוטוקול תאים מותנים ב מכשיר סלולרי מותאם אישית חרוט ו-צלחת הגז (CSD). פרטים התקנים והמפרטים עיצוב מתועדים טבלה 1, איור 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן CSD. לעקר הדיור קאמרית עם אתנול ולשטוף עם PBS סטרילית. מחממים את הדיור ל 37 מעלות צלזיוס ורמת להבטיח חרוט ניצב monolayer התא. להרכיב את המצע עם תאים מן החלק התחתון של הדיור ולהגדיר חרוט לגובה הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ליבוביץ-15 (L-15) בינוני השלימו עם BulletKit האנדותל כמדיום הגז כדי לשמור על pH תקין בהעדר CO 2. כדי לעורר דלקת, נמק להוסיף הגידול גורם-α (TNF-α, 0.5 נ&quot;ג / מ&quot;ל) עד ​​בינוני הגז ולהזריק 6 מ&quot;ל במכשיר באמצעות מזרק מחובר ליציאת מפרצון, נזהר שלא להכניס אווירבועות החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גזירה על מתח קבוע בעוצמה גבוהה גזירה (HSS, דיין 15 / ס&quot;מ 2) או מאמץ גזירה oscillatory (OSS, 0 5 ± דיין / 2 ס&quot;מ, 1 הרץ) עבור 4 שעות. אס הרצויה מושגת על ידי החלפה של קונוס מעל תאים, הנשלטת דווקא עם מנוע מיקרו דורך כפי שתואר קודם 6 אס הקיר על פני השטח (τ W) הוא מקורב על ידי.: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq1.jpg" alt="משוואה 1" /> שם μ הוא צמיגות של המדיום, ω היא המהירות הזוויתית של החרוט, ו - α היא זווית קונוס (0.5 מעלות). יישור קונוס עם מצע מותאם בתוך 0.05 ° פילוס דרך הדיוק ואת גובה הפער נקבע על 20 ± 10 מיקרומטר באמצעות מד עומק למזער וריאציה ההיקפי ו רדיאלי ב τ W. המכשיר קיבל תוקף על מנת להבטיח זרימה למינרית מאפיינים. הסרה גאמות מהמכשיר ולהתכונן ניתוח של הידבקות מונוציטים. </li></ol> 3. ייצור של PDMS Microfluidic הקאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג עובש אב המספר הרצוי ערוץ microfluidic וגובה ערוץ בהתאם ליישום. מאפייני העיצוב המסוים של פרוטוקול זה מפורטים בטבלה 1. שיטה ליצירת אלה כבר מתועד היטב בספרות. 1 בקצרה, רשת של תעלות נועד באמצעות תוכנות CAD (Autodesk Inventor) והודפס ב 5000 dpi על שקיפות. Photoresist שלילית (SU8) הוא הסתובב על גבי פרוסות סיליקון בעובי של 100 מיקרומטר. שקיפות המאוחסן ונחשפו לאור UV. ללא polymerized photoresist מוסר על מנת ליצור את המאסטר העתק חיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את תמהיל PDMS פתרון בסיס סיליקון עם סיליקון ריפוי סוכן 10:01 לפי משקל בסירה לשקול ומערבבים עם pipet סרולוגית 5 מ&quot;ל. להיזהר לא לגרד את הקירותשל הספינה שוקלים להימנע מהוספת פתיתי פלסטיק לפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פרוסות שני צלחת פטרי 100x15mm ויוצקים את הפתרון PDMS לתוך צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את התבשיל ומניחים אותו לתוך מיכל ריק במשך 15 דקות כדי להסיר בועות. אחרי 15 דקות לקחת את צלחת פטרי החוצה להסיר בועות עודף ידי בעדינות נושבת באוויר מעל פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי בתנור במשך שעה 1 ב 70 ° C. הסר את הצלחת לגזור לתאי microfluidic באמצעות סכין חדה. </li></ol> 4. הרכבה של התקן על מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור האור אל מיקרוסקופ הפוכה ולהגדיר תנור ל 37 ° C. צרף צינורות כדי מזרק 10 מ&quot;ל וממלאים מים מזוקקים כך יש בועות לא. הנח את המזרק משאבת מזרק ספיקת סט לגרום אס הקיר של דיין 1/2 ס&quot;מ. הלחץ גזירה הקיר (τ W) שנוצר לאורך קו האמצע של הערוץ הוא מקורב באמצעות תקןהמשוואה עבור חדר מקבילות צלחת זרימה: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq2.jpg" alt="משוואה 2" /> שם μ הוא צמיגות של המדיום, ש הוא שיעור זרימת נפח, h הוא גובה הערוץ, ו-W הוא רוחב הערוץ. הערה: מאז הערוצים הם בעלי רוחב סופי בפועל τ W תשתנה בהתאם W תלוי ערוץ יחס הממדים, ומדידות הם נמנעו על 25% הקרוב הקירות הצדדיים. 