ברצוננו להודות לפטריק ג וילסון לCR9114 נוגדן חד שבטי. אנו מודים גם ג&#39;ניפר Debeauchamp וריצ&#39;רד Webby לפלסמידים A/Anhui/1/13 המקוריים. תמיכה חלקית עבור עבודה זו סופקה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות במימון תכנית פרויקט גרנט AI097092-01A1 וCEIRS (מרכזים המצוינים למחקר שפעת ומעקבים, HHSN26620070010C). FK נתמכה על ידי מלגת ארווין שרדינגר (J 3232) מקרן המדע האוסטרית (FWF).

1. לדור של רקומביננטי baculovirus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיבוט להעברה-פלסמידים baculovirus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיבוט H7 HA ו NA ectodomain N9 (או כל גן HA או NA אחר) לתוך פלסמידים העברת pFastBac שונה (ראה מבוא). וקטורים לHA המכיל תחום trimerization C-מסוף ותג hexahistidine, כמו גם עבור NA המכיל תחום tetramerization N-מסוף ותג hexahistidine, תוארו 1,10,11,22 (איור 1) וניתן לבקש מ המחברים. הערה הסבר: ectodomains HA הביע ללא תחום trimerization יהיה מקופל בצורה לא נכונה, שמוביל לאובדן של אפיטופים נטרול קונפורמציה, במיוחד בתחום הגבעול. כמו כן, הפונקציה האנזימטית NA מסתמכת על tetramerization הראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדור של bacmids להפוך העברה-פלסמידים baculovirus המכילים גנים HA ו NA לחיידקי DH10Bac לפי שימוש ביטוי baculovirusמערכת לפי הוראות יצרן. בודד ולטהר bacmids באמצעות ערכת Midiprep על פי הוראות יצרן (איור 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלה של baculovirus ואימות רקומביננטי של ביטוי חלבון הערה הסבר: בשלבים הבאים צריכים להתבצע על סביבה נקיה מחיידקים בזרימה למינרית. לבצע הליך זה באופן עצמאי עבור HA ו NA (או כל גן אחר של ריבית). תאי חרקים גדלים בדרך כלל ב28 ° C ללא CO 2. תאי Sf9 עבור פרוטוקול זה גדלים בתקשורת תא חרק המלאה TNM-FH בתוספת 10% FBS, 1% העט סטרפטוקוקוס * ו0.1% פתרון F68 Pluronic, אם לא צוינו אחרת, וpassaged 01:04 פעמיים בשבוע. חמישה תאים גבוהים גדלים בתקשורת בסרום חופשי SFX וpassaged 1:15 פעמיים בשבוע. * תוספת של אנטיביוטיקה צריכה להיחשב אופציונלית לאורך כל הפרוטוקול והותאמה על פי הנהלים בשימוש בכל מעבדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי חרקים Sf9 6 צלחות גם בצפיפות של 2 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר ולתת לשבת במשך 20 דקות בחממה 28 מעלות צלזיוס (ללא CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 2 מיקרוגרם (conc. 0.5-2 מיקרוגרם / ul) של bacmid רקומביננטי עם של מדיום TNM-FH (סרום חופשי, 1% העט סטרפטוקוקוס) 100 μl. מערבבים 6 μl של סוכן transfection עם של מדיום TNM-FH (סרום חופשי, עט סטרפטוקוקוס) 100 μl. לשלב את שני כרכים, מערבב בעדינות ולתת לשבת במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר (תערובת transfection). כולל חיקוי transfection אחד כשליטה (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant מתאי Sf9 מצופה (תאים כעת להיצמד לצלחת) ולהחליף עם 2 מיליליטר של מדיום סרום ללא TNM-FH מכיל עט סטרפטוקוקוס (1%). הוסף את הכרך השלם של תערובת transfection (מצעד 1.2.2) ולטלטל את צלחת 6 היטב בקפידה במשך 5 שניות. דגירה בחממה 28 ° C ללא CO 2 למשך 6 שעות (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף wi תקשורתתקשורת ה טרי מלאה TNM-FH (מכיל 10% FBS, 1% העט סטרפטוקוקוס ו0.1% F68 Pluronic). דגירה בחממה 28 ° C ללא CO 2 למשך 6 ימים. בדקו מדי פעם תאים תחת מיקרוסקופ. תאים נגועים מופיעים בדרך כלל גדולים יותר, עגול יותר, מוגדלים גרעינים, ולהתחיל לנתק (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר של תאים ואישור של ביטוי חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאי הודעה 6 ימים transfection ידי צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. Supernatant מכיל baculovirus