Biz monoklonal antikor CR9114 Patrick C. Wilson teşekkür etmek istiyorum. Biz de orijinal A/Anhui/1/13 plazmidlerinin Jennifer Debeauchamp ve Richard Webby teşekkür ederim. Bu iş için kısmi destek Alerji Ulusal Enstitüsü tarafından sağlanan ve Bulaşıcı Programı Proje Hibe AI097092-01A1 ve CEIRS (Grip Araştırma ve Gözetim için Mükemmeliyet Merkezleri, HHSN26620070010C) Hastalıkları-finanse edildi. FK Avusturya Bilim Fonu&#39;nun (FWF) bir Erwin Schrödinger&#39;in bursu (J 3232) tarafından desteklenmiştir.

1.. Rekombinant Bakulovirüsün Üretimi <ol><li> Bakulovirüs transfer-plasmidler içine klonlanması <ol><li> Klon H7 HA ve modifiye edilmiş plazmid aktarma pFastBac içine N9 NA ekto-saha (veya başka bir HA ya da NA geni) (giriş bölümüne bakınız). HA, bir N-terminal domain ve tetramerizasyon hekzahistidin etiketi ihtiva eden bir C-terminal domain ve bir trimerleştirme hekzahistidin etiketi ihtiva eden, hem de NA için vektörler, (Şekil 1) 1,10,11,22 tarif edilmiş ve talep edilebilir yazarlar. Açıklayıcı Not: trimerleştirme etki olmadan ifade HA ektodomenleridir özellikle sap etki, uygun nötralize epitoplardan kaybına yol açan, yanlış katlanmış olacak. Benzer şekilde, NA enzimatik fonksiyonu uygun bir tetramerizasyon dayanır. </li><li> Bacmid Üretimi Bir bakulovirüs ifadesi kullanarak göre DH10Bac bakteri içine HA ve NA genlerini içeren bakulovirüs transfer plasmidlerini Dönüşümü, üretici talimatlarına göre sistem. Izole edin ve üreticinin talimatlarına (Şekil 2) uygun bir kit kullanılarak Midiprep bakmitler arındırmak. </li></ol></li><li> Protein ekspresyonunun rekombinan bakulovirüs ve doğrulama Kurtarma Açıklayıcı Not: Aşağıdaki adımlar, bir laminer akış kaputu aseptik yapılması gerekir. HA ve NA (veya ilgi herhangi bir başka gen) bağımsız bu yordamı gerçekleştirin. Böcek hücreleri genellikle CO 2 olmadan 28 ° C&#39;de yetiştirilir. Bu protokol için Sf9 hücreleri, aksi belirtilmedikçe,% 10 FBS,% 1 Pen-Strep ve% 0.1 * Pluronic F68 çözeltisi ile takviye edilmiş TNM-FH tam böcek hücre ortamında yetiştirilen ve haftada iki kez 01:04 pasajlanır. High Five hücreleri SFX serumsuz ortam içinde büyümüş ve haftada iki kez 01:15 pasajlanır. * Antibiyotiklerin eklenmesi protokol boyunca isteğe bağlı olarak kabul edilir ve her bir laboratuarda kullanılan uygulamalara göre ayarlanmalıdır. <ol><li> / Cm 2 2 x 10 5 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu plakalar içerisinde Sf9 böcek hücreleri Plate ve (CO 2 olmadan) 28 ° C kuluçka makinesi içinde 20 dakika boyunca bekletin. </li><li> Karışım 2 ug TNM-FH ortamı (serumsuz,% 1 Pen-Strep) içinde 100 ul ile yeniden birleştirici bakmit bölgesinin (kons. 0.5-2 ug / ul). TNM-FH ortamı (serumsuz, Pen-Strep) içinde 100 ul transfeksiyon ajanı 6 ul karıştırın. , Iki cilt birleştirin, yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında (transfeksiyon karışımı), 20 dakika boyunca bekletin. Kontrol olarak bir mock-transfeksiyonunu (Şekil 3) içerir. </li><li> (Hücreler artık plaka sopa) ve Pen-strep (% 1) içeren serumsuz TNM-FH ortamı 2 ml ile değiştirin kaplama Sf9 hücrelerinden süpernatantı. (Aşama 1.2.2) transfeksiyon karışımı tam hacmi ilave edin ve 5 saniye için dikkatli bir şekilde 6-çukurlu plaka sallayın. 6 saat (Şekil 3) için CO 2 olmayan bir 28 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edin. </li><li> Medya wi değiştirinth taze tam TNM-FH ortamı (% 10 FBS,% 1 Pen-Strep ve% 0.1 Pluronic F68 ihtiva eden). 