Biz istatistiksel analizler ile yardım için, mükemmel teknik yardım C. Hammer ve S. Papiol N. Schwedhelm-Domeyer teşekkür ederim. Çalışmalarımız Max Planck Derneği, Deutsche Forschungsgemeinschaft, Nanoseviye Mikroskopi Merkezi ve Beyin Moleküler Fizyoloji (CNMPB), Göttingen, Almanya ve Göttingen Üniversitesi GGNB Gençler Grubu Stipend tarafından finanse edilmektedir.

CGNs ya da doğum sonrası gün (P) 5 fare yavrular ya da P6 sıçan yavrularından hazırlanabilir. Biz postmitotic CGNs 13 seçmek için bir mitoz inhibitörü kullanan Bilimoria ve meslektaşları tarafından açıklanan bir protokol, izleyin. Etik beyanı: Canlı hayvanlar içeren tüm deneyler Aşağı Saksonya, Almanya &quot;Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit&quot; tarafından onaylanan hayvan protokole göre yapılmıştır. Vitro tahlilde: 1.. Örneğin kalsiyum fosfat transfeksiyonu için yöntem Plazmid DNA, medya ve Tamponlar hazırlanması <ol><li> Steril, endotoksin içermeyen su içinde plasmid DNA içinde çözündürülür, DMEM (yüksek glukoz), 2.5 M CaCI2 yapmak, 2x HBSS (4 g NaCl, 0,1775 g KCI, 0.095 g 2 HPO 4 • 7H 2 O, 0.675 g glikoz Na çözülür yapmak ve 2.5 g 250 ml ultra saf su içinde HEPES ve 7.05, 7.08 ve 7,11) pH ayarlanır. Not: hazırlarken2x HBSS çözeltisi ile, verilen plazmidlerin kombinasyonunun transfeksiyon verimi ile ilgili olarak en iyi sonuçları verir testi. </li></ol> 2. Kültür Nöronlar transfeksivonu <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig1.jpg" /> Şekil 1. In vitro akson ve dentrit büyümesi tahlilinin akış şeması. Kültürlü CGNs P6 sıçan yavrularından izole edilmiş (cam kapak slipleri ile 24-çukurlu plaka), bir fluoresan işaretleyici transfeksiyon (örneğin GFP) ihtiva eden bir çökelti ile DIV DNA, 0 ya da 1 ile transfekte edilir. Tespit ve İmmünositokimya sonra, nöronlar kör bir şekilde görüntülenmiş. Görüntüler ImageJ içine alınır ve işlemler ölçülür. Ölçümler, daha sonra bir istatistik programı kullanılarak işlenir. <ol><li> Tohum CGNs (20 x 10 6 24-çukurlu plaka başına, BME,% 10 dana serumu, 2 mM Penisilin-Streptomycin-Glutamin (PSG), 25 mM KCl) ortam 500 ul, 24 oyuklu bir plaka içerisinde nitrik asitle yıkanmış, poliornitin-kaplanmış 12 mm cam lameller üzerinde oyuk başına. </li><li> In vitro olarak günde (DIV) 0 (en az 8 saat sonra kaplama) ya da DIV 1, büyüme ortamı toplamak ve 37 ° C de tutmak Önceden ısıtılmış 500 ul DMEM içinde iki kere yıkayın nöronlar ve DMEM içinde 500 ul ekleyin. </li><li> Kuluçka makinesi içinde yer nöronlar (37 ° C,% 5 CO2) 45 dakika boyunca karıştırılır. </li><li> Karıştırılarak her bir oyuk için 40 ul DNA çökeltisinin hazırlanması: DNA (2-2.5 ug / gözenek, toplam DNA itibarıyla% 10 transfekte nöronlar görselleştirmek için bir transfeksiyon işaretleyici, örneğin GFP olmalıdır), su (18 ul kadar), 2 ul ilave edin 2.5 M CaCl2, iyice karıştırın ve 2x HBSS 20 ul ekle. <ol><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DNA çökeltisi inkübe edin. </li></ol></li><li> Her bir oyuğa DNA çökeltisi ekleme ve kuluçka makinesi içinde 18 dakika boyunca inkübe nöronlar. </li><li> DMEM / DNA karışımı çıkarın ve önceden ısıtılmış DM 500 ul ile iki kez yıkayın nöronlarEM. </li><li> Nöronlara geri adım 2.2 den toplanan ortam ekleyin. Nöronlar fazla 3 gün, karbon kaynağı doldurmak DIV 3 25 mM glükoz ile ek ortam kültür içinde olacaksa. </li><li> 1-5 gün sonra, GFP antikor immünsitokimya tabi nöronları kullanarak. </li><li> Bir floresan mikroskop kullanılarak kör yöntemle durumun başına Görüntü en az 30 bireysel nöronlar. </li></ol> 3. NeuronJ, bir NIH ImageJ tapa ile ölçün Aksonlar ve Dendritler Önemli: um oran büyütme ve görüntü çözünürlüğüne bağlı: Görüntüler uygun piksel kullanılarak correctluy ölçekli emin olun. <ol><li> ImageJ ile 8-bit görüntüleri dönüştürün: Açık görüntü, &#39;resim&#39; seçin -&gt; &#39;Tür&#39; -&gt; &#39;8-bit &#39;-&gt;&#39; Kaydet &#39;görüntü. </li><li> NeuronJ eklentisi çalıştırmak ve 8-bit