Wir danken N. Schwedhelm-Domeyer für hervorragende technische Unterstützung, C. und S. Hammer Papiol für die Hilfe bei statistischen Analysen. Unsere Arbeit wird von der Max-Planck-Gesellschaft, der Deutschen Forschungsgemeinschaft, dem Center for Nanoscale Mikroskopie und Molekularphysiologie des Gehirns (CNMPB), Göttingen, Deutschland und der Junior-Gruppe GGNB Stipendium von der Universität Göttingen finanziert.

CGN kann entweder von postnatalen Tag (P) 5 Welpen Maus oder Ratte P6 Welpen vorbereitet werden. Wir folgen ein Protokoll, durch Bilimoria und Kollegen beschrieben, die eine Mitoseinhibitor nutzt, um für postmitotische, CGN 13 auswählen. Ethik-Erklärung: Alle Experimente mit lebenden Tieren wurden nach dem von der &quot;Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit&quot; des Landes Niedersachsen, Deutschland zugelassenen Tier Protokoll durchgeführt. In-vitro-Assay: 1. Herstellung von DNA Plasmid, Medien und Puffer für den Calciumphosphat-Transfektion Methode <ol><li> Lösen Plasmid-DNA in sterilem Endotoxin-freies Wasser; DMEM (high Glucose); machen 2,5 M CaCl 2; machen 2x HBSS (aufzulösen 4 g NaCl, 0,1775 g KCl, 0,095 g Na 2 HPO 4 • 7 H 2 O, 0,675 g Glucose und 2,5 g HEPES in 250 ml Reinstwasser und pH-Wert auf 7.05, 7.08 und 7.11). Hinweis: Bei der Vorbereitung2x die HBSS-Lösung, pH-Test, liefert die besten Ergebnisse in Bezug auf Effizienz der Transfektion bestimmten Kombination von Plasmiden. </li></ol> 2. Transfektion von kultivierten Neuronen <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Flussdiagramm der in vitro-Axon und Dendriten Wachstumstest. Cultured CGN (24-Well-Platte mit Deckgläschen), isoliert von P6 Rattenjungen, werden bei DIV 0 oder 1 mit DNA-Niederschlag, der einen fluoreszierenden Marker Transfektion (zB GFP) transfiziert. Nach der Fixierung und Immunzytochemie, werden Nervenzellen in einer verblindeten Weise abgebildet. Bilder werden in ImageJ importiert und Prozesse gemessen werden. Die Messungen werden dann mit einem Statistikprogramm verarbeitet. <ol><li> Seed, CGN (20 x 10 6 pro 24-Well-Platte, BME, 10% Kälberserum, 2 mM Penicillin-Streptomycin-Glutamin (PSG), 25 mM KCl) auf Salpetersäure gewaschen, Polyornithin-beschichtete 12 mm Deckgläschen in einer 24-Well-Platte mit 500 ul Medium pro Vertiefung. </li><li> Am Tag in vitro (DIV) 0 (mindestens 8 Stunden nach dem Ausstreichen) oder DIV 1, sammeln Wachstumsmedien und halten bei 37 ° C Zweimal waschen Neuronen mit 500 &amp;mgr; l vorgewärmtem DMEM und füge 500 &amp;mgr; l DMEM. </li><li> Ort Neuronen im Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 45 min. </li><li> Bereiten Sie 40 ul DNA-Niederschlag für jeden gut durch Mischen: DNA (2-2,5 g / gut, 10% der Gesamt-DNA-Transfektion sollte ein Marker zB GFP transfizierten Neuronen sichtbar sein), Wasser (bis zu 18 ul), fügen Sie 2 ul 2,5 M CaCl 2, gut mischen und mit 20 ul 2x HBSS. <ol><li> Inkubieren DNA Niederschlag 5 min bei RT. </li></ol></li><li> In DNA-Niederschlag in jede Vertiefung und Inkubation für 18 min Neuronen im Inkubator. </li><li> Entfernen DMEM / DNA-Mischung und waschen Neuronen zweimal mit 500 ul vorgewärmten DMEM. </li><li> In gesammelten Medien von Schritt 2.2 zurück zu Neuronen. Wenn Nervenzellen in Kultur für mehr als 3 Tage, zu ergänzen, Medien mit 25 mM Glucose bei DIV 3 Kohlenstoffquelle aufzufüllen. </li><li> Nach 1-5 Tagen, vorbehaltlich Neuronen Immunzytochemie mit GFP-Antikörpern. </li><li> Bild mindestens 30 einzelnen Neuronen pro Bedingung in einer verblindeten Weise unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops. </li></ol> 3. Messen Sie Axone und Dendriten mit NeuronJ, ein NIH ImageJ Plugin Wichtig: Stellen Sie sicher, dass die Bilder werden correctluy durch geeignete Pixel skaliert: um Verhältnis je nach Vergrößerung und Auflösung des Bildes. <ol><li> Konvertieren von Bildern in 8-Bit mit ImageJ: Bild öffnen, wählen Sie &#39;Bild&#39; -&gt; &#39;Typ&#39; -&gt; &#39;8-Bit &#39;-&gt;&#39; Bild speichern &quot;. </li><li> Führen NeuronJ Plugin und öffnen Sie die 8-Bit-Bild. <img alt="Screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot1.jpg" width="500px" /></li><li> Verwenden Sie die Option &#39;In Kurven &quot;, um das Axon zu verfolgen: click die linke Maustaste einmal am Anfang des Axons und bewegen Sie die Maus auf den Prozess. Klicken Sie doppelt auf Spitze des Axons, wenn Spur axonalen Form entspricht. <img alt="Screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot2.jpg" width="500px" /> Hinweis: Sollte die vorgeschlagene Spur von axonalen Form unterscheiden, klicken Sie einmal auf der axonalen Prozess Spur zu verankern, dann klicken Sie doppelt auf Spitze des Axons. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Measure-Kurs&quot;, wählen Sie die &#39;Display-Messungen Tracing &quot;-Option, und drücken Sie auf&quot; Ausführen &quot;. Axon Messungen sind alle in einem neuen Fenster angezeigt. Für Dendriten, wählen Sie die &quot;Anzeigegruppen Messungen Option&quot;, und drücken Sie auf &quot;Ausführen&quot;. <img alt="Screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot3.jpg" width="500px" /> Insgesamt Dendriten Messungen sind alle in einem neuen Fenster angezeigt. Speichern Sie sie als separate Datei, die in jedem Tabellenkalkulationsprogramm geöffnet werden kann. </li><li> Alternativ zur manuellen Tracing, verwenden Fidschi-Software: Klicken Sie rechts auf the Option &quot;Gerade&quot;, wählen Sie &quot;Freehand-line &#39;, <img alt="Screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot4.jpg" width="500px" /> halten Sie die linke Maustaste gedrückt und den Prozess manuell verfolgen, drücken Sie &quot;Strg + M&quot; zu messen. </li><li> Berechnen Sie die durchschnittliche axonalen / dendritischen Länge pro Bedingung und geeignete statistische Tests. In-vivo-Elektroporation: </li></ol> 1. Ausrüstung und Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Sie müssen 30 G Nadeln, Abstandhalter (1-2 mm), Spritze, Totvolumen Minderer (DVR), Elektroporator und tweezertrodes, Heizkissen oder Infrarot-Wärmelampe, Schwanenhals-Lampe und Isofluran. </li><li> Setzen DVR in die Nadel, dann bringen Nadel der Spritze, und endlich Distanzstück auf Nadel (Abbildung 2). <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig2.jpg" /> Abbildung2. Vorbereitung der Nadel. DVR wird von einer 200 ul Pipettenspitze abgeschnitten und in die Nadel, um das Totvolumen platziert. Abstandshalter aus einem 200 &amp;mgr; l Ladespitze abgeleitet und auf das Ende der Nadel angeordnet, um die Eindringtiefe in das Kleinhirn zu etwa 2 mm zu regeln. Ruler Einheiten: cm </li><li> Lösen DNA in PBS/0.03% Fast Green. Anmerkung: In der Transfektion Marker ist es vorteilhaft, um ein fluoreszierendes Protein, das unter einem Neuron-spezifischen Promotors (zB Synapsin) ist, um nur Neuronen zu visualisieren. 25% der Gesamtmenge sollte das Plasmid das Plasmid Transfektion Marker kodiert. </li><li> Machen Sie 70% Ethanol. </li><li> Mix gleiche Mengen von Oktober und 30% Saccharose in PBS gelöst. </li><li> Füllen Spritze mit 4 ul der DNA (4 ug / ul von Plasmid-DNA in PBS/0.03% Fast Green). </li></ol> 2. IVE von Rattenjungen Flussdiagramm des IVE: siehe Abbildung 3 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-Page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig3.jpg" /> 3. Flussdiagramm in vivo Elektroporation. P4 Rattenjungen mit Isofluran und Plasmid-DNA, die ein fluoreszierendes Transfektion Marker (zB GFP) codiert anästhesiert in Kleinhirn injiziert, gefolgt von Behandlung mit 5 elektrischen Impulsen. Fünf Tage später, isoliert GFP-positive Kleinhirne sind geschnitten und Immunhistochemie unterzogen. Bilder werden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen und mit Imaris Software analysiert. Daten werden mit einem Statistikprogramm verarbeitet. <ol><li> Verwenden P4 Rattenjungen von Albino-Stamm (Wistar oder Long Evans). </li><li> Anesthetize Welpen (eine nach der anderen) mit Isofluran in kleine Box (zB P1000 Pipettenspitze Box) mit 200 ul von Isofluran (im Gewebe eingeweicht) für 1-2 min bis Welpe ist nicht mehr bewegt. Achten Sie darauf, die Jungtiere nicht in Kontakt kommen with Flüssigkeit ein Isofluran. Überwachung der Zeit genau wie einzelne Welpen reagieren unterschiedlich auf die Anästhesie. </li><li> Sterilisieren Hinterkopf Welpe mit 70% Ethanol. </li><li> Fix Leiter der Welpe zwischen Daumen und Zeigefinger und Schwanenhalslampe Kleinhirn von Albino-Welpen zu finden. Die Quer Sinus scharf grenzt die Mittelhirn (Colliculus superior und inferior) aus den kortikalen Hemisphären (Abbildung 3). Das Kleinhirn ist neben Mittelhirn gelegen und erscheint in einem dunkleren