6 gün için CO 2 olmayan bir 28 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edin. Bir mikroskop altında bazen hücreleri kontrol ediniz. Enfekte hücreler genellikle, yuvarlak, büyük görünür çekirdek genişlemiş olması, ve (Şekil 4) ayırmak başlar. </li><li> Hücre ve protein ekspresyonu teyit hasat <ol><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2000 x g&#39;de santrifüj ile hasat hücreleri 6 gün sonra transfeksiyon. Süpernatan, rekombinant bakulovirüs içerir - bu hemen çalışma stokları elde etmek için kullanılabilir, ya da yıl boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Protein ifadesini kontrol etmek için 500 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ve pelet toplamak. (Indirgeyici bir ajan içeren) SDS-PAGE yükleme tamponu 50 ul süspansiyon 50 ul karıştırın. SDS-PAGE çalıştırın ve gen ifadesini teyit etmek için, bir anti-hekzahistidin antikoru ile Western leke analizi. Mock hücreleri dahilNegatif kontrol olarak transfeksiyon (Şekil 3). </li></ol></li><li> Çalışma stoklarının hazırlanması <ol><li> Levha 5 x 10 5 Sf9 hücre / a T175 cm 2 şişeye cm 2 ve 20 dk onlara çanak takmak için izin bekletin. TNM-FH ortamı 3% FBS (ve% 1 Pen-strep,% 0.1 Pluronic F68) içeren tam bir TNM-FH ortamı değiştirin. </li><li> Kurtarma süpernatan 100 ul hücre, Infect. 6 gün boyunca CO 2 olmadan 28 ° C inkübatör ve hücreleri enfekte olsun bazen kontrol edin (adım 1.2.5 açıklandığı gibi.). </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 2000 x g&#39;de Spin ve supernatant toplamak. Bu artık P2 stok. Bu stok 4 ° C&#39;de süresiz olarak saklanabilir Hücreleri enfekte etmek için P2 stokunun 100 ul ile enfeksiyon prosedürü tekrarlayın. Elde edilen stok P3 ya da 4 ° C&#39;de saklandı veya protein ekspresyonu için direkt olarak kullanılabilir çalışma stok olarak adlandırılır. P3 stok genellikle 10 içeriyor &lt;sup&gt; 7 -10 9 plak oluşturan ünite / ml oluşturulması. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Protein Expression and Purification Açıklayıcı Not: Sf9 hücreleri çok iyi baculovirus&#39;un büyümesini desteklemek. Bununla birlikte, yeniden birleştirici proteinin büyük miktarlarda salgılama kapasitesi sınırlıdır. Bu nedenle, salgılanmış rekombinant proteinlerin ifadesi için bir böcek hücre hattı, High Five hücreleri kullanır. Bu hücreler çok yüksek titreleri 13 baculovirus çoğaltılmasını desteklemek ancak yüksek salgı kapasitesi yok. <ol><li> High Five hücreleri büyüyor T175 cm2 şişelerde SFX böcek hücre kültürü ortamı içinde High Five hücreleri büyütün. Passage her gün 01:03. 200 ml ifade kültür için, 5 konfluan şişeleri büyümeye ihtiyacımız olacak. </li><li> High Five hücreleri hasat ve enfekte <ol><li> Elinizle şişeler dokunarak 5 T175 cm 2 matara High Five hücreleri ayırın. Hücre süspansiyon haline toplamaknsion ve 50 ml santrifüj tüplerine aktarılır. </li><li> Oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 1200 x g&#39;de dönerler. Süzülerek süpernatantı ve P3 stokunun 15 ml bunları yeniden süspanse ile granül birleştirmek. </li><li> (Şekil 5) akış başlığı içinde, 15 dakika boyunca bekletin. </li><li> Temiz, steril 1000 ml&#39;lik bir çalkalama şişesi içine Hyclone SFX kültür ortamının 200 ml aktarın (otoklavlamadan önce alüminyum folyo ile sızdırmaz Buffles olmadan önce bakteri kültürleri için kullanılmış olmamalıdır). </li><li> Çalkalayıcı balona P3/cell süspansiyonu aktarın. Bir karıştırıcı içine steril alüminyum folyo ve transfer şişesi ile kapatılmalıdır. 72-96 saat boyunca 28 ° C&#39;de 70 rpm&#39;de çalkalanır. </li></ol></li><li> High Five hücre ifade süpernatanlarından yeniden birleştirici protein Hasat <ol><li> 500 ml santrifüj kova içine 72-96 saat sonrası enfeksiyon transferi kültürü yüzerler. 