görüntü açın. <img alt="ekran görüntüsü" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot1.jpg" width="500px" /></li><li> Cl: akson izlemek için &#39;Ekle iz&#39; seçeneğini kullanınakson başında bir kez sol fare düğmesi ick ve süreç boyunca fareyi hareket ettirin. Akson ucunda çift tıklama iz akson şekli eşleşirse. <img alt="ekran görüntüsü" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot2.jpg" width="500px" /> Not: Önerilen iz akson şekli farklı,, akson ucunda sonra çift tıklayın iz demirlemek için aksonal süreci üzerinde bir kez tıklayın. </li><li> Seçeneğini basın &#39;Çalıştır&#39; &#39;Görüntü izleme ölçümleri&#39; seçin, &#39;Ölçü trasların&#39; üzerine tıklayın. Akson ölçümleri her yeni bir pencerede görüntülenir. Dendritlerin için, &#39;Görüntü grup ölçümleri seçeneğini&#39; basın &#39;Çalıştır&#39; seçeneğini seçin. <img alt="ekran görüntüsü" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot3.jpg" width="500px" /> Toplam dendrit ölçümleri tüm yeni bir pencerede görüntülenir. Herhangi bir elektronik tablo programı açılabilir ayrı bir dosya olarak kaydedebilirsiniz. </li><li> Alternatif manuel izleme için, Fiji yazılımı kullanın: Sağ inci tıklayınE &#39;Düz çizgi&#39; seçeneği, &#39;Freehand çizgi&#39; seçin, <img alt="ekran görüntüsü" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot4.jpg" width="500px" /> basılı sol fare düğmesi tutmak ve elle sürecini izlemek, basın &#39;Ctrl + M&#39; ölçmek için. </li><li> Durum başına ortalama akson / dendritik uzunluğunu hesaplamak ve uygun istatistiksel testi kullanın. Vivo elektroporasyon: </li></ol> 1.. Ekipman ve Reaktifler hazırlanması <ol><li> 30 G iğne, boşluk (1-2 mm), şırınga, ölü hacim düşürücü (DVR), elektrogözenekleme ve tweezertrodes, ısıtma pedi veya kızılötesi ısı lambası, boynu lamba ve izofluran gerekir. </li><li> Iğne içine DVR koymak, sonra şırıngaya iğne takılır, ve nihayet (Şekil 2) iğne üzerine boşluk koymak. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig2.jpg" /> Rakam2. Iğne. DVR hazırlanması 200 ul pipet kesti ve ölü hacmini azaltmak için iğne yerleştirilir. Spacer 200 ul yükleme ucundan elde edilen ve yaklaşık olarak 2 mm beyincik içine nüfuz derinliğini düzenleyen iğnenin ucuna yerleştirilir. Cetvel birimleri: cm </li><li> PBS/0.03% Hızlı Green DNA çözülür. Not: Bir transfeksiyon bir işaretleyici olarak, sadece nöronlar görselleştirmek için bir nörona özgü promoter (ör synapsin) altında olan bir floresan proteini kullanmak avantajlıdır. Toplam plazmid miktarın% 25&#39;i transfeksiyon işaretleyicisini kodlayan plazmid olmalıdır. </li><li> % 70 etanol olun. </li><li> Ekim eşit hacimleri ve PBS içinde çözülmüş% 30 sukroz karıştırın. </li><li> DNA (PBS/0.03% Fast Green plazmid DNA&#39;nın 4 ug / ul), 4 ul şırınga doldurun. </li></ol> 2. Sıçan Yavrularının ive İVE Akış Şeması: Şekil 3&#39;e bakın <p class="jove_content" fo:keep-together.withinSayfa = &quot;Her zaman&quot;&gt; <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig3.jpg" /> Şekil 3,. In vivo elektroporasyon. P4 sıçan yavrularının Akış Şeması beyincik içine enjekte edilir 5 elektrik sinyalleri maruz bırakılarak, ardından, izofluran ve bir fluoresan işaretleyici transfeksiyon (örneğin GFP) kodlayan plasmid DNA ile anestezi edilmiştir. Beş gün sonra, izole edilmiş GFP-pozitif cerebella kesitli ve immünohistokimya tabi tutulur. Görüntüler bir konfokal mikroskop kullanılarak yakalandı ve Imaris yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. Veriler istatistiksel program ile işlenir. <ol><li> Albino suşu (Wistar veya Long Evans) P4 sıçan yavrular kullanın. </li><li> Yavru hareketli artık kadar 1-2 dakika boyunca izofluran (doku içinde ıslatılmış) 200 ul küçük kutu (örn. P1000 pipet ucu kutusu) izofluran ile yavrular (birbiri ardına) anestezisi. Yavrular w temas alamadım dikkat edinith isofluranın sıvı duyarlılık. Bireysel yavrular anestezi farklı yanıt olarak yakından