Farbton. Verwenden Sie eine dauerhafte Markierung, um das Kleinhirn mit einem Punkt geben. Wichtig: Halten Sie Welpen in fester Position! Hinweis: Sollte Anästhesie tragen während dieser Prozedur aussetzen Welpen vor der Injektion der DNA Isofluran. </li><li> Die Nadel (3) und langsam zu injizieren 3 ul DNA in das Kleinhirn. </li><li> Lassen Sie die DNA-Lösung diffundieren für 30-60 sek. <ol><li> Zeigen Leiter der Welpe zwischen tweezertrodes, so dass der Minus-Pol in Kontakt mit dem Hinterkopf (KleinhirnR-Region) und der Pluspol an der gegenüberliegenden Seite des Kopfes (3). </li><li> Betreff Welpen bis 5 elektrischen Impulsen. Stellen Spannung Gewicht der Jungtiere, gute Elektroporation Effizienz ohne ihr Überleben (Tabelle 1) Kompromisse zu gewährleisten. <table border="0"><tbody><tr><td> Gewicht </td><td> Spannung </td><td> Puls </td><td> Intervall </td></tr><tr><td> 8-9 g </td><td> 160 V </td><td> 50 msec </td><td> 950 ms </td></tr><tr><td> 9-10 g </td><td> 165 V </td><td> 50 msec </td><td> 950 ms </td></tr><tr><td> &gt; 10 g </td><td> 170 V </td><td> 50 msec </td><td> 950 ms </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Elektroporation von P4 Rattenjungen. </li><li> Lassen Welpen wieder auf beheizten Unterlage oder unter einer Infrarotlampe. Zurück zu Welpen, min. Wichtig: Stellen Sie sicher, dass Wärmequelle keine Verbrennungen zuzufügen. </li></ol></li><li> Sacrifice Welpen 5 Tage nach der Elektroporation, indem sie in CO 2, gefolgt von der Enthauptung. <ol><li> Trennen Sie das Kleinhirn und Leinwand für GFP-positive Kleinhirne mit einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol></li><li> Fix Kleinhirne in 4% PFA O / N bei 4 ° C, dann in 30% Saccharose Inkubation bei 4 ° C bis cerebella Körper den Boden des Röhrchens. </li><li> Embed cerebella in OCT/30% Saccharose und schneiden 40 um koronalen Abschnitte mit einem Kryostaten. Hinweis: Abschnitt jedes Kleinhirn in einer Weise geblendet. </li><li> Betreff Abschnitte Immunhistochemie mit dem GFP-Antikörper. Gegenfärbung mit Kernfarbstoff (DAPI oder Hoechst 33258), und ermittelt die Lokalisierung von mindestens 200 transfizierten Neuronen pro Tier. </li><li> Für eine eingehende Analyse, unterteilen die IGL in zwei Hälften, was zu einer oberen IGL mit Blick auf den ML und einen unteren IGL vor der weißen Substanz und zählen GFP-positive Neurone wohnhaft in jeder Hälfte. Hinweis: Graf GFP-positiven Neuronen jedes Abschnitts in verblindet. </li&gt; </ol> 3. Mess Dendrite Länge, Erwerben Sie die Bilder von der Sektion in x, y, z-Ebene mit einem konfokalen Mikroskop Hinweis: Verwenden Sie beispielsweise 40 Bilder für eine 40 um Schnitt mit einem z-stwp von 1 um. <ol><li> Offene Bild-Serie in der Software, Imaris, um ein 3D-Bild der Dendriten zu generieren. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Surpass&quot;-Modus, um das Neuron in 3D-Ansicht. <img alt="Screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot5.jpg" width="500px" /></li><li> Wählen Sie &quot;Neuen Faden&quot; und klicken Sie auf &quot;Weiter automatische Erstellung&quot;, um halbautomatische Ablaufverfolgung starten. <img alt="Screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot6.jpg" width="500px" /> Hinweis: Analysieren Sie jede 3D-Bild in einer Weise geblendet </li><li> Wählen Sie die Registerkarte &quot;Zeichnen&quot; und &quot;AutoPath. <img alt="Screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot7.jpg" width="500px" /></li><li> Bewegen Sie den Mauszeiger auf der cell Körper und Shift + Maus rechts klicken, um den Zellkörper zu wählen. Hinweis: autocalculation durch Software kann einige Minuten dauern. <img alt="Screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot8.jpg" width="500px" /></li><li> In den Pfaden des Filaments (Dendriten) mit Shift + Maus links klicken. Hinweis: Pfade können in Echtzeit visualisiert werden. <img alt="Screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot9.jpg" width="500px" /></li><li> Zum Filament Statistik-Fenster und klicken Sie auf &quot;Detaillierte &#39;,&#39; Spezifische Werte&quot; und &quot;Filament Dendritenlänge (Summe) &#39;für Summe der Gesamt Dendritenlänge. <img alt="Screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot10.jpg" width="500px" /></li><li> Verwenden Sie geeignete statistische Tests, um Daten zu analysieren. </li></ol>