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 5500 x g&#39;de Spin Bu sırada çalkalama şişeleri, iki kez damıtılmış su ile 3 kez yıkayın(GKD 2 O). </li><li> PBS (bir 200 ml kültür başına gerekli olan) 45 ml bir 50 ml tüp içine aktarın 3 ml Ni-reçine bulamacı. İyice çalkalayın ve 10 dakika oda sıcaklığında 3.000 xg&#39;de dönerler. PBS Durusu ve pelet tutun. Ni-reçine pelet ile böcek hücresi süpernatant karıştırın ve daha önce çalkalandı çalkalama şişeleri içine aktarın. (Şekil 6) çalkalandı, 2-4 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bir sopalı bir kelepçe Mount 10 ml polipropilen sütun. Hem kapaklarını çıkarın ve (atık) aracılığıyla akışını toplamak için sütunun altında bir beher yerleştirin. Çalkalayıcı dışarı çalkalama şişesi al ve bu kolona süpernatan / çamur karışımı aktarmak başlar, bu Ni-reçine korumak ve süpernatanının akacaktır. Sütun üzerinde, tüm birimi (Şekil 7) geçmektedir. </li><li> Yıkama tamponu, 15 ml (50 mM Na HCO3 2, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8) ile reçinenin 4x yıkayın. Tüm yıkama tamponu kurutalımKolondan ve kapağın (alt yan) ile kapatın. </li><li> Elüsyon tamponu 2 ml (50 mM Na HCO3 2, 300 mM NaCl, 300 mM imidazol, pH 8) ilave edin ve 5 dakika boyunca bekletin. Sütunu açın ve eluatın toplamak. (Elüsyon tamponu 8 ml toplam), bu 3 kez daha tekrarlayın. (Şekil 7) çalkalandığında proteini yüksek konsantrasyonlarını içeren Yıkama sıvısı, tipik olarak köpük gösterir. Mümkün Islak buz üzerinde eluatın tutun. </li></ol></li><li> Tampon değişimi ve konsantrasyon <ol><li> Prespin 15 ml santrifüj, ultrafiltrasyon birimi 20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 3000 x g&#39;de, PBS (pH 7.4-7.6) ile (HA / NA 30 kDa kesme ancak saflaştırılmış protein boyutuna bağlı olarak değişebilir). Spin kolona yoluyla ve yük Eluat akış atın. 4 ° C&#39;de 5 steril, buz gibi soğuk PBS ml ve 3.000 x g&#39;de 60 dakika boyunca bir dönüş ile doldurun </li><li> Tekrar yoluyla boşaltım akış, 15, buz gibi soğuk PBS eklenir ve 4 ° C&#39;de 3000 x g&#39;de 60 dakika boyunca bir dönüş ile doldurun Bu prosedürü tekrarlayınbir kez daha Duré. </li><li> Santrifüj dışarı spin kolon almak ve tampon alışverişinde konsantre (tipik olarak 200 ul) toplamak. Bu son derece rekombinant protein konsantre edilir. Steril, buz gibi soğuk PBS ile 400 ul spin kolon durulayın ve bu konsantre, bu ekleyin. Her zaman buz üzerinde konsantre edin. </li></ol></li></ol> 3. Karakterizasyonu ve Kalite Kontrol <ol><li> Protein konsantrasyonunun ölçülmesi Konsantresinin bir kısım almak ve seçtiğiniz protein ölçümü yöntemini kullanarak ölçeriz. PBS eklenerek 1 mg / ml protein konsantrasyonu getirin ve -80 ° C&#39;ye kadar az miktar dondurma Donma çözülme döngüleri protein yapısına zarar ve toplama yol açabilir. </li><li> SDS-PAGE ve Coomassie boyama SDS-PAGE üzerinde protein 500 ng çalıştırın ve Comassie lekelenme gerçekleştirin. Hızlı ve kolay bir boyama için bir mikro dalga protokolü ile kombine Coomassie reaktif kullanın. HA proteinler genellikle 64 görünürkDa NA proteinleri etrafında 56 kDa (Şekil 8A ve B) bir boyutu çalışmalıdır oysa. Açıklanan protokolünü kullanarak herhangi bir bozunma ürünleri görmek gerekir. Bozulma meydana gelirse, genellikle ifade sırasında maya / mantar bulaşma bir işaretidir. Bu durumda prosedürü tekrarlayın ve steril her şeyi tutmak için emin olun. </li><li> Western blot / ELISA Protein kimliğini doğrulamak için biz belirli bir antikor ile bir Western Blot veya ELISA deneyi yapmak öneririz. İdeal olarak, ELISA deneyleri, konformasyonel epitopları (örneğin anti-HA antikor sapı 1) bağlanan bir antikor ile gerçekleştirilir. Bu tür bir antikor kullanılarak proteinin doğru katlanır (Şekil 8C) teyit edilebilir. </li><li> Etkinlik NA Ölçme Viral NA doğru katlanması da NA aktivitesi ölçülerek belirlenebilir. Biz piyasada mevcut NA * YILDIZ deneyi (sadece kullanıcı yönergeleri izleyin) kullanarak bu testi yapılmasını önermekteyiz. </li></ol>