1,7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים PDMS קאמרית במים ולהשתמש micropipette 100μl להוציא אוויר מן הערוצים בודדים. צרף מתאם ואקום לחדר לוודא כי השסתום מבוטלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי עם monolayer HAEC על המטרה. מניחים את החדר PDMS על צלחת פטרי ובזהירות תניח אותו על monolayer HAEC תוך הבטחת כי לא ליצור בועות אוויר בין ההתקן לבין monolayer. סובבו את שסתום כך ואקום על וחדר מחובר כהלכה. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 19 מחטים מד להקהות כזה שיש רק 5 מ&quot;מ של השמאל מתכת. מלאו את מיכל פלסטיק עם חיץ והכניסו הכניסה לחדר PDMS. חזור על הפעולה עבור מספר מתאים של ערוצי לשמש. צרף צינורות מ משאבות המזרק יוצא PDMS הערוץ. </li></ol> 5. הדבקה Assay מונוציטים תחת מאמץ גזירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות THP-1 תאים ב 2x10 6 תאים למ&quot;ל ב HBSS + Ca 2 + / 2 + Mg HSA + 0.1%. הפעל THP-1 תאים על ידי דוגרים עם מקדם-1 נגזרות סטרומה (SDF-1, 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת מזרק להקים זרם, ולאחר מכן להוסיף 50 μl של השעיה תא למאגר ללא החדרת בועות אוויר. לאחר זרימה מפותחת במלואה, להתחיל רכישת נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרוץ 5 דק &#39;בקצב זרימה מתאימה, הוספת המאגר למאגר אם הפתרון מקבל נמוך. ממשיכים לזרום אל תוך המאגר הערוצים כדי לשטוף את כל התאים מאוגד בנחל זרימה. </li></ol> 6. רכישת נתונים וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכישת התמונה sequences דיגיטליים לאחר 3 מסגרות לשניה 2 דקות לאחר זרימה מפותחת לאורך ציר האורך של הערוץ ב -3 מקומות הערוץ, נזהר שלא להקליט מיד לאחר הכניסה או היציאה לפני יציאות או 25% בצד הקרוב קירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספור את מספר התאים שנעצרו בכל תחום על ידי זיהוי שלב המראה בהיר שלהם במישור מרחק זהה monolayer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא מעצר המשרד מוגדר על ידי התנועה &lt;½ קוטר של תא 10. נתונים ממוצעים על פני 3 שדות אקראיים / ערוץ ולכמת באמצעות תוכנת ImageJ. </li></ol> 7. נציג תוצאות למרות האנדותל בכלי הדם נחשפת אחיד אגוניסטים התורמים דלקת מערכתית, טרשת עורקים היא מחלה מיקוד המפתחת מעדיפים באתרים של הפרעה בזרימת בעורקים, לסבך את ההטרוגניות המרחבית בתפקוד האנדותל. 8 </sup&gt; מתווכים דלקתיים במחזור כגון TNF-α גבוהות בסרום האדם תחת לחץ מטבוליות לתאם עם תפקוד אנדותל לקוי. 9, 10 TNF-α גורם לתגובה היטב מאופיין של הנציבות האירופית, הכוללת את ויסות של מולקולות הידבקות התא (CAMS למשל: VCAM-1, ICAM-1, E-selectin) ו כמוקינים כי מונוציטים לגייס מהמחזור, סימן ההיכר של הנגע טרשת עורקים מוקדמת 11 ופרמטרים המודינמיים הוא הרגולטור חשוב של הפנוטיפ דלקתית האנדותל 12 מתח גבוה גזירה גודל (HSS.. למשל 15 dynes / cm 2) או מאמץ גזירה pulsatile (PSS, למשל 15 ± 5 dynes / 2 ס&quot;מ) קשורה לאתרים של התנגדות טרשת עורקים בעורקים למטה המסדירים TNF-α-Induced תגובות. לעומת זאת, בסדר גודל נמוך גזירה מתח (LSS, למשל 2 dynes / cm 2) או oscillatory גזירה (OSS, למשל 0 5 ± dynes / 2 ס&quot;מ), האופייניים לאתרים רגישים in vivo, להחמיר cytokine-Induced דלקת. 13, 14 microfluidic שלנו התקנים PDMS לספק פלטפורמה לביצוע מחקרים מכניסטית לבחון את ההשערות הקשורות סופרפוזיציה של מתח חילוף החומרים עם גורמים הידרודינמית בוויסות של תפקוד האנדותל והפתולוגיה. השירות צדדיות של הגישה באה לידי ביטוי באופן נרחב דרך את התוצאות הבאות מייצגות. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מאמץ גזירה דיפרנציאלי מודולציה THP-1 הידבקות התא TNF-אלפא monolayers אנדותל מודלק. נתונים אלה נרכשו באמצעות פרוטוקול מפורט לעיל ותיעד בווידיאו. Monolayers HAEC נחשפו בעת ובעונה אחת מינון נמוך של ציטוקינים דלקתיים TNF-α (0.5 ng / ml, EC ~ 50 עבור VCAM-1 את ויסות) ואו HSS (15 dynes / cm 2) או OSS (0 ± 5 dynes / 2 ס&quot;מ, 1 הרץ) ב CSD מותאם אישית עבור שעות 4 כמו descriהמיטה בפרוטוקול מפורט. THP-1 תא המעצר היה לכמת תחת זרימת גזירה בתא זרימת PDMS. קו זה תא המחקה את הפנוטיפ של מונוציטים אדם נבחר שחזור שלו וקלות השימוש. HSS נחלש את התגובה הדלקתית לעומת OSS, וכתוצאה מכך ירד מעצר-1 THP התא. הנתונים נותחו על ידי הסטודנטים של מבחן t ו מיוצגים ממוצע ± SEM של 3 ניסויים בלתי תלויים. עיבוד באישור DeVerse et al. 5 את הנתונים הבאים ממחישים את צדדיות של הגישה שלנו באמצעות דוגמאות מן העבודה לאור שלנו. יציאות מן הפרוטוקול הנ&quot;ל מסומנים לפי העניין. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. אפנון של ביטוי ציטוקינים הנגרמת-1 VCAM וגיוס מונוציטים ב שיפוע מאמץ גזירה. א) monolayers HAEC היו מגורה עם TNF-α (0.3 ng / ml) עבור 4 שעות תחת פלוw ב VMMC תוכנן בהתבסס על התיאוריה Hele, שו זרימה. 15 ירידה ליניארית בעוצמת SS לאורך קו האמצע של ערוץ הושגה על ידי עיצוב הצדדיים של החדר יעלה בקנה אחד עם מייעלת הזרימה 2 קיפאון ממדית ועיצוב בסוף הערוץ להתאים את ISO-פוטנציאליים הקווים. הלחץ גזירה הקיר (τ W) שנוצר לאורך קו האמצע של ערוץ זה במרחק צירית מהכניסה (x) נתון על ידי: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq3.jpg" alt="המשוואה 3" /> שם μ הוא צמיגות של המדיום, ש הוא שיעור זרימת נפח, h הוא גובה התעלה, w 1 היא הכניסה את רוחב הערוץ, ו-L הוא אורך הערוץ הכולל. Q נבחרה כדי ליצור שיפוע בסדר גודל SS מ 16 dynes / 2 ס&quot;מ על כניסת עד 0 בנקודת קיפאון &quot;&quot; הפרוקסימלי רק כדי outleלא. B)-C) VCAM-1 הביטוי נמדד באתרו על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence באמצעות נוגדנים מצומדות על נקודות קוונטיות והציג כמו עוצמת הקרינה אחוז החציוני (MFI) לחוק הפיקוח סטטי unstimulated. אס לא לווסת את רמת הבסיס של VCAM-1, שהוא נמוך HAEC unstimulated (משולשים אפורים). עם זאת, VCAM-1 ביטוי מוגבר יחסית TNF-α על הבהירויות LSS, לשיא ב ~ 2 dynes / 2 ס&quot;מ ולחזור הבסיס TNF-α או מתחת בכל הבהירויות גזירה&gt; dynes 5/2 ס&quot;מ (ריבועים שחורים). ד) מונוציטים (10 6 / מ&quot;ל) היו perfused ב 2 dynes / 2 ס&quot;מ על 5 דקות בכל ערוצי הזרימה במקביל על monolayers preconditioned כמו). גיוס מונוציטים כדי האנדותל בקורלציה כמותית על גודל נתון מאמץ גזירה עם הביטוי VCAM-1. יש לציין, את היכולת לחקור VCAM-1 ביטוי וגיוס מונוציטים עם רזולוציה מרחבית קנס monolayeמחקר גילה שינויים משמעותיים על פני טווח צר גודל אס כי לא יהיה מוערך על ידי יישום רק כמה ערכים בדידים של גזירה בניסויים נפרדים. הנתונים נותחו על ידי ANOVA צעדים חזר והפרשי שהוערכו על ידי ניומן-Keuls posttest, * p &lt;0.05 מ TNF-α בתנאים סטטיים. הנתונים הם ממוצע ± SEM מ 3-6 ניסויים בלתי תלויים. עיבוד באישור Tsou et al. 2 <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. הטריגליצרידים עתירי ליפופרוטאין (TGRL) לווסת ציטוקינים-Induced דלקת ביחס בסרום התורמות רמות טריגליצרידים ו VCAM-1 הביטוי. Monolayers HAEC היו מגורה עם TNF-α (0.3 ng / ml) עבור 4 שעות בו זמנית עם TGRL (10 מ&quot;ג / ד&quot;ל ApoB) מבודד בבני אדם לאחר הארוחה שומן גבוהה בתרבות סטטי.) VCAM-1 הביטוי נמדד בנפרד על ידי cytometry לזרום EC מושעהו הידבקות מונוציטים לכמת באמצעות VMMC כמתואר בפרוטוקול מפורט. הנתונים מוצגים כשינוי% מ TNF-α. מעצרו מונוציטים משתנה ביחס ישר ביטוי האנדותל VCAM-1, אשר הגדילו באופן ישיר מרמת טריגליצרידים בדם התורם. ב &#39;) מעצרו של מונוציטים משנה של הפרו דלקתיים תורמים בוטל בנוכחות נוגדנים VCAM 1-חוסם. משמעות נקבע על ידי זיווג הסטודנטים של מבחן t, כלומר ± SEM מ 3-5 ניסויים בלתי תלויים. עיבוד באישור וואנג et al. 4