רקומביננטי - זה ישמש להפקת מייד מניות עובדות, או יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את ביטוי חלבון לאסוף כדורים וגלולים ב500 μl של PBS. מערבבים 50 μl של ההשעיה עם 50 μl של חיץ טעינה-SDS (המכיל סוכן צמצום). הפעל SDS-PAGE ולבצע ניתוח כתם מערבי עם נוגדן אנטי hexahistidine כדי לאשר ביטוי גנים. כוללים תאים ממדומיםtransfection כפקדים שליליים (איור 3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של מניות עובדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 5 x 10 5 Sf9 תאים / 2 סנטימטר בבקבוק סנטימטר T175 2 ולתת לשבת במשך 20 דקות לאפשר להם לצרף למנה. החלף תקשורת TNM-FH להשלים עם תקשורת TNM-FH המכילה 3% FBS (1% העט סטרפטוקוקוס, 0.1% F68 Pluronic). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק תאים עם של supernatant ההצלה 100 μl. דגירה בחממה 28 ° C ללא CO 2 למשך 6 ימים ולבדוק מדי פעם אם תאים מקבלים נגועים (כמתואר בשלב 1.2.5.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב2,000 XG בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ולאסוף supernatant. זהו עכשיו מניית P2 שלך. מלאי זה יכול להיות מאוחסן ללא הגבלת זמן ב 4 ° C. חזור על תהליך ההדבקה באמצעות של מניית P2 100 μl להדביק תאים. המניה שנוצרה נקראת P3 או מניות עובדות, אשר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס או להשתמש בם ישירות לביטוי חלבון. מניית P3 מכילה בדרך כלל 10 &lt;sup&gt; 7 -10 9 פלאק ויצר יחידות / מיליליטר. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. ביטוי חלבון וטיהור הערה הסבר: תאי Sf9 לתמוך בצמיחה של baculovirus טוב מאוד. עם זאת, היכולת שלהם להפריש כמויות גדולות של חלבון רקומביננטי היא מוגבלת. לכן אנו משתמשים בקו אחר חרקים תא, חמישה תאים גבוהים, לביטוי של חלבונים רקומביננטיים מופרשים. תאים אלה אינם תומכים בשכפול baculovirus לכותרות גבוהות מאוד 13 אבל יש להם יכולת הפרשה גבוהה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדל חמישה תאים גבוהים לגדול חמישה תאים גבוהים במדיום תרבית תאי חרקים SFX בס&quot;מ T175 2 צלוחיות. מעבר בכל יום אחר 1:3. לתרבות 200 ביטוי מיליליטר תצטרך לגדול 5 צלוחיות ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצירת והדבקה של חמישה תאים גבוהים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק חמישה תאים גבוהים מ -5 ס&quot;מ T175 2 צלוחיות על ידי הקשה על צלוחיות עם היד שלך. לאסוף suspe התאnsion ולהעביר לתוך צינורות 50 צנטריפוגה מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב1,200 XG במשך 7 דקות בטמפרטורת חדר. הסר supernatant באמצעות אחסון ולאחד את כדורים על ידי resuspending ב15 מיליליטר של מניית P3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו לשבת במשך 15 דקות במכסת מנוע הזרימה (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 200 מיליליטר של מדיום תרבות Hyclone SFX לתוך בקבוק נקי, סטרילי 1,000 מיליליטר ייקר (ללא buffles, אטום עם רדיד אלומיניום לפני מעוקר, לא צריך היה בשימוש במשך תרבויות חיידקים לפני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את ההשעיה P3/cell לתוך הבקבוק שייקר. לאטום עם רדיד אלומיניום סטרילי ובקבוק העברה לתוך שייקר. לנער ב70 סל&quot;ד ב28 מעלות צלזיוס במשך 72-96 שעה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצירת חלבון רקומביננטי מsupernatants ביטוי תא גבוה חמש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 72-96 supernatants שעות שלאחר זיהום העברת התרבות ל500 דליי מיליליטר צנטריפוגה. ספין ב5,500 XG עבור 20 דקות ב 4 ° C. בינתיים לשטוף את צלוחיות שייקר 3x עם מים מזוקקים פעמיים(DDH 2 O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 3 מיליליטר תרחיף Ni-שרף לתוך צינור 50 מיליליטר עם 45 מיליליטר של PBS (אחד זקוק לתרבות מיליליטר 