<ol>
	<li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carboxy-terminal+trimerization+domain+stabilizes+conformational+epitopes+on+the+stalk+domain+of+soluble+recombinant+hemagglutinin+substrates.">A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates.</a> PLoS One. 7, e43603 (2012).</li><li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly-protective+stalk-specific+antibodies.">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., C&#225;rdenas, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+infection+in+Guinea+pigs+raised+as+livestock,+ecuador.">Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador.</a> Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).</li><li>Margine, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3N2+influenza+virus+infection+induces+broadly+reactive+hemagglutinin+stalk+antibodies+in+humans+and+mice.">H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1976+and+2009+H1N1+Influenza+Virus+Vaccines+Boost+Anti-Hemagglutinin+Stalk+Antibodies+in+Humans.">1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans.</a> J. Infect. Dis. 652, (1976).</li><li>Pica, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+stalk+antibodies+elicited+by+the+2009+pandemic+influenza+virus+as+a+mechanism+for+the+extinction+of+seasonal+H1N1+viruses.">Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).</li><li>Sangster, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+B+cell+response+and+hemagglutinin+stalk-reactive+antibody+production+in+different+age+cohorts+following+2009+H1N1+influenza+vaccination.">The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination.</a> Clin. Vaccine Immunol. , (2013).</li><li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pan-h1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo.">A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).</li><li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope.">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324, 246-251 (2009).</li><li>Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+the+1918+influenza+virus+H1N1+neuraminidase.">Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase.</a> J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).</li><li>Stevens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+uncleaved+human+H1+hemagglutinin+from+the+extinct+1918+influenza+virus.">Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus.</a> Science. 303, 1866-1870 (2004).</li><li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+efficacy+of+neutralizing+antibodies+elicited+by+recombinant+hemagglutinin+proteins+from+avian+H5N1+influenza+virus.">Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus.</a> J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).</li><li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichoplusia+ni+cells+(High+Five)+are+highly+efficient+for+the+production+of+influenza+A+virus-like+particles:+a+comparison+of+two+insect+cell+lines+as+production+platforms+for+influenza+vaccines.">Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines.</a> Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).</li><li>Palmberger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+for+antibody+production:+evaluation+of+an+efficient+alternative.">Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative.</a> J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).</li><li>Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+and+immunogenic+properties+of+recombinant+hemagglutinin+proteins+from+H1N1+A/Brisbane/59/07+and+B/Florida/04/06+when+produced+in+various+protein+expression+systems.">Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems.</a> Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).</li><li>Wrammert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadly+cross-reactive+antibodies+dominate+the+human+B+cell+response+against+2009+pandemic+H1N1+influenza+virus+infection.">Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection.</a> J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).</li><li>Treanor, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+a+trivalent+recombinant+hemagglutinin+protein+vaccine+(FluBlok)+against+influenza+in+healthy+adults:+a+randomized,+placebo-controlled+trial.">Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial.</a> Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).</li><li>Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+recombinant+protein-based+influenza+vaccine.+Expression+and+affinity+purification+of+H1N1+influenza+virus+neuraminidase.">Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase.</a> J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).</li><li>Krammer, F., Grabherr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+influenza+vaccines+made+by+insect+cells.">Alternative influenza vaccines made by insect cells.</a> Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Infection+with+a+Novel+Avian-Origin+Influenza+A+(H7N9)+Virus.">Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus.</a> N. Engl. J. Med. , (2013).</li><li>Goff, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cross-reactive+antibodies+to+novel+H7N9+influenza+virus+by+recombinant+Newcastle+disease+virus+expressing+a+North+American+lineage+H7+subtype+hemagglutinin.">Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin.">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+conserved+protective+epitopes+on+influenza+B+viruses.">Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses.</a> Science. 337, 1343-1348 (2012).</li><li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+influenza+viruses+containing+NS1+truncations+as+vaccine+candidates+against+H5N1+highly+pathogenic+avian+influenza.">Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza.</a> J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).</li><li>Fouchier, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+A+virus+(H7N7)+associated+with+human+conjunctivitis+and+a+fatal+case+of+acute+respiratory+distress+syndrome.">Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).</li><li>Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bakulovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak böcek hücrelerinde influenza virüsü HA ve NA proteinlerin ekspresyonu yalındır genel olarak da, dikkate birkaç önemli nokta vardır. Girişte işaret gibi HA ve NA ektodomenleridir sırasıyla trimerleştirme veya tetramerizasyon etki ile füzyon ifade edilir ki, önemlidir. Bu etki genellikle sadece ekto ifade edilir ise mevcut değildir transmembran alanı tarafından desteklenir moleküllerin doğru katlanmasını sağlar. Örneğin, bir trimerleştirme etki olmad...