<ol>
	<li>Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+mimetics+based+on+microfluidics+for+imaging+the+leukocyte--endothelial+inflammatory+response.">Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response.</a> Lab Chip. 7, 448-456 (2007).</li><li>Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+inflammation+by+human+aortic+endothelial+cells+in+a+linear+gradient+of+shear+stress.">Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress.</a> Microcirculation. 15, 311-323 (2008).</li><li>Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride-rich+lipoproteins+prime+aortic+endothelium+for+an+enhanced+inflammatory+response+to+tumor+necrosis+factor-alpha.">Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha.</a> Circ. Res. 100, 381-390 (2007).</li><li>Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+inflammation+correlates+with+subject+triglycerides+and+waist+size+after+a+high-fat+meal.">Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).</li><li>Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+modulates+rage-mediated+inflammation+in+a+model+of+diabetes-induced+metabolic+stress.">Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).</li><li>Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+endothelial+phenotypes+evoked+by+arterial+waveforms+derived+from+atherosclerosis-susceptible+and+-resistant+regions+of+human+vasculature.">Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis-susceptible and -resistant regions of human vasculature.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14871-14876 (2004).</li><li>Young, E. W., Wheeler, A. R., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+adhesion+of+vascular+and+valvular+endothelial+cells+in+microfluidic+channels.">Matrix-dependent adhesion of vascular and valvular endothelial cells in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7, 1759-1766 (2007).</li><li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Guerraty, M. A., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+associated+with+regional+athero-susceptibility+and+adaptation+to+disturbed+blood+flow+in+vivo.">Endothelial heterogeneity associated with regional athero-susceptibility and adaptation to disturbed blood flow in vivo.</a> Semin Thromb Hemost. 36, 265-275 (2008).</li><li>Burdge, G. C., Calder, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cytokine+response+during+the+postprandial+period:+A+potential+causal+process+in+vascular+disease.">Plasma cytokine response during the postprandial period: A potential causal process in vascular disease.</a> Br. J. Nutr. 93, 3-9 (2005).</li><li>Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+metabolic+disorders.">Inflammation and metabolic disorders.</a> Nature. 444, 860-867 (2006).</li><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+atherosclerosis.">Inflammation in atherosclerosis.</a> Nature. 420, 868-874 (2002).</li><li>Nigro, P., Abe, J., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+shear+stress+and+atherosclerosis:+A+matter+of+site+specificity.">Flow shear stress and atherosclerosis: A matter of site specificity.</a> Antioxid Redox Signal. 15, 1405-1414 (2011).</li><li>Chiu, J. J., Lee, P. L., Chen, C. N., Lee, C. I., Chang, S. F., Chen, L. J., Lien, S. C., Ko, Y. C., Usami, S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+increases+icam-1+and+decreases+vcam-1+and+e-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-[alpha]+in+endothelial+cells.">Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).</li><li>Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells.">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).</li><li>Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+construction+of+a+linear+shear+stress+flow+chamber.">Design and construction of a linear shear stress flow chamber.</a> Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).</li><li>Helmke, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+cytoskeletal+mechanics+by+hemodynamic+forces.">Molecular control of cytoskeletal mechanics by hemodynamic forces.</a> Physiology (Bethesda). 20, 43-53 (2005).</li><li>Gower, R. M., Wu, H., Foster, G. A., Devaraj, S., Jialal, I., Ballantyne, C. M., Knowlton, A. A., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cd11c/cd18+expression+is+upregulated+on+blood+monocytes+during+hypertriglyceridemia+and+enhances+adhesion+to+vascular+cell+adhesion+molecule-1.">Cd11c/cd18 expression is upregulated on blood monocytes during hypertriglyceridemia and enhances adhesion to vascular cell adhesion molecule-1.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 160-166 (2011).</li><li>Wu, H., Gower, R. M., Wang, H., Perrard, X. Y., Ma, R., Bullard, D. C., Burns, A. R., Paul, A., Smith, C. W., Simon, S. I., Ballantyne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+cd11c++monocytes+in+atherogenesis+associated+with+hypercholesterolemia.">Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia.</a> Circulation. 119, 2708-2717 (2009).</li><li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress.">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