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+centrosomal+Cdc20-APC+pathway+controls+dendrite+morphogenesis+in+postmitotic+neurons.">A centrosomal Cdc20-APC pathway controls dendrite morphogenesis in postmitotic neurons.</a> Cell. 136, 322-336 (2009).</li><li>Shalizi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium-regulated+MEF2+sumoylation+switch+controls+postsynaptic+differentiation.">A calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls postsynaptic differentiation.</a> Science. 311, 1012-1017 (2006).</li><li>Vadhvani, M., Schwedhelm-Domeyer, N., Mukherjee, C., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Centrosomal+E3+Ubiquitin+Ligase+FBXO31-SCF+Regulates+Neuronal+Morphogenesis+and+Migration.">The Centrosomal E3 Ubiquitin Ligase FBXO31-SCF Regulates Neuronal Morphogenesis and Migration.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKIIbeta+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nat. Neurosci. , (2011).</li><li>Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC+channels+promote+cerebellar+granule+neuron+survival.">TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival.</a> Nat. Neurosci. 10, 559-567 (2007).</li><li>Huynh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isoform-specific+SnoN1-FOXO1+repressor+complex+controls+neuronal+morphogenesis+and+positioning+in+the+mammalian+brain.">An isoform-specific SnoN1-FOXO1 repressor complex controls neuronal morphogenesis and positioning in the mammalian brain.</a> Neuron. 69, 930-944 (2011).</li><li>de la Torre-Ubieta, L., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+neuronal+polarity+and+morphogenesis+in+the+mammalian+brain.">Transcriptional regulation of neuronal polarity and morphogenesis in the mammalian brain.</a> Neuron. 72, 22-40 (2011).</li><li>Calissano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+insulin-like+growth+factor+I+exerts+a+trophic+action+and+confers+glutamate+sensitivity+on+glutamate-resistant+cerebellar+granule+cells.">Recombinant human insulin-like growth factor I exerts a trophic action and confers glutamate sensitivity on glutamate-resistant cerebellar granule cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8752-8756 (1993).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Vorteile und Grenzen der in vitro-und in vivo-Methoden beschrieben: Kultivierte, CGN von Maus und Ratte sind gleich gut für die morphologische Analysen geeignet. Aufgrund der größeren Größe eines Rattenkleinhirn, die Ausbeute von CNG aus Rattenjungen übersteigt die Maus Welpen 3-4x. Abgesehen von CGN kann kortikalen und hippocampalen Neuronen als Kultursystem verwendet, sowie werden. Das Calciumphosphat-Verfahren führt zu einer niedrigen (0,01-5%) Transfektionseffizienz, die ...