Çin yeni H7N9 influenza virüsü suşunun yakın zamanda ortaya çıkmasına bir ilk tepki olarak, hemagglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA) ilk iki izolatın genlerinin genomik sekansları taşıyan plazmid aldı. Hızlı bir şekilde böcek hücrelerinde rekombinant HA ve NA üretimi için bakuloviral ifade vektörlerini oluşturmak için mümkün olan bu plazmidler kullanılarak. Bu ifade sistem iyi laboratuvarımızda kurulan ve devam eden araştırma projeleri 1-8 birçok önemli kanıtlanmıştır. Böcek hücreleri doğru katlayın ve çeviri sonrası kompleks proteinleri değiştirmek edebiliyoruz. Bu modifikasyonlar, pek çok viral glikoproteinler için önemli olan N-bağlı glikosilasyon içerir. Bu nedenle, bu bakulovirüs sistemi oldukça influenza virüsü yüzey antijenlerini eksprese etmek için kurulmuş olduğu şaşırtıcı değildir. Aslında, HA ve NA kristal yapılarının birçok böcek hücresi ifade edilen proteinler, 9-11 kullanılarak çözüldü. Diğer bir avantajıGüçlü polihedrin promoterinden virüs enfeksiyonu sürülen ifadesinin sonucu - sistemi (50&#39;den fazla farklı HA proteinleri ile deneyime dayalı) HA / L hücre kültürü kadar 30 mg onun güvenilir, yüksek protein verimi yatıyor. HA ve NA proteinlerin transmembran ve endodomain çıkarılması proteinlerin salgılanabilir, çözünür versiyonları ekspresyonu sağlar ve böylece büyük ölçüde saflaştırma işlemini kolaylaştırır. Ayrıca, bu ektodomenleridir hekzahistidin etiketlenir ve bu nedenle Ni 2 +-reçinesi kullanılarak afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılabilir. HA ve NA proteinlerin transmembran domainleri, ayrı ayrı, homotrimer ve homotetramer oluşumu katkıda bulunur. Bu oligomerizations korumak amacıyla, HA-ve NA için bir N-terminal tetramerizasyon alan (Şekil 1) oluşturur, bir C-terminal alanı trimerleştirme ekleyin. Biz böyle bir trimerleştirme alanı işlev, sırayla nu stabilize olduğunu kesin olarak göstermiştirHA 1 sap-etki şekilsel epitoplarını SVEd. NA doğru tetramerizasyon katlanma ve NA fonksiyonu 10 düzeltmek için katkıda bulunabilir. Trimerleştirme veya tetramerizasyon etki barındıran Diziler ve bakulo transfer vektörleri yazarların ya da alanında, 9,10,12 diğer laboratuarlardan talep edilebilir. Böcek hücrelerinde salgılanan proteinlerin ifadesi için diğer bir önemli konu, doğru hücre çizgisinin bir seçimdir. Spodoptera frugiperda Sf9 hücreleri, bakulovirüs çok iyi kopyalanmasını desteklemek ve genellikle virüs kurtarma ve yayılması için kullanılan türetilmiş olmakla birlikte, yüksek miktarda protein salgılaması için kısıtlı bir kapasiteye sahiptir. Trichoplusia ni (genellikle High Five olarak da bilinir) BTI-TN-5B1-4 hücrelerini türetilmiş Daha yüksek bir salgılama kapasitesine sahiptir ve bu protokol 13,14 ekspresyon için tercih edilen bir hücre çizgisidir. Bundan başka, cenin sığır serumu azaltmak ve hatta ortadan kaldırmak için yararlı olan (FBSentezleme kültürlerinden S). Bu nedenle çalışma stokları, virüs büyümesi için indirgenmiş (% 3) FBS içerikli ortamını kullanın, ve serum içermeyen medya içinde protein ekspresyonu gerçekleştirir. Yeniden birleştirici HA ve NA proteinleri birçok immünolojik teknikler kullanılmaktadır. Belki de en yaygın olanı, insanlarda veya hayvanlarda 4,6,7,15 aşılama üzerine serum dönüşüm ölçülmesi için ELISA deneyleri bulunmaktadır. Ve UA&#39;lar aynı zamanda, antikor salgılayan hücreler 16 için uyarıcı moleküllerin ve saptama reaktifleri olarak hem ELISPOT analizlerinde kullanılır. Moleküler yemler olarak kullanılması özellikle plazmablastlar ya da daha sonra (terapötik) monoklonal antikorların (mAb &#39;ler) izole etmek için kullanılabilir B-hücrelerinin diğer türleri için sıralamak sağlar. Yeniden birleştirici HA ve NA molekülleri ayrıca bu mAb&#39;lerin 8 karakterizasyonunda kullanılır. Diğer örnekler pH stabilitesini veya reseptör özelliklerini farklı virüs izolatları tarafından dile gelmiştir, ya da kantitatif değerlendirilmesi belirli NA enzimatik çalışma bulunmaktadırinhibitörleri ile faaliyet veya direnç. Bundan başka, rekombinant, arıtılmış, HA hareketsizleştirilmiş grip aşılarının HA içeriği standardize etmek için kullanılabilir. Önemlisi, rHA (ve belli bir dereceye kadar NA) aşı adayları şu anda bir aşı adayı 2013 2,17-19 yılında FDA tarafından lisanslı olması ile hayvan modellerinde ve insan klinik deneylerle test ediliyor. Bu yeni aşıların avantajı, bu proteinlerin rekombinant doğası gereği, yüksek büyüme reassortant virüs üretme emek yoğun bir işlemi önlenebilir, yani. Belki daha uygun kendi HA verimi yüksek ve gerginlik gerginlik tekrarlanabilir olduğu gerçektir. Bu aşılar bir yumurta serbest sistemi üretilmektedir beri Ayrıca, onlar yumurta alerjisi olan bireyler için sorunlu olan protein kirletici içermez. Burada yeni Çin H7N9 influenza virüsü, A / Anh iki izolatlardan HA ve NA proteinleri ifade seçtiui/1/13 ve A/Shanghai/1/13 20,21. Bu zamanında örnekler, ancak tarif edilen protokol bir influenza A ve B HA veya NA proteinlerin ifadesi için kullanılabilir ve herhangi bir başka salgılanmış viral veya hücresel proteinleri ifade etmek için uyarlanabilir. Trimerik, tetramerik ya da zar proteinleri, sırasıyla HA ve NA için kullanılan ekspresyon kasetleri içerisine klonlanabilir. Ancak, çoğu çözünür salgılanmış hücresel proteinler, örneğin interferonlar gibi, stabilizasyon için ek bir etki gerek yoktur ve bir C-ucu heksahistidin etiketi ile sadece ifade edilebilir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus expression system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10359-016</td>
			<td>Follow manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNM-FH insect medium</td>
			<td>Gemini Bioproducts</td>
			<td>600-311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone SFX-Insect</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N58760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000702664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC902024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Columns (5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max efficiency DH10Bac bacteria</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10361-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399-100G</td>
			<td>for elution and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Five cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B85502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of functional recombinant hemagglutinin and neuraminidase proteins from the novel h7n9 influenza virus using the baculovirus expression system