אנו מתארים את השימוש במכשירים microfluidic PDMS להערכה על שבב של הפנוטיפ דלקתי האנדותל באמצעות הדמיה בזמן אמת הביטוי CAM ו הידבקות מונוציטים. היתרון העיקרי של הגישה שלנו טמון ביכולת לכמת את התוצאות הקשורות בתפקוד האנדותל בתאים שנחשפו מתווכים דלקתיים כגון ציטוקינים שומנים תז...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> 100 x 20 מ&quot;מ צלחות פטרי </td><td> BD פלקון </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 95% אתנול </td><td> EMD כימיקלים </td><td> EX0290-1 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> הקלד לי זנב עכברוש קולגן נגזר </td><td> Gibco </td><td> A10483-01 </td></tr><tr><td> אדם לתאי אנדותל העורקים </td><td> Genlantis </td><td> PH30405A </td></tr><tr><td> אנטיביוטיקה Antimycotic פתרון </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> אנדותל BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> הבסיס אנדותל Media-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;ל מזרקים </td><td> BD פלקון </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> פוליאוריתן צינורות </td><td> Tygon </td><td> ABW0001 </td></tr><tr><td> ליבוביץ, 15 מדיה </td><td> Gibco </td><td> 11415-069 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 אלסטומר סיליקון בסיס </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 אלסטומר סיליקון אשפרה הסוכן </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td></tr><tr><td> SU8 photoresist ופלה מאסטר </td><td> UC Davis פאן מעבדה </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Eclipse TE200 מיקרוסקופ הפוך </td><td> ניקון </td><td> Eclipse TE200 </td></tr><tr><td> מזרק משאבה </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> PHD2000 </td></tr><tr><td> 19 המזרק מחט מד </td><td> קנדל </td><td> 8881 </td></tr><tr><td> THP-1 תא Monocytic קו </td><td> ATCC </td><td> TIB-202 </td></tr><tr><td> HBSS (הנקס שנאגרו תמיסת מלח) עם Ca 2 + / Mg 2 + </td><td&gt; Gibco </td><td> 14025-092 </td></tr><tr><td> הגידול גורם נמק אלפא (TNF-α) </td><td> מחקר ופיתוח מערכות </td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td> פקטור נגזר סטרומה - 1 (SDF-1) </td><td> מחקר ופיתוח מערכות </td><td> 350-NS-010 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040-CV </td></tr><tr><td> האדם אלבומין בסרום (HSA) </td><td> ZLB בהרינג </td><td> NDC 0053-7680-32 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. חומרים כימיים ספציפיים וציוד.