200). לנער היטב ולהסתובב ב3,000 XG בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. למזוג את PBS ולשמור את הכדור. מערבבים את supernatant תא החרק עם גלולה Ni-השרף ולהעביר לתוך צלוחיות שייקר כבר נשטפו. לדגור על C ° 4 ל2-4 שעות, ואילו רועד (איור 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר 10 עמודת פוליפרופילן מיליליטר במהדק בעמדת תמיכה. הסר את שני כובעים, ולמקם את כוס מתחת לעמודה לאסוף זרימה דרך (פסולת). קח הבקבוק שייקר מתוך ייקרתי ולהתחיל להעביר את תערובת supernatant / תרחיף על הטור, זה יהיה לשמור על Ni-השרף ורק את supernatant יזרום דרך. להעביר את כל הנפח מעל העמודה (איור 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את 4x השרף עם 15 מיליליטר של חיץ כביסה (50 מ&quot;מ Na 2 HCO 3, 300 mM NaCl, imidazole 20 מ&quot;מ, pH 8). בואו כל ניקוז הכביסה החיץמהעמודה ולסגור אותו עם הכובע (צד תחתון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של חיץ elution (50 מ&quot;מ Na 2 HCO 3, 300 mM NaCl, 300 imidazole מ&quot;מ, pH 8) ולתת לשבת במשך 5 דקות. פתח עמודה ולאסוף את eluate. חזור על פעולה 3 פעמים נוספות (עם סך של 8 מיליליטר של חיץ elution). Eluate המכיל ריכוזים גבוהים של חלבון בדרך כלל תערוכות קצף כאשר מזועזע (איור 7). שמור eluate על קרח רטוב בכל הזדמנות אפשרית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חילופי חיץ וריכוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יחידות Prespin 15 מיליליטר אולטרה צנטריפוגה (30 kDa חתוכים לHA / NA, אך עשויות להשתנות בהתאם לגודל החלבון מטוהר) עם PBS (pH 7.4-7.6) ב3,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. זורק לזרום וeluate עומס על טור הספין. מלא עם 5 מיליליטר של קור סטרילי, קרח PBS וספין ל60 דקות ב 3,000 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימת פריקה דרך שוב, למלא עם 15 מיליליטר של PBS הקר כקרח וספין ל60 דקות ב 3,000 XG ב 4 ° C. חזור על פעולה זו proceדורה עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את טור הספין מתוך צנטריפוגה ולאסוף להתרכז החיץ החליף (בדרך כלל 200 μl). זה מרוכז מאוד חלבון רקומביננטי. יש לשטוף את טור הספין עם 400 μl של קרח הקר סטרילי PBS ולהוסיף את זה לתרכיז. שמור את התרכיז על קרח בכל העת. </li></ol></li></ol> 3. אפיון ובקרת איכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת ריכוז חלבון קח aliquot של התרכיז ולמדוד אותו על ידי שימוש בשיטת כימות החלבון שלך של בחירה. הגדר ריכוז חלבון עד 1 מ&quot;ג / מיליליטר על ידי הוספת PBS ולהקפיא aliquots קטנים ל-80 ° C. מחזורי הפשרת הקפאה יפגעו במבנה החלבון ויכולים להוביל לצבירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SDS-PAGE והכתמת Coomassie הפעל 500 ng של החלבון שלך על SDS-PAGE ולבצע מכתים Coomassie. עבור מכתים מהיר ונוח להשתמש מגיב Coomassie בשילוב עם פרוטוקול מיקרוגל. חלבוני HA מופיעים בדרך כלל ב64kDa אילו חלבוני NA צריכים לרוץ בגודל של כ 56 kDa (8A דמויות ו-B). באמצעות הפרוטוקול תאר אתה לא צריך לראות את כל מוצרים פגומים. אם השפלה מתרחשת זה בדרך כלל סימן לזיהום שמרים / פטריות בביטוי. במקרה זה לחזור על התהליך ולוודא כדי לשמור על הכל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם מערבי / ELISA על מנת לאמת את זהות חלבון אנו ממליצים לעשות כדי כתם מערבי או assay ELISA עם נוגדנים ספציפיים. באופן אידיאלי, מבחני ELISA מבוצעים עם נוגדן אשר נקשר לאפיטופים קונפורמציה (נוגדני גבעול אנטי HA למשל 1). באמצעות נוגדן כזה הקיפול הנכון של החלבון יכול להיות אישר (איור 8C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת NA פעילות קיפול נכון של NA הנגיפי גם יכול להיקבע על ידי מדידת פעילות NA. אנו ממליצים לבצע בדיקה זו באמצעות assay NA * STAR זמין המסחרית (פשוט בצעו את הנחיות המשתמש). </li></ol>