Bakulovirüs sentezleme sistemi, rekombinant proteinlerin ifadesi için güçlü bir araçtır. Hemagglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA) - Burada grip doğru katlanmış ve glikosile edilmiş versiyonları A virüsü yüzey glikoproteinleri üretmek için kullanır. Örnek olarak, son zamanlarda Çin&#39;de ortaya çıkan yeni H7N9 virüsü tarafından ifade HA ve NA proteinleri seçti. Ancak Protokol kolayca başka bir influenza A ve B virüs türleri tarafından ifade edilen HA ve NA proteinler için uyarlanabilir. Yeniden birleştirici HA (rHA) ve NA (RNA) proteinleri, ELISPOT ve ELISA gibi immünolojik tahliller için önemli olan reaktif maddeler ve aşı standardizasyon, antikor keşfi, izolasyonu ve karakterizasyonu için yaygın olarak kullanılan da vardır. Bundan başka, rekombinant NA moleküllerinin, küçük molekül inhibitörleri için taranması için kullanılabilir ve NA enzimatik fonksiyonunun karakterizasyonu yanı sıra antiviral için duyarlılığı için yararlıdır edilebilir. Yeniden birleştirici HA proteinleri de vardır being hayvan modellerinde deneysel aşı olarak test edilmiş ve yeniden birleştirici HA göre bir aşı son zamanlarda, insanlarda kullanım için FDA tarafından lisanslı oldu. Hızlı ve düşük maliyetle proteinleri büyük miktarlarda üretimi sağlar beri bu molekülleri üretmek için burada açıklamak yöntemi, yalındır ve grip laboratuarlarında araştırma kolaylaştırabilir. İnfluenza virüsü yüzey glikoproteinler odak burada da, bu yöntem, aynı zamanda, diğer viral ve hücre yüzeyi proteinleri üretmek için kullanılabilir.