zaman izleyin. </li><li> % 70 etanol ile geri yavrunun kafası sterilize. </li><li> Başparmak ve işaret parmağı arasında yavru başını düzeltmek ve albino yavru beyincik bulmak için boynu lamba kullanabilirsiniz. Transvers sinüs keskin kortikal hemisferden Ortabeyin (üst ve alt kollikulus) (Şekil 3) demarcates. Beyincik Ortabeyinde bitişiğinde bulunan ve koyu bir gölge belirir. Bir nokta ile beyincik belirtmek için kalıcı bir kalem kullanın. Önemli: Sabit pozisyonda yavru tutun! Not: Bu işlem sırasında anestezi kapalı giymeli, önce DNA enjekte izoflurana yavruyu maruz. </li><li> İğneyi (Şekil 3) takın ve yavaş yavaş beyincik DNA&#39;nın 3 ul enjekte. </li><li> DNA solüsyonu, 30-60 saniye için yaygın olsun. <ol><li> Eksi kutup başının arkasına (serebella&#39;sı ile temas yapar o kadar tweezertrodes arasında yavru başını yerleştirinr bölgesi) ve artı kutup temas kafanın karşı tarafına (Şekil 3) bu. </li><li> 5 elektriksel darbeleri tabi yavru. Hayatta kalma (Tablo 1) ödün vermeden iyi bir verim sağlamak için elektroporasyon yavruların ağırlığına gerilimi ayarlar. <table border="0"><tbody><tr><td> Ağırlık </td><td> Gerilim </td><td> Nabız </td><td> Aralık </td></tr><tr><td> 8-9 g </td><td> 160 V </td><td> 50 msn </td><td> 950 ms </td></tr><tr><td> 9-10 g </td><td> 165 V </td><td> 50 msn </td><td> 950 ms </td></tr><tr><td> &gt; 10 g </td><td> 170 V </td><td> 50 msn </td><td> 950 ms </td></tr></tbody></table> Tablo 1. P4 sıçan yavruların eîektroporasyonu. </li><li> Yavrular ısıtılmış pad üzerinde veya kızılötesi lamba altında kurtarmak edelim. Baraj yavrular dönün. Önemli: Isıtma kaynağı herhangi yanıklara vermek olmadığından emin olun. </li></ol></li><li> CO başı kesilerek 2 izledi onları yerleştirerek 5 gün elektroporasyon sonra yavrular kurban. <ol><li> Bir floresan mikroskop kullanılarak serebella&#39;sı GFP pozitif olanlar için cerebella ve ekran izole. </li></ol></li><li> O cerebella lavabo kadar tüpün dibine 4 ° C&#39;de% 30 sukroz içinde inkübe, 4 ° C &#39;de% 4 PFA O / N cerebella düzeltildi. </li><li> OCT/30% sakaroz cerebella embed ve sirostat kullanılarak 40 mikron koronal bölümleri kesti. Not: Bir kör bir şekilde Bölüm her beyincik. </li><li> Konu bölümleri GFP antikor kullanarak immünohistokimyaya. Nükleer boya (DAPI veya Hoechst 33258) Counterstain ve hayvan başına en az 200 transfekte nöronların lokalizasyonu belirler. </li><li> Derinlemesine bir analizi için, ML ve beyaz madde bakan bir düşük değerli IGL bakan bir üst IGL sonuçlanan parçaya IGL bölmek ve her yarım ikamet GFP-pozitif nöronların sayısı. Not: Bir kör bir şekilde her bölümün GFP pozitif nöronlar Kont. </li&gt; </ol> 3. Dendrite Uzunluk Ölçme, bir konfokal mikroskop kullanılarak x, y, z Düzlem Bölüm görüntüleri Edinme Not: örneğin, 1 um bir z-stwp ile 40 mikron bölüm için 40 görüntüleri kullanır. <ol><li> Dendritler bir 3D görüntü oluşturmak için yazılım, Imaris açık resim serisi. </li><li> 3D nöron görüntülemek için &#39;aşmak&#39; moduna tıklayın. <img alt="ekran görüntüsü" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot5.jpg" width="500px" /></li><li> &#39;Yeni filamanın Ekle&#39; seçeneğini seçin ve yarı otomatik izlemeyi başlatmak için &#39;otomatik oluşturulmasını yap&#39; ı tıklatın. <img alt="ekran görüntüsü" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot6.jpg" width="500px" /> Not: Bir kör bir şekilde her 3D görüntü analiz </li><li> &#39;Beraberlik&#39; sekmesini ve &#39;autopath&#39; seçeneğini seçin. <img alt="ekran görüntüsü" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot7.jpg" width="500px" /></li><li> C fare imleciell vücut ve Shift + fare sağ hücre gövdesini seçmek için tıklatın. Not: yazılım tarafından Autocalculation birkaç dakika gerekebilir. <img alt="ekran görüntüsü" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot8.jpg" width="500px" /></li><li> Shift + fare sol tıklama kullanarak filamanın (dallantı) yol eklemek. Not: Yollar gerçek zamanlı olarak görülebilir. <img alt="ekran görüntüsü" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot9.jpg" width="500px" /></li><li> Filament istatistik pencereye gidin ve &#39;Ayrıntılı&#39;, &#39;Belirli değerleri&#39; ve toplam dendrit uzunluğu toplamı için &#39;Filament dendrit uzunluğu (toplamı)&#39; üzerine tıklayın. <img alt="ekran görüntüsü" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot10.jpg" width="500px" /></li><li> Verileri analiz etmek için uygun istatistiksel testler kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Cajal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histology of the nervous system of man and vertebrates. , (1995).</li><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).</li><li>White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wholemount+immunohistochemistry+for+revealing+complex+brain+topography.">Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Palay, S. L., Chan-Palay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cerebellar cortex: cytology and organization. , (1974).</li><li>Hatten, M. E., Alder, J., Zimmerman, K., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+involved+in+cerebellar+cell+specification+and+differentiation.">Genes involved in cerebellar cell specification and differentiation.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 7, 40-47 (1997).</li><li>Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+neural+patterning+and+specification+in+the+developing+cerebellum.">Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum.</a> Annu. Rev. Neurosci. 18, 385-408 (1995).</li><li>Sillitoe, R. V., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+molecular+codes,+and+circuitry+produce+the+three-dimensional+complexity+of+the+cerebellum.">Morphology molecular codes, and circuitry produce the three-dimensional complexity of the cerebellum.</a> Ann. Rev. Dev. Biol. 23, 549-577 (2007).</li><li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1.">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li><li>Wingate, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rhombic+lip+and+early+cerebellar+development.">The rhombic lip and early cerebellar development.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).</li><li>Kawaji, K., Umeshima, H., Eiraku, M., Hirano, T., Kengaku, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+phases+of+migration+of+cerebellar+granule+cells+guided+by+axonal+and+dendritic+leading+processes.">Dual phases of migration of cerebellar granule cells guided by axonal and dendritic leading processes.</a> Mol. Cell Neurosci. 25, 228-240 (2004).</li><li>Hatten, M. E., Gao, W. -. Q., Morrison, M. E., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+neuroscience.">Cellular and molecular neuroscience.</a> , 419-41 .</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li><li>Bilimoria, P. M., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultures+of+cerebellar+granule+neurons.">Cultures of cerebellar granule neurons.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Rivas, R. J., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+and+cytoskeletal+organization+of+migrating+cerebellar+granule+neurons.">Motility and cytoskeletal organization of migrating cerebellar granule neurons.</a> J. Neurosci. 15, 981-989 (1995).</li><li>Kuhar, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+patterns+of+gene+expression+define+four+stages+of+cerebellar+granule+neuron+differentiation.">Changing patterns of gene expression define four stages of cerebellar granule neuron differentiation.</a> Development. 117, 97-104 (1993).</li><li>Baird, D. H., Hatten, M. E., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+target+neurons+provide+a+stop+signal+for+afferent+neurite+extension+in+vitro.">Cerebellar target neurons provide a stop signal for afferent neurite extension in vitro.</a> J. Neurosci. 