<ol>
	<li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carboxy-terminal+trimerization+domain+stabilizes+conformational+epitopes+on+the+stalk+domain+of+soluble+recombinant+hemagglutinin+substrates.">A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates.</a> PLoS One. 7, e43603 (2012).</li><li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly-protective+stalk-specific+antibodies.">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., C&#225;rdenas, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+infection+in+Guinea+pigs+raised+as+livestock,+ecuador.">Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador.</a> Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).</li><li>Margine, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3N2+influenza+virus+infection+induces+broadly+reactive+hemagglutinin+stalk+antibodies+in+humans+and+mice.">H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1976+and+2009+H1N1+Influenza+Virus+Vaccines+Boost+Anti-Hemagglutinin+Stalk+Antibodies+in+Humans.">1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans.</a> J. Infect. Dis. 652, (1976).</li><li>Pica, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+stalk+antibodies+elicited+by+the+2009+pandemic+influenza+virus+as+a+mechanism+for+the+extinction+of+seasonal+H1N1+viruses.">Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).</li><li>Sangster, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+B+cell+response+and+hemagglutinin+stalk-reactive+antibody+production+in+different+age+cohorts+following+2009+H1N1+influenza+vaccination.">The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination.</a> Clin. Vaccine Immunol. , (2013).</li><li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pan-h1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo.">A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).</li><li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope.">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324, 246-251 (2009).</li><li>Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+the+1918+influenza+virus+H1N1+neuraminidase.">Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase.</a> J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).</li><li>Stevens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+uncleaved+human+H1+hemagglutinin+from+the+extinct+1918+influenza+virus.">Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus.</a> Science. 303, 1866-1870 (2004).</li><li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+efficacy+of+neutralizing+antibodies+elicited+by+recombinant+hemagglutinin+proteins+from+avian+H5N1+influenza+virus.">Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus.</a> J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).</li><li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichoplusia+ni+cells+(High+Five)+are+highly+efficient+for+the+production+of+influenza+A+virus-like+particles:+a+comparison+of+two+insect+cell+lines+as+production+platforms+for+influenza+vaccines.">Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines.</a> Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).</li><li>Palmberger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+for+antibody+production:+evaluation+of+an+efficient+alternative.">Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative.</a> J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).</li><li>Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+and+immunogenic+properties+of+recombinant+hemagglutinin+proteins+from+H1N1+A/Brisbane/59/07+and+B/Florida/04/06+when+produced+in+various+protein+expression+systems.">Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems.</a> Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).</li><li>Wrammert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadly+cross-reactive+antibodies+dominate+the+human+B+cell+response+against+2009+pandemic+H1N1+influenza+virus+infection.">Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection.</a> J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).</li><li>Treanor, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+a+trivalent+recombinant+hemagglutinin+protein+vaccine+(FluBlok)+against+influenza+in+healthy+adults:+a+randomized,+placebo-controlled+trial.">Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial.</a> Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).</li><li>Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+recombinant+protein-based+influenza+vaccine.+Expression+and+affinity+purification+of+H1N1+influenza+virus+neuraminidase.">Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase.</a> J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).</li><li>Krammer, F., Grabherr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+influenza+vaccines+made+by+insect+cells.">Alternative influenza vaccines made by insect cells.</a> Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Infection+with+a+Novel+Avian-Origin+Influenza+A+(H7N9)+Virus.">Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus.</a> N. Engl. J. Med. , (2013).</li><li>Goff, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cross-reactive+antibodies+to+novel+H7N9+influenza+virus+by+recombinant+Newcastle+disease+virus+expressing+a+North+American+lineage+H7+subtype+hemagglutinin.">Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin.">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+conserved+protective+epitopes+on+influenza+B+viruses.">Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses.</a> Science. 337, 1343-1348 (2012).</li><li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+influenza+viruses+containing+NS1+truncations+as+vaccine+candidates+against+H5N1+highly+pathogenic+avian+influenza.">Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza.</a> J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).</li><li>Fouchier, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+A+virus+(H7N7)+associated+with+human+conjunctivitis+and+a+fatal+case+of+acute+respiratory+distress+syndrome.">Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).</li><li>Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