Das Kleinhirn ist ein ausgezeichnetes System, die Mechanismen der Axon Wachstum und Migration zu untersuchen. Das Kleinhirn hat sich seit den Anfängen der Neurowissenschaften ein Gegenstand von anatomischen Studien. Moderne Mikroskopie und immunhistochemischen Techniken erheblich erweitert und verfeinert die ersten Entdeckungen von Santiago, Ramon und Cajal 2-4. Maus-Genetik und molekulare Untersuchungen aufgedeckt wesentliche Wachstums-und Transkriptionsfaktoren bei der Kontrolle der Entwicklung des Kleinhirns, die zu einem besseren Verständnis der entscheidenden Ereignisse der richtigen Verkabelung von verschiedenen Arten von Neuronen, einschließlich Kleinhirnkörnerzellen (CGN) 7.5 erforderlich geführt. Das Kleinhirn ist ein Derivat von Rhombomer 1 der Entwicklungs hindbrain 8. Die rhombische Lippe, die einen Teil des Daches des 4. Ventrikels, entsteht Kleinhirn-Körner Neuron Vorläufern, die die zahl neuronalen Population in der darstellen wirderwachsenen Kleinhirn 9. Nach rostral Migration, begnügen sie sich in der Kleinhirn-anlage. Hier Mitose Granulat Neuron Vorstufen führt zu der dramatischen Expansion der äußeren Körnerschicht (EGL), die postnatal Ort bei Nagetieren dauert. Von der EGL, starten Neuronen nach innen durch die Migration der Molekularschicht (ML), vorbei an der Purkinje-Zellschicht, um letztendlich ihren Wohnsitz in der internen Körnerschicht (IGL 2). Während dieser Migrationsprozess, eine bipolare Form erwerben sie mit zwei Axone in die ML erstreckt. Beim weiteren Migration der Zellkörper wandert von den Axonen und die beiden Prozesse zu verschmelzen, um eine gabelförmige, T-förmige Axon 10 zu bilden. Anschließend wird diese Axone fasciculate und werden als parallele Fasern bezeichnet. Nachdem in der IGL siedelt, CGN wachsen Dendriten, die dendritischen Klauen bilden Synapsen mit Moosfasern herzustellen. Um grundlegende Prozesse in der Entwicklung von Kleinhirn zu untersuchen, ein in vitro und in vivo approac kombinierth ermöglicht zuverlässige Ergebnisse und Schlussfolgerungen. CGN sind nicht nur die zahlreichen Nervenzellen des Kleinhirns, sondern des gesamten Gehirns und kultiviert, um die hohe Reinheit von 11 bis 13 sein. In der Kultur, wird diese sehr homogene neuronalen Population schnell postmitotische und erwirbt eine polare Morphologie mit leicht identifizierbaren Axonen und Dendriten. Kultivierte, CGN haben sich als äußerst nützlich, um verschiedene Aspekte der neuronalen Entwicklung einschließlich Vorläufer Proliferation, Differenzierung und axonalen Dendriten Entwicklung, neuronale Migration, Apoptose und elektrophysiologischen Eigenschaften (14-19 und viele andere) zu studieren sein. Die Nutzung genetischer Manipulation hat die Vielseitigkeit des kultivierten, CGN erweitert und für weitere mechanistische Einblicke in die genannten Veranstaltungen erlaubt. Transfektion von kultivierten Neuronen mit niedrigem Wirkungsgrad Calciumphosphat oder lipophile Methoden gefolgt von Immunzytochemie mit Polaritätsmarkierungen oder softwaregestützte Analyse FaciliTAATEN die Beurteilung zB der Morphologie der einzelnen Neuronen in einem neuronalen dichten Kultur. Mit diesem Ansatz kann die Rolle der Proteine ​​von Interesse in Axon oder Dendritenwachstum 20-25,26-28 sucht werden. Das Kultursystem ist jedoch weniger nützlich, um neuronale Migration zu analysieren, wie die Migration in sehr hoher Dichte Kulturen begrenzt und würden Cokulturen erfordern. Die in vitro-Analyse von Axons und Dendriten-Wachstum ermöglicht auch die Prüfung von miteinander verbundenen Proteine ​​eines Signalweges unter Verwendung von Kombinationen der RNA-Interferenz (I), Überexpression oder kleine Moleküle. Um die Bedeutung des Proteins von Interesse in Axon und Dendriten Wachstumsregulierung oder neuronale Migration zu schaffen, ermöglicht die Analyse der Entwicklung von Kleinhirnrinde der in-vivo-Elektroporation (IVE)-Technik. Aufgrund der Tatsache, dass Kleinhirnentwicklung bei Nagetieren verlängert Weg in den ersten zwei Lebenswochen, das Kleinhirn stellt eine accessible Hirnstruktur für genetische Manipulationen zu untersuchen, entwickeln Axone und Dendriten, neuronale Migration, Synaptogenese und Apoptose 20-24,29,30,26,27,31-34. Darüber hinaus ist auch in diesem Modellsystem auch für andere Aspekte der neuronalen Entwicklung, die die intakte Kleinhirnrinde wie Axon Pathfinding, Verkabelung und Vernetzung der Neuronen und Glia-Neuron-Interaktionen Zusammengenommen benötigen, bietet dieses Protokoll in vitro und in-vivo-Techniken zur Bewältigung ein komplementärer Ansatz für die neuronalen Morphogenese und Migration.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="541">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">DMEM</td>
			<td style="width:125px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">11960-044</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">BME</td>
			<td style="width:125px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">41010-026</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Insulin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">Si-1-4011</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Poly-L-Ornithine</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">P-2533</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:160px;">CaCl2</td>
			<td style="width:125px;">Appli-Chem</td>
			<td style="width:88px;">A3652</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:160px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:125px;">Actavis Deutschland</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Tissue-Tek OCT</td>
			<td style="width:125px;">Sakura</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:160px;">Material Name</td>
			<td style="width:125px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:168px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">ECM 830 and tweezertrodes</td>
			<td style="width:125px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:160px;">Epifluorescence microscope and camera</td>
			<td style="width:125px;">Nikon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">SP2 confocal microscope</td>
			<td style="width:125px;">Leica</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">ImageJ</td>
			<td style="width:125px;">NIH</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Imaris 7.4.2</td>
			<td style="width:125px;">Bitplane, Inc.</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:125px;">GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">MS Excel</td>
			<td style="width:125px;">Microsoft</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Loading tip 1-200 &#181;l</td>
			<td style="width:125px;">Costar</td>
			<td style="width:88px;">4853</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Pipette tip 200 &#181;l</td>
			<td style="width:125px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:88px;">70.760.502</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">Microlance 3 needle, 30 gauge</td>
			<td style="width:125px;">BD</td>
			<td style="width:88px;">302200</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">50 &#181;l gastight Syringe 1705</td>
			<td style="width:125px;">Hamilton</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">Glass coverslips&#160;</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific Menzel Glaeser</td>
			<td>CB00120RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration

Entwicklungs Ereignisse im Gehirn einschließlich der neuronalen Morphogenese und Migration sind hoch orchestriert Prozesse. In-vitro-und in vivo-Analysen erlauben eine detaillierte Charakterisierung von Wegen an diesen Veranstaltungen beteiligt sind. Kleinhirnkörnerzellen (CGN), die von sich entwickelnden Kleinhirn abgeleitet werden, sind ein ideales Modell-System, das für die morphologische Analysen ermöglicht. Hier beschreiben wir eine Methode, wie man genetisch zu manipulieren, CGN und wie axono-und dendritogenesis von einzelnen Nervenzellen zu studieren. Mit diesem Verfahren werden die Auswirkungen der RNA-Interferenz, Überexpression oder kleinen Molekülen verglichen werden, um Nervenzellen zu steuern. Darüber hinaus ist das Nagetier Kleinhirnrinde ein leicht in vivo-System zugänglich aufgrund ihrer vorherrschenden postnatale Entwicklung. Wir präsentieren auch eine in vivo Elektroporation Technik genetisch zu manipulieren und die Entwicklung von Kleinhirn Kleinhirn beschreiben nachfolgenden Analysen eine neuronale Morphologie beurteilennd Migration.

Um die Morphologie der CGN in Reaktion auf unterschiedliche Kultivierungsbedingungen zu analysieren, transfizierten wir die Neuronen auf DIV 0 wie oben beschrieben. Nach der Transfektion war, legten wir einen Satz von Neuronen in Vollmedium (BME, 10% Kälberserum, 2 mM PSG, 25 mM KCl) und ein anderer Satz in Minimalmedium mit Insulin (BME, 25 mM Glucose, 2 mM PSG, 10 ug / ml Insulin). Wir Immuncytochemie unter die Neuronen mit dem GFP-Antikörper bei DIV 1, 2 und 3, gefolgt von der Messung Axonen und Dendriten und Axone...