12, 619-634 (1992).</li><li>Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+and+fasciculation+linked+to+differential+expression+of+BDNF+and+NT3+receptors+in+developing+cerebellar+granule+cells.">Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells.</a> J. Neurosci. 15, 4970-4981 (1995).</li><li>Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+release+of+glutamate+from+cerebellar+granule+cells+differentiating+in+culture.">Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).</li><li>Smith, T. C., Wang, L. Y., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+kainate+receptor+phenotypes+in+immature+and+mature+mouse+cerebellar+granule+cells.">Distinct kainate receptor phenotypes in immature and mature mouse cerebellar granule cells.</a> Physiol. 517 (1), 51-58 (1999).</li><li>Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdh1-APC+controls+axonal+growth+and+patterning+in+the+mammalian+brain).">Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain).</a> Science. 303, 1026-1030 (2004).</li><li>Stegmuller, J., Huynh, M. A., Yuan, Z., Konishi, Y., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta-Smad2+signaling+regulates+the+Cdh1-APC/SnoN+pathway+of+axonal+morphogenesis.">TGFbeta-Smad2 signaling regulates the Cdh1-APC/SnoN pathway of axonal morphogenesis.</a> J. Neurosci. 28, 1961-1969 (2008).</li><li>Stegmuller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+regulation+of+axonal+morphogenesis+by+the+Cdh1-APC+target+SnoN.">Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN.</a> Neuron. 50, 389-400 (2006).</li><li>Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Nakazawa, T., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p250GAP+is+a+novel+player+in+the+Cdh1-APC/Smurf1+pathway+of+axon+growth+regulation.">p250GAP is a novel player in the Cdh1-APC/Smurf1 pathway of axon growth regulation.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3+ligase+Cdh1-anaphase+promoting+complex+operates+upstream+of+the+E3+ligase+Smurf1+in+the+control+of+axon+growth.">The E3 ligase Cdh1-anaphase promoting complex operates upstream of the E3 ligase Smurf1 in the control of axon growth.</a> Development. 139, 3600-3612 (2012).</li><li>Gaudilliere, B., Konishi, Y., de la Iglesia, N., Yao, G., Bonni, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII-NeuroD+Signaling+Pathway+Specifies+Dendritic+Morphogenesis.">CaMKII-NeuroD Signaling Pathway Specifies Dendritic Morphogenesis.</a> Neuron. 41, 229-241 (2004).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cdc20-APC+ubiquitin+signaling+pathway+regulates+presynaptic+differentiation.">A Cdc20-APC ubiquitin signaling pathway regulates presynaptic differentiation.</a> Science. 326, 575-578 (2009).</li><li>Litterman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+OBSL1-Cul7Fbxw8+ubiquitin+ligase+signaling+mechanism+regulates+Golgi+morphology+and+dendrite+patterning.">An OBSL1-Cul7Fbxw8 ubiquitin ligase signaling mechanism regulates Golgi morphology and dendrite patterning.</a> PLoS Biol. 9, (2011).</li><li>Kim, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+centrosomal+Cdc20-APC+pathway+controls+dendrite+morphogenesis+in+postmitotic+neurons.">A centrosomal Cdc20-APC pathway controls dendrite morphogenesis in postmitotic neurons.</a> Cell. 136, 322-336 (2009).</li><li>Shalizi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium-regulated+MEF2+sumoylation+switch+controls+postsynaptic+differentiation.">A calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls postsynaptic differentiation.</a> Science. 311, 1012-1017 (2006).</li><li>Vadhvani, M., Schwedhelm-Domeyer, N., Mukherjee, C., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Centrosomal+E3+Ubiquitin+Ligase+FBXO31-SCF+Regulates+Neuronal+Morphogenesis+and+Migration.">The Centrosomal E3 Ubiquitin Ligase FBXO31-SCF Regulates Neuronal Morphogenesis and Migration.