למרות שהביטוי של חלבוני HA ו NA נגיף שפעת בתאי חרקים באמצעות מערכת ביטוי baculovirus הוא ישר קדימה, בדרך כלל, יש כמה נקודות חשובים שיש לשקול. זה חשוב, כפי שציין בהקדמה, שectodomains של HA ו NA באים לידי ביטוי בשילוב עם תחומים trimerization או tetramerization, בהתאמה. תחומים אלה מבטיחים קיפול נכון של ...

כתגובה ראשונה להופעתה האחרונה של זן רומן H7N9 שפעת וירוס בסין, רכשנו פלסמידים הנושאים את רצפי הגנום לhemagglutinin (HA) וneuraminidase (NA) הגנים של שני הבידודים הראשונים. שימוש בפלסמידים אלה היינו יכול לבנות במהירות וקטורי ביטוי baculoviral לייצור של HA רקומביננטי ו NA בתאי חרקים. מערכת ביטוי זה מבוסס היטב במעבדה שלנו והוכיחה מרכזי לרבים מהפרויקטים של המחקר המתמשך שלנו 1-8. תאי חרקים יכולים לקפל בצורה נכונה ושלאחר translationally לשנות חלבונים מורכבים. שינויים אלה כוללים glycosylation N צמוד, וזה חשוב עבור רבים גליקופרוטאינים נגיפיים. ככזה, אין זה מפתיע כי מערכת baculovirus היא די הוקמו להבעת פני השטח אנטיגנים נגיף שפעת. למעשה, רבים של מבני גבישי HA ו NA היה לפתור באמצעות חלבוני תא הביע חרקים 9-11. יתרון נוסף שלמערכת נמצאת בתשואות גבוהה החלבון אמין שלה של עד 30 מ&quot;ג של תרבית תאי HA / L (המבוססת על הניסיון שלנו עם יותר מ -50 חלבונים שונים HA) - תוצאה של ביטוי זיהום בנגיף מונע מאמרגן polyhedrin החזק. הסרת הטרנסממברני וendodomain של חלבוני HA ו NA מאפשרת ביטוי של גרסאות secretable, מסיסה של החלבונים ובכך מאוד מקל על תהליך הטיהור. בנוסף, ectodomains אלה hexahistidine מתויג ולכן יכול להיות מטוהר באמצעות כרומטוגרפיה זיקה באמצעות Ni 2 + שרף. תחומים הטרנסממברני של חלבוני HA ו NA לתרום לhomotrimer והיווצרות homotetramer, בהתאמה. על מנת לשמר oligomerizations אלה, אנו להוסיף תחום trimerization טרמינל C-לHA-, ותחום tetramerization N-המסוף לNA הבונה (איור 1). יש לנו הראינו בוודאות כי תחום כגון trimerization מייצב פונקציונליות, ותוצאותrved אפיטופים קונפורמציה על גבעול תחום של 1 HA. Tetramerization הנכון של NA עשוי גם לתרום לתיקון מתקפל וNA פונקציה 10. ניתן לבקש רצפים ווקטורי baculo העברת מחסה תחומים trimerization או tetramerization מהמחברים או ממעבדות אחרות בתחום, 9,10,12. נושא חשוב נוסף לביטוי של חלבונים מופרשים בתאי חרקים הוא הבחירה של שורת התאים תקין. בעוד frugiperda Spodoptera נגזר תאי Sf9 לתמוך שכפול baculovirus טוב מאוד ומשמשים בדרך כלל להצלת וירוס והתפשטות, יש להם היכולת להפריש כמויות גדולות של חלבון מוגבל. Trichoplusia ni נגזר BTI-TN-5B1-4 תאים (הידוע בהכינוי גבוה חמש) יש יכולת הפרשה גבוהה יותר ונמצא שורת התאים של בחירה לביטוי בפרוטוקול זה 13,14. יתר על כן, כדאי להפחית או אפילו להסיר את סרום שור העובר (FBS) מתרבויות ביטוי. לפיכך, אנו משתמשים במדיה עם מופחת (3%) תוכן FBS לגידול המניות עובדות וירוס, ואנו מבצעים את ביטוי החלבון בתקשורת חופשית בסרום. חלבוני HA ו NA רקומביננטי משמשים עבור רבים טכניקות החיסוניות. אולי אחד הנפוץ ביותר הוא במבחני ELISA למדידת המרה בסרום על חיסון בבני אדם או בעלי חיים 4,6,7,15. יש וNAS משמשים גם במבחני ELISPOT כשתי מולקולות של גירוי וריאגנטים לזיהוי תאי מפרישי נוגדנים 16. השימוש בם כפיתיונות מולקולריים מאפשר במיוחד כדי למיין עבור plasmablasts או סוגים אחרים של B-תאים שלאחר מכן ניתן להשתמש כדי לבודד נוגדנים (טיפוליים) חד שבטיים (מבז). מולקולות HA ו NA רקומביננטי משמשות עוד באפיון של בז אלה 8. דוגמאות אחרות כוללות ללמוד את יציבות pH או סגוליות של קולט הביע ידי מבודד וירוס שונה, או אנזימטי NA ספציפי כמותית הערכהפעילות או התנגדות למעכבים. יתר על כן, רקומביננטי, HA מטוהר יכול לשמש כדי לתקנן תוכן HA של חיסוני נגיף שפעת מומתים. חשוב לציין, RHA (ובמידה מסוימת NA) מועמדי חיסון נמצאים כעת נבדקו במודלים של בעלי חיים וניסויים קליניים בבני אדם עם חיסון מועמד אחד שמורשה על ידי ה-FDA בשנת 2013 2,17-19. היתרון של חיסונים אלה רומן הוא כי, בשל האופי רקומביננטי של חלבונים אלו, ניתן למנוע את תהליך העבודה האינטנסיבית של יצירת של וירוסי reassortant צמיחה גבוהים. אולי אפילו יותר רלוונטי היא העובדה שתשואת HA שלהם היא גבוהה ולשעתק מזן לזן. כמו כן, מאחר חיסונים אלה מיוצרים במערכת חופשית ביצה, הם אינם מכילים חומרים מזהמים חלבון זה הם בעייתיים עבור אנשים עם אלרגיות לביצה. כאן בחרנו להביע את חלבוני HA ו NA משני בידודים של נגיף הרומן הסיני H7N9 השפעת, / Anhui/1/13 וA/Shanghai/1/13 20,21. אלו הן דוגמאות בזמן, אבל הפרוטוקול המתואר יכול לשמש לביטוי של כל שפעת וחלבונים B HA או NA וניתן להתאים להביע כל חלבונים נגיפיים או סלולריים מופרשים אחרים. ניתן לשכפל חלבונים הטרנסממברני trimeric או tetrameric לקלטות ביטוי המשמשות לHA ו NA, בהתאמה. עם זאת, חלבונים תאיים מופרשים המסיסים ביותר, כמו האינטרפרונים לדוגמא, לא צריכים תחום נוסף לייצוב ויכולים לבוא לידי ביטוי אך ורק עם תג hexahistidine C-מסוף.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus expression system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10359-016</td>
			<td>Follow manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNM-FH insect medium</td>
			<td>Gemini Bioproducts</td>
			<td>600-311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone SFX-Insect</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N58760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000702664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC902024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Columns (5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max efficiency DH10Bac bacteria</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10361-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399-100G</td>
			<td>for elution and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Five cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B85502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of functional recombinant hemagglutinin and neuraminidase proteins from the novel h7n9 influenza virus using the baculovirus expression system

