我々は、モノクローナル抗体CR9114のためにパトリックC.ウィルソンに感謝したいと思います。我々はまた、元のA/Anhui/1/13のプラスミドについてジェニファーDebeauchampとリチャードウェビーに感謝します。この仕事のための部分的なサポートは、アレルギーのための国立感染症研究所が資金提供プログラムプロジェクト無償AI097092-01A1とCEIRS（インフルエンザ研究および監視のためのセンター·オブ·エクセレンス、HHSN26620070010C）によって提供された。 FKは、オーストリア科学基金（FWF）からアーウィンシュレーディンガーの交わり（J 3232）によってサポートされていました。

1。組換えバキュロウイルスの生成<ol><li>バキュロウイルストランスファープラスミドへのクローニング<ol><li>クローンH7 HAと修正されたpFastBac転送プラスミドにN9のNA外部ドメイン（または他のHAまたはNA遺伝子）（紹介を参照してください）​​。 HAのC末端三量体化ドメインおよびヘキサヒスチジンタグを含有するため、並びにNAはN-末端四量体化ドメインおよびヘキサヒスチジンタグを含有するためのベクターは、1,10,11,22（ 図1）が記載されているから要求することができ作者。 説明文：HA外部ドメインは、三量体化ドメインなしで発現が特にストークドメイン、立体配座中和エピトープの喪失をもたらす、誤って折り畳まれます。同様に、NAの酵素機能は、適切な四量に依存しています。 </li><li>バクミドの生成 バキュロウイルス発現を使用して応じDH10Bacコンピ細菌にHAおよびNA遺伝子を含むバキュロウイルストランスファープラスミドを変換製造者の指示に従ってシステム。単離し、製造業者の指示（ 図2）に係るミディプレップキットを用いてバクミドを精製する。 </li></ol></li><li>タンパク質発現の組換えバキュロウイルスおよび検証の救助 説明文：次の手順は、層流フード内で無菌的に実行されなければならない。 HAおよびNA（または関心のある他の遺伝子）に独立して、この手順を実行します。昆虫細胞は、通常、CO 2せずに28℃で増殖させる。このプロトコルのSf9細胞を、他に示されない場合、10％FBS、1％ペニシリン-ストレプトマイシン*および0.1％プルロニックF68溶液を補充した完全TNM-FH昆虫細胞培地中で増殖させ、1週間に2回、1:4に継代する。ハイファイブ細胞はSFXの無血清培地中で増殖させ、週二回1:15継代する。 *抗生物質を添加すると、プロトコル全体オプションとみなされ、各研究室で使用される慣習に従って調整する必要があります。 <ol><li> 2×10 5細胞/ cm 2の密度で6ウェルプレート中のプレートSf9昆虫細胞（CO 2なし）28℃のインキュベーター内に20分間放置。 </li><li>ミックス2μgのTNM-FH培地（無血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシン）100μlの組換えバクミドの（濃0.5-2μgの/ UL）。 TNM-FH培地（無血清、ペニシリン - ストレプトマイシン）100μlのトランスフェクション試薬の6μLを混ぜる。 2ボリュームを兼ね備​​え、穏やかに混合し、室温（トランスフェクション混合物）で20分間放置します。コントロール（ 図3）のように1モックトランスフェクションが含まれています。 </li><li> （細胞は今板に固執する）およびペニシリン - ストレプトマイシン（1％）を含む無血清TNM-FH培地2mlで交換してメッキSf9細胞からの上清を取り除きます。 （ステップ1.2.2からの）トランスフェクション混合物の完全なボリュームを追加し、5秒間、慎重に6ウェルプレートを揺する。 6時間（ 図3）のために、CO 2なしで28℃のインキュベーターで培養する。 </li><li>メディアWIを交換してください目の新鮮な完全TNM-FH培地（10％FBS、1％ペニシリン - ストレプトマイシンおよび0.1％プルロニックF68を含む）。 