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKIIbeta+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nat. Neurosci. , (2011).</li><li>Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC+channels+promote+cerebellar+granule+neuron+survival.">TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival.</a> Nat. Neurosci. 10, 559-567 (2007).</li><li>Huynh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isoform-specific+SnoN1-FOXO1+repressor+complex+controls+neuronal+morphogenesis+and+positioning+in+the+mammalian+brain.">An isoform-specific SnoN1-FOXO1 repressor complex controls neuronal morphogenesis and positioning in the mammalian brain.</a> Neuron. 69, 930-944 (2011).</li><li>de la Torre-Ubieta, L., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+neuronal+polarity+and+morphogenesis+in+the+mammalian+brain.">Transcriptional regulation of neuronal polarity and morphogenesis in the mammalian brain.</a> Neuron. 72, 22-40 (2011).</li><li>Calissano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+insulin-like+growth+factor+I+exerts+a+trophic+action+and+confers+glutamate+sensitivity+on+glutamate-resistant+cerebellar+granule+cells.">Recombinant human insulin-like growth factor I exerts a trophic action and confers glutamate sensitivity on glutamate-resistant cerebellar granule cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8752-8756 (1993).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Avantajları ve in vitro ve in vivo metotları tarif sınırlamaları: Fare ve sıçan Kültür CGNs eşit derecede iyi morfolojik analizler için uygundur. Bir sıçan beyincik büyük boyutu sayesinde, sıçan yavrularından CNGs verim fare yavrularının 3-4x o aşıyor. Kenara CGNs gelen, kortikal ve hipokampal nöronların yanı sıra kültür sistemi olarak kullanılabilir. Kalsiyum fosfat yöntemi bireysel nöronların morfolojisini analiz etmek için arzu edilen bir...

Beyincik akson büyüme ve göç mekanizmaları incelemek için mükemmel bir sistemdir. Beyincik nörobilim 1 çağlarından itibaren anatomik çalışmaların konusu olmuştur. Modern mikroskobu ve immunohistokimyasal teknikler önemli ölçüde genişletilmiş ve Santiago, Ramon ve üreter, 2-4 ile ilk keşifler rafine var. Fare genetik ve moleküler çalışmalar serebellar granül nöronların (CGNs) 5-7 gibi nöronlar farklı düzgün kablolama için gerekli önemli olayların daha iyi anlaşılmasına yol açan, serebellar gelişme kontrolünde temel büyüme ve transkripsiyon faktörlerini ortaya çıkardı. Beyincik gelişmekte olan arka beyin 8 rhombomere 1 bir türevidir. 4. ventrikül çatı parçası olan eşkenar paralel dudak, en çok nöron popülasyonu oluşturacak serebellar granül nöron progenitörlerinin, yol açaryetişkin beyincik 9. Rostral göç, onlar serebellar anlage yerleşmek. Burada, granül nöron öncülerin mitoz kemirgenlerde doğumdan yer alan granüler tabaka, dış (EGL), dramatik genişlemesine yol açar. EGL itibaren, nöronlar Purkinje hücre tabakası sonuçta iç granüler tabaka (IGL 2) ikamet almak için geçmiş, moleküler tabakası (ML) ile içe göç başlar. Bu göç işlemi sırasında iki aksonlar ML içine uzanan iki kutuplu bir şekil kazanır. Ayrıca geçiş üzerine, hücre gövdesi uzakta aksonlardan göç ve iki işlem, bir çatallı, T-şekilli bir akson 10 oluşturmak için sigorta. Daha sonra, bu bölümler halinde ve akson olarak paralel lifler adlandırılır. IGL yerleşince, CGNs yosunlu lifleri ile sinaps kurmak dendritik pençeleri oluşturur dendrit, büyür. , Gelişen beyincikte temel süreçleri incelemek için, bir in vitro ve in vivo yaklaşımların bir arayah güvenilir sonuçlar ve sonuçlar sağlar. CGNs sadece beyincik ancak tüm beynin en çok nöronlardır ve yüksek saflıkta 11-13 için kültürlenebilir. Kültürde, bu son derece homojen nöronal nüfusu hızla postmitotic olur ve kolayca tanımlanabilir akson ve dendritler ile bir polar morfoloji kazanır. Kültürlü CGNs progenitör çoğalma, farklılaşma, akson ve dendrit gelişim, nöronal göç, apoptoz ve elektrofizyolojik özellikleri (14-19 ve diğerleri) içeren sinirsel gelişimin çeşitli yönlerini incelemek için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Genetik manipülasyon kullanımı kültürlü CGNs çok yönlülüğünü genişletilmiş ve yukarıda belirtilen olayların içine daha fazla mekanik içgörü için izin verdi. Verimliliği düşük kalsiyum fosfat veya kutup işaretleri veya yazılım destekli analiz olanakları ile immünsitokimya ardından lipofilik yöntemleri kullanarak kültürlü nöronların transfeksivonuyoğun bir nöronal kültüründe bireysel nöronların örneğin morfolojisinin değerlendirilmesi tates. Bu yaklaşımla, akson ve dentrit büyümesi ilgi konusu olan proteinlerin rolü 20-25,26-28 incelenebilir. Bu kültür sistemi, bununla birlikte göç çok yüksek yoğunluklu kültürde sınırlı olduğu nöronal göç analiz etmek için daha az yararlıdır ve alt kültürleri olarak gerektirir. Akson ve dentrit büyümesi in vitro analiz, RNA girişim (i) kombinasyonlarını kullanarak bir sinyal yolunun bağlantılı proteinlerin inceleme sağlar, fazla sentezlenme ya da küçük moleküller. Akson ve dentrit büyümesi düzenleme ya da nöronal göç ilgilenilen proteinin ilişkisini kurmak için, in vivo elektroporasyon (İVE) tekniği gelişmekte serebellar korteks analizi sağlar. Kemirgenlerde serebellar gelişme ilk iki doğum sonrası haftalara şekilde uzanan gerçeği nedeniyle, beyincik bir accessib temsil ederakson ve dendrit, nöronal göç, sinaptogenez ve apoptoz 20-24,29,30,26,27,31-34 gelişmekte incelemek için genetik manipülasyonlar le beyin yapısı. Buna ek olarak, bu model sistemi, aynı zamanda, akson yol bulma, kablo ve Birlikte alındığında nöronlar ve nöron-glia etkileşimlerinin bağlantısı gibi sağlam serebellar korteks gerektiren nöronal gelişimin diğer yönleri için faydalıdır, bu protokol, in vitro ve in vivo teknikler mücadele sağladığı nöronal morfolojilerinden ve göç konusunda tamamlayıcı bir yaklaşım.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="541">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">DMEM</td>
			<td style="width:125px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">11960-044</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">BME</td>
			<td style="width:125px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">41010-026</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Insulin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">Si-1-4011</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Poly-L-Ornithine</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">P-2533</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:160px;">CaCl2</td>
			<td style="width:125px;">Appli-Chem</td>
			<td style="width:88px;">A3652</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:160px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:125px;">Actavis Deutschland</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Tissue-Tek OCT</td>
			<td style="width:125px;">Sakura</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:160px;">Material Name</td>
			<td style="width:125px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:168px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">ECM 830 and tweezertrodes</td>
			<td style="width:125px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:160px;">Epifluorescence microscope and camera</td>
			<td style="width:125px;">Nikon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">SP2 confocal microscope</td>
			<td style="width:125px;">Leica</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">ImageJ</td>
			<td style="width:125px;">NIH</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Imaris 7.4.2</td>
			<td style="width:125px;">Bitplane, Inc.</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:125px;">GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">MS Excel</td>
			<td style="width:125px;">Microsoft</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Loading tip 1-200 &#181;l</td>