מערכת ביטוי baculovirus היא כלי רב עוצמה לביטוי של חלבונים רקומביננטיים. כאן אנו משתמשים בו כדי לייצר גרסאות בצורה נכונה מקופלות ומסוכרות של שפעת גליקופרוטאינים משטח וירוס - hemagglutinin (HA) וneuraminidase (NA). כדוגמא, בחרנו חלבוני HA ו NA לידי ביטוי על ידי נגיף H7N9 הרומן שהתפתח לאחרונה בסין. עם זאת הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות לחלבוני HA ו NA לידי ביטוי בכל שפעת אחרת וזני B וירוס. חלבונים רקומביננטיים HA (RHA) וNA (RNA) הם חומרים כימיים חשובים למבחנים חיסוניים כגון ELISPOT וELISA, וגם בשימוש רחב לסטנדרטיזציה חיסון, גילוי נוגדנים, בידוד ואפיון. יתר על כן, ניתן להשתמש במולקולות NA רקומביננטי למסך למעכבי מולקולה קטנות ושימושיים לאפיון של הפונקציה האנזימטית של NA, כמו גם רגישותו לתרופות אנטי. חלבוני HA רקומביננטי גם being נבדק כחיסונים ניסיוניים במודלים של בעלי חיים, וחיסון המבוסס על HA רקומביננטי היה מורשה לאחרונה על ידי ה-FDA לשימוש בבני אדם. השיטה שאנו מתארים כאן כדי לייצר את המולקולות הללו היא ישר קדימה ויכולה להקל על מחקר במעבדות שפעת, שכן הוא מאפשר לייצור כמויות הגדולות של חלבונים במהירות ובעלות נמוכה. למרות שכאן אנחנו מתמקדים בגליקופרוטאינים משטח וירוס שפעת, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לייצר חלבונים נגיפיים משטח וסלולריים אחרים.