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Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronale Morphogenese und Migration sind entscheidende Ereignisse zugrunde liegenden richtige Entwicklung des Gehirns. Hier beschreiben wir Verfahren zur genetischen Manipulation kultivierten zerebellären Körnerzellen und die Entwicklung von Kleinhirn für die Beurteilung der Morphologie und der Migrationseigenschaften von Neuronen.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

genetic-manipulation-cerebellar-granule-neurons-vitro-vivo-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

13.6K Aufrufe.  Max Planck Institute of Experimental Medicine.  Neuronale Morphogenese und Migration sind entscheidende Ereignisse zugrunde liegenden richtige Entwicklung des Gehirns. Hier beschreiben wir Verfahren zur genetischen Manipulation kultivierten zerebellären Körnerzellen und die Entwicklung von Kleinhirn für die Beurteilung der Morphologie und der Migrationseigenschaften von Neuronen. 

Serie: Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Automatisierte Sholl Analyse digitalisierter neuronale Morphologie bei Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Forschung

Neurowissenschaften

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus-vermittelte Gen-Manipulation und Visualisierung von Riechzellen In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Nucleofection von Nagerneuroblasten zu Neuroblast Migrationsstudie<em&gt; In-vitro-</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex-vivo-Bildgebung von Postnatale Kleinhirn-Körnerzellmigration mittels konfokaler Makros

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Analyse dendritischer Morphologie in Spalten und Schichten

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit unter Verwendung von Fluorescein-Diacetat-Propidium-Iodid-Doppelfärbung in Cerebellar-Granulat-Neuron-Kultur

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...