A/Shanghai/1/13 ve A/Anhui/1/13 HA molekülleri, yaklaşık 20 mg / L kültür verimleri ile de ifade edilmiştir. Her iki soylarının NA molekülleri A/Shanghai/1/13 için 0.2 mg / L kültür A/Anhui/1/13 için 0.7 mg / L arasında değişen orta derecede ifade seviyeleri göstermiştir. Dört protein preparatları ekspresyon seviyesi ile açıklanabilir UA daha yüksek saflıkta olmak vardır ile (Şekil 8A ve B) herhangi bir yabancı madde için çok az vardı. A/Shanghai/1/13 HA da...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System at J

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Burada böcek hücrelerinde yeni Çin H7N9 virüsünden türetilen doğru katlanmış ve işlevsel bir influenza virüsü yüzey antijenlerini eksprese etmek için bir yol tarif eder. Bu teknik, bir viral veya hücre yüzey proteinlerinin ektoalanlarının ifade etmek için uyarlanabilir.

Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

expression-functional-recombinant-hemagglutinin-neuraminidase

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.9K Görüntüleme.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  Burada böcek hücrelerinde yeni Çin H7N9 virüsünden türetilen doğru katlanmış ve işlevsel bir influenza virüsü yüzey antijenlerini eksprese etmek için bir yol tarif eder. Bu teknik, bir viral veya hücre yüzey proteinlerinin ektoalanlarının ifade etmek için uyarlanabilir. 

Video: Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

Ambalaj HIV veya FIV tabanlı Lentivector İfade Yapıları &amp; VSV-G Pseudotyped Viral Parçacıklarının İletimi

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Bluetongue Virüs karşı Roman Antiviraller belirlenmesi için Tahliller

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

CDNA&#39;dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

İnfluenza A virüsü nükleoproteini Fare MX1 Protein Co-immunopresipitasyonu

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Domuz influenza A virüs Algılama ve İzolasyonu için Burun Mendil

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...