מולקולות HA מA/Shanghai/1/13 וA/Anhui/1/13 הביעו היטב עם תשואות של כ 20 תרבות מ&quot;ג / ליטר. מולקולות NA של שני הזנים הראו רמות ביטוי מתונות החל מתרבות מ&quot;ג / ליטר 0.2 לA/Shanghai/1/13 ל0.7 מ&quot;ג / ליטר לA/Anhui/1/13. היו כל ארבע הכנות החלבון מעט מאוד כדי לא זיהומים (8A דמויות ו-B) עם יש להיות של ט...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System at J

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

כאן אנו מתארים את דרך להביע את פני השטח אנטיגנים וירוס שפעת בצורה נכונה מקופלים ופונקציונליים הנגזרים מנגיף H7N9 הרומן הסיני בתאי חרקים. הטכניקה יכולה להיות מותאמת להביע ectodomains של כל משטח חלבונים נגיפיים או סלולריים.

ביטוי של חלבונים רקומביננטי hemagglutinin וNeuraminidase פונקציונליים מוירוס רומן H7N9 שפעת שימוש במערכת ביטוי baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

expression-functional-recombinant-hemagglutinin-neuraminidase

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.8K Views.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  כאן אנו מתארים את דרך להביע את פני השטח אנטיגנים וירוס שפעת בצורה נכונה מקופלים ופונקציונליים הנגזרים מנגיף H7N9 הרומן הסיני בתאי חרקים. הטכניקה יכולה להיות מותאמת להביע ectodomains של כל משטח חלבונים נגיפיים או סלולריים. 

Video: Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

אריזות ל-HIV או FIV מבוססי בונה הביטוי Lentivector שימוש התמרה של VSV-G חלקיקים נגיפיים Pseudotyped

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

הבחנת תפקידים פונקציונליים של ביטוי גנים מתאים חיסוניים וללא חיסון בקוליטיס המאוס על ידי השתלת מח עצם

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

שיתוף immunoprecipitation של חלבון העכבר MX1 עם nucleoprotein וירוס השפעת

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

האף מגבונים לשפעת זיהוי וירוסים ובידוד מחזירים

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

קרינה המבוססת Assay Neuraminidase העיכוב להעריך את הרגישות של שפעת וירוסים אל Neuraminidase המונע המחלקה של תרופות אנטי-ויראליות

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...