on-chip endothelial inflammatory phenotyping

Atherogenesis הוא potentiated על ידי הפרעות מטבוליות שתורמים למדינה מוגברת של דלקת מערכתית וכתוצאה מכך תפקוד האנדותל. עם זאת, שינויים תפקודיים מוקדמים האנדותל מסמנים כי רמת הסיכון של הפרט לא מוערכים ישירות קלינית לעזור האסטרטגיה מדריך טיפולי. יתר על כן, ויסות דלקת ידי ופרמטרים המודינמיים מקומיים תורם ההפצה הלא אקראית המרחבי של טרשת עורקים, אך המנגנונים קשה להתוות in vivo. אנו מתארים גישה מבוססת מעבדה על שבב כדי ההפרעות כמותית assay חילוף החומרים של אירועים דלקת בתאי אנדותל אנושיים (EC) ומונוציטים בתנאים תזרים מדויקות. שיטות סטנדרטיות של ליתוגרפיה רך משמשים microfabricate כלי הדם לתאי microfluidic כוזב (VMMC), אשר קשורים ישירות בתרבית monolayers EC. 1 מכשירים אלה יש את היתרון של שימוש בכמויות קטנות של חומרים כימיים תוךמתן במה הדמיה ישירות את האירועים דלקת קרום בבית של EC נחשף לשדה מוגדר היטב גזירה. יש לנו מיושם בהצלחה את המכשירים האלו לחקור ציטוקינים-2, שומנים בדם 3, 4 ו - 5 RAGE-Induced דלקת האנושי אבי העורקים EC (HAEC). כאן אנו מתעדים את השימוש VMMC לתא assay מתגלגל monocytic (THP-1) ומעצר על monolayers HAEC כי הם מותנים על פי מאפיינים גזירה דיפרנציאלי והופעל על ידי ציטוקינים דלקתיים TNF-α. מחקרים כגון אלה מספקים תובנה מכניסטית לתוך atherosusceptibility תחת גורמי סיכון מטבוליים.

Watch this Scientific Journal Video about On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping at JoVE.com

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

חדרי זרימת microfluidic חרוט על ידי photolithography מפוברק מ PDMS מוחלים לחקור התוצאות התפקודיות הקשורות בתפקוד EC ודלקת. בניסוי מייצג, את היכולת של מאמץ גזירה ההפרש לווסת הידבקות התא monocytic כדי הפעלת ציטוקינים EC monolayers באה לידי ביטוי.

על שבב phenotyping דלקתיות האנדותל

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

on-chip-endothelial-inflammatory-phenotyping

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.8K Views.  University of California, Davis. חדרי זרימת microfluidic חרוט על ידי photolithography מפוברק מ PDMS מוחלים לחקור התוצאות התפקודיות הקשורות בתפקוד EC ודלקת. בניסוי מייצג, את היכולת של מאמץ גזירה ההפרש לווסת הידבקות התא monocytic כדי הפעלת ציטוקינים EC monolayers באה לידי ביטוי.

Video: On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the "ITP interface"). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: "peak" and "plateau" modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.

Isotachophoresis (ITP) is a robust electrokinetic separation and preconcentration technique with applications ranging from toxin detection to sample preparation. We review the physical principles of ITP and the methodology of applying this technique to two specific example applications: separation and detection of small molecules and purification of nucleic acids from cell culture lysate.