			<td style="width:125px;">Costar</td>
			<td style="width:88px;">4853</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Pipette tip 200 &#181;l</td>
			<td style="width:125px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:88px;">70.760.502</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">Microlance 3 needle, 30 gauge</td>
			<td style="width:125px;">BD</td>
			<td style="width:88px;">302200</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">50 &#181;l gastight Syringe 1705</td>
			<td style="width:125px;">Hamilton</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">Glass coverslips&#160;</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific Menzel Glaeser</td>
			<td>CB00120RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration

Nöronal morfolojilerinden ve göç de dahil olmak üzere beyinde gelişimsel olaylar son derece In vitro. Süreçlerini yönetti ve in vivo bu olaylara karışan yolları belirlemek için derinlemesine bir nitelemeye imkan analiz edilmektedir. Gelişen beyincikte türetilen serebellar nöronlar granül (CGNs) morfolojik analiz için ideal bir model sağlayan bir sistemi vardır. Burada, bir genetik CGNs işlemek için bir yöntem ve ne kadar bireysel nöronların axono ve dendritogenesis çalışma açıklar. Bu yöntemle RNA girişim, aşırı ifadesi ya da küçük moleküllerin etkileri nöronlar kontrol ile karşılaştırılabilir. Buna ek olarak, kemirgen serebellar korteks baskın sonrası gelişim sayesinde vivo sistemde kolay erişilebilir. Ayrıca, genetik olarak gelişen cerebella işlemek ve daha sonra serebellar tanımlamak için bir in vivo elektroporasyon tekniği mevcut nöronal morfoloji değerlendirmek için analiznd göç.

Yukarıda tarif edildiği gibi, farklı kültür koşullarına göre CGNs morfolojisini analiz etmek için, DIV 0 üzerindeki nöronların transfekte edildi. Transfeksiyondan sonra, tam bir ortam (BME,% 10 dana serumu, 2 mM PSG, 25 mM KCl) ve minimum ortamı ihtiva eden, insülin başka bir grubu (BME, 25 mM glukoz, 2 mM PSG, 10 ug / içine nöronların bir takım yerleştirilmiştir ml insülin). Biz, Bölüm 1, 2 de GFP antikoru kullanılarak, bağışıklık kimyası için, nöronların tabi tutuldu ve 3, sadece bir ...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration at JoVE.com

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Nöronal morfogenezine ve göç doğru beyin gelişimi altında yatan çok önemli olaylardır. Burada, genetik olarak kültürlenmiş nöronlar ve serebellar granül morfolojisi ve nöronların göç özelliklerinin değerlendirilmesi için gelişmekte olan beyincik işlemek için yöntemleri tarif eder.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

genetic-manipulation-cerebellar-granule-neurons-vitro-vivo-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

13.6K Görüntüleme.  Max Planck Institute of Experimental Medicine.  Nöronal morfogenezine ve göç doğru beyin gelişimi altında yatan çok önemli olaylardır. Burada, genetik olarak kültürlenmiş nöronlar ve serebellar granül morfolojisi ve nöronların göç özelliklerinin değerlendirilmesi için gelişmekte olan beyincik işlemek için yöntemleri tarif eder. 

Video: Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Çoklu Ölçeklerde Sayısallaştırılmış Nöronal Morfoloji Otomatik Sholl Analizi

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Nörobilim

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Kemirgen neuroblasts nucleofection Neuroblast Göç Eğitim için<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Konfokal Makroskopi kullanarak Postnatal Serebellar Granül Hücre Göç Ex Vivo Görüntüleme

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Sütunlar ve Katmanlar dendritik Morfoloji Analizi

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

Serebellar Granül Nöron Kültüründe Floresan Diasetat-Propidyum İyodür Çift Boyama Kullanarak Nöronal Canlılığın Değerlendirilmesi

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...