על שבב Isotachophoresis להפרדה של יוני וטיהור של חומצות גרעין

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

Lensfree על שבב טומוגרפית מיקרוסקופית העסקת רב זווית תאורה פיקסל סופר רזולוציה

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

כימות תכונות המכאניות של Glycocalyx האנדותל עם מיקרוסקופי כוח אטומי

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. The feasibility of using magnetic forces to capture and retain endothelial outgrowth cells (EOC) labeled with super paramagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) has been shown previously. But this technique requires the development of a mechanically functional stent from a magnetic and biocompatible material followed by in-vitro and in-vivo testing to prove rapid endothelialization. We developed a weakly ferromagnetic stent from 2205 duplex stainless steel using computer aided design (CAD) and its design was further refined using finite element analysis (FEA). The final design of the stent exhibited a principal strain below the fracture limit of the material during mechanical crimping and expansion. One hundred stents were manufactured and a subset of them was used for mechanical testing, retained magnetic field measurements, in-vitro cell capture studies, and in-vivo implantation studies. Ten stents were tested for deployment to verify if they sustained crimping and expansion cycle without failure. Another 10 stents were magnetized using a strong neodymium magnet and their retained magnetic field was measured. The stents showed that the retained magnetism was sufficient to capture SPION-labeled EOC in our in-vitro studies. SPION-labeled EOC capture and retention was verified in large animal models by implanting 1 magnetized stent and 1 non-magnetized control stent in each of 4 pigs. The stented arteries were explanted after 7 days and analyzed histologically. The weakly magnetic stents developed in this study were capable of attracting and retaining SPION-labeled endothelial cells which can promote rapid healing.

Our goals were to design, manufacture and test ferromagnetic stents for endothelial cell capture. Ten stents were tested for fracture and 10 more stents were tested for retained magnetism. Finally, 10 stents were tested in-vitro and 8 more stents were implanted in 4 pigs to show cell capture and retention.

Bare Metal פרומגנטי סטנט ללכיד תא האנדותל ושייר

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

פלטפורמה מבוססת Photoresist ביוסנסור אלקטרוכימי Microfluidic הסרט יבש: ייצור המכשיר, הכנה על שבב Assay, ותפעול המערכת

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

ייצור ואימות מערכת איברים על שבב עם אלקטרודות משולבת ישירות לכמת התנגדות חשמלית Transendothelial

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

תפוקה גבוהה שמרים להתאמץ פנוטיפים עם רצפי רנ א מבוססי Droplet

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue architecture. In current layer-by-layer extrusion bioprinting, individual cells are extruded in a bioink together with complex spatial and temporal cues to promote hierarchical tissue self-assembly. However, this biofabrication technique relies on complex interactions among cells, bioinks and biochemical and biophysical cues. Thus, self-assembly may take days or even weeks, may require specific bioinks, and may not always occur when there is more than one cell type involved. We therefore developed a technique to directly bioprint pre-formed 3D breast epithelial spheroids in a variety of bioinks. Bioprinted pre-formed 3D breast epithelial spheroids sustained their viability and polarized architecture after printing. We additionally printed the 3D spheroids onto vascular endothelial cell networks to create a co-culture model. Thus, the novel bioprinting technique rapidly creates a more physiologically relevant 3D human breast model at lower cost and with higher flexibility than traditional bioprinting techniques. This versatile bioprinting technique can be extrapolated to create 3D models of other tissues in additional bioinks.

The goal of this protocol is to directly bioprint breast epithelial cells as multicellular spheroids onto pre-formed endothelial networks to rapidly create 3D breast-endothelial co-culture models which can be used for drug screening studies.

הדפסה ביולוגית ישירה של ספירואידי שד רב-תאיים תלת-תאיים ברשתות אנדותל

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, inflammation, and homeostasis. The endothelium also plays an important role in pathophysiologies such as atherosclerosis, hypertension, and diabetes. Endothelial cells form the inner lining of blood and lymphatic vessels and display heterogeneity in structure and function. Various groups have evaluated the functionality of endothelial cells derived from human peripheral blood with a focus on endothelial progenitor cells derived from hematopoietic stem cells or mature blood outgrowth endothelial cells (or endothelial colony-forming cells). These cells provide an autologous resource for therapeutics and disease modeling. Xenogeneic cells may provide an alternative source of therapeutics due to their availability and homogeneity achieved by using genetically similar animals raised in similar conditions. Hence, a robust protocol for the isolation and expansion of highly proliferative blood outgrowth endothelial cells from porcine peripheral blood has been presented. These cells can be used for numerous applications such as cardiovascular tissue engineering, cell therapy, disease modeling, drug screening, studying endothelial cell biology, and in vitro co-cultures to investigate inflammatory and coagulation responses in xenotransplantation.

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells BOEC from Porcine Peripheral Blood

אפיון צמיחת דם תאי אנדותל (BOEC) מדם היקפי חזירי

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

מערכת מיקרופיזיולוגית לחקר אינטראקציה תאי לויקוציטים-אנדותל במהלך דלקת

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...