6日間、CO 2のない28℃のインキュベーター内でインキュベートする。顕微鏡下で、時折細胞を確認してください。感染した細胞は通常、丸く大きな表示される核を拡大しており、（ 図4）を分離するために開始します。 </li><li>細胞およびタンパク質発現の確認の収穫<ol><li>室温で5分間、2,000×gで遠心分離により細胞を回収し6日後、トランスフェクション。上清を、組換えバキュロウイルスを含有する - これはすぐに作業ストックを生成するために使用される、または数年間、4℃で保存することができる。 </li><li>タンパク質の発現を確認するために、PBS500μlにペレットを再懸濁を収集します。 （還元剤を含む）、SDS-PAGEローディング緩衝液50μlの懸濁液50μlを混合する。ランSDS-PAGEおよび遺伝子発現を確認し、抗ヒスチジン抗体を用いたウェスタンブロット分析を行う。モックからの細胞を含む陰性対照としてトランスフェクション（ 図3）。 </li></ol></li><li>ワーキングストックの調製<ol><li> 20分は彼らが皿にアタッチできるよう放置プレートT175センチ2フラスコ中の5×10 5個のSf9細胞/ cm 2としましょう。 TNM-FH培地を、3％FBS（及び1％ペニシリン - ストレプトマイシン、0.1％プルロニックF68）を含有する完全なTNM-FH培地を交換してください。 </li><li>救助上清100μlで細胞を感染させる。 （ステップ1.2.5で説明したように。）6日間、CO 2なしで28℃のインキュベーターで培養すると、細胞が感染した場合、時々チェックしてください。 </li><li>室温で5分間2,000×gでスピンし、上清を集める。これは今のP2の在庫です。このストックは4℃で無期限に保存することができます細胞に感染させるために、P2の株式100μLを使用して、感染の手順を繰り返します。得られた株は、P3又は4℃で保存またはタンパク質発現のために直接使用することができる作業ストック、と呼ばれる。 P3の株価は通常、10が含まれています&lt;SUP&gt; 7 -10 9プラーク単位/ mlを形成する。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2。タンパク質発現および精製 説明文：Sf9細胞は非常によく、バキュロウイルスの成長をサポートしています。しかしながら、大量の組換えタンパク質を分泌するそれらの能力には限界がある。そこで我々は、分泌された組換えタンパク質の発現のための他の昆虫細胞株、ハイファイブ細胞を使用する。これらの細胞は、非常に高い力価13にバキュロウイルスの複製をサポートしていますが、高い分泌能力を持っていません。 <ol><li>ハイファイブ細胞を育っ T175のcm 2のフラスコ中でSFX昆虫細胞培養培地中でハイファイブ細胞を成長させる。継代日おきに1時03分。 200ミリリットルの発現培養のためには、5集密フラスコを成長させる必要があるでしょう。 </li><li>ハイファイブ細胞を回収し、感染<ol><li>あなたの手でフラスコをタップして5のT175センチ2フラスコからハイファイブ細胞を剥離。細胞s​​uspeを収集nsionとを50ml遠心チューブに移す。 </li><li>室温で7分間1200×gでスピン。デカントにより上清を除去し、P3の株式の15ミリリットルでそれらを再懸濁することにより、ペレットを団結させる。 </li><li> （ 図5）流フード内で15分間放置します。 </li><li>清潔な滅菌千ミリリットルシェーカーフラスコにハイクローンSFX培地の200ミリリットルを転送する（オートクレーブ前にアルミホイルで密閉しbufflesことなく、前に細菌培養のために使用されているべきではありません）。 </li><li>シェーカーフラスコにP3/cellサスペンションを転送します。シェーカーに無菌アルミ箔と転送フラスコを密封する。 72〜96時間、28℃、70 rpmで振とうする。 </li></ol></li><li>ハイファイブ細胞発現上清から組換えタンパク質を回収する<ol><li> 500ミリリットルの遠心バケットに72〜96時間感染後の転写培養上清。 4℃で20分間5500×gでスピンその間、シェーカーフラスコを蒸留水で3回すすぎ（のddH 2 O）。 </li><li> PBSを45ミリリットルと50ミリリットルチューブに移す3ミリリットルのNi-樹脂スラリー（200ミリリットル文化ごとに必要な1）。よく振って10分間室温で3000×gでスピン。 PBSをデカントし、ペレットを保持します。ニッケル樹脂ペレットで昆虫細胞上清を混合し、既にすすい振盪フラスコに移す。 （ 図6）を振とうしながら、2〜4時間、4℃でインキュベートする。 </li><li>支持スタンド上のクランプのマウント10ミリリットルのポリプロピレンカラム。両方のキャップを取り外し、（廃棄物）を通る流れを収集するために、列の下にビーカーを置く。シェーカーからシェーカーフラスコを取り、カラムに上清/スラリー混合物を転送するために開始し、それをNi-樹脂を保持し、上清のみが流れます。コラム（ 図7）を介して、ボリューム全体を渡します。 </li><li>洗浄緩衝液（50mMのNa 2 HCO 3、300mMのNaCl、20mMのイミダゾール、pH 8）15mlで樹脂4回洗浄する。すべての洗浄緩衝液ドレンせ列からのキャップ（下側）とそれを閉じます。 </li><li>溶出バッファーの2ミリリットル（50のNa 2 HCO 3、300mMのNaCl、300 mMイミダゾール、pHが8）を追加し、5分間放置します。列を開き、溶出液を収集します。 （溶出バッファーの8ミリリットルの合計）は、この3回繰り返します。 （ 図7）とうしたとき、通常、タンパク質を高濃度で含まれている溶出液は、泡を示しています。可能な限り、濡れた氷の上に溶出液を保管してください。 </li></ol></li><li>バッファー交換及び濃度<ol><li> 20分間4℃で3000×gでのPBS（pH値7.4〜7.6）とPrespin 15ミリリットル限外ろ過、遠心分離装置（HA / NA用30kDaのカットオフが、精製されたタンパク質のサイズによって異なる場合があります）。フロースルー、スピンカラムに溶出液を読み込む捨てる。無菌の氷冷PBSの5ミリリットルでいっぱいにし、4℃で3000×gで60分間スピン</li><li>再び、15の氷冷PBSの添加し、4℃で3000×gで60分間スピンして補充を介して吐出流量このproceを繰り返し1より多くの時間をdure。 </li><li>遠心機からスピンカラムを取得し、バッファ交換した濃縮（通常200μl）を収集します。これは、高度に濃縮された組換えタンパク質である。無菌の氷冷PBS400μlのスピンカラムをすすぎ、濃縮​​液にこれを追加。常に氷上に集中しておいてください。 </li></ol></li></ol> 3。特性評価および品質管理<ol><li>タンパク質濃度を測定すること 濃縮物のアリコートを取り、お好みのタンパク質定量法を用いて、それを測定する。 PBSを添加することにより、1 mg / mlのにタンパク質濃度を設定し、-80℃に小分けし凍結凍結融解サイクルは、タンパク質の構造に悪影響を与えると集約につながることができます。 </li><li> SDS-PAGE及びクマシー染色 SDS-PAGEで目的タンパク質の500 ngのを実行し、クマシー染色を行う。迅速で便利な染色のためのマイクロ波のプロトコルと組み合わせて、クマシー試薬を使用しています。 HAタンパク質は、一般的に64に表示されますNA蛋白質のに対しkDaの約56 kDaの（ 図8AおよびB）のサイズで実行する必要があります。記載されているプロトコルを使用すると、任意の分解産物は表示されません。劣化が発生した場合は、通常の式の間に酵母/真菌汚染のサインです。この場合の手順を繰り返して、無菌のすべてを維持することを確認してください。 </li><li>ウェスタンブロット/ ELISA タンパク質の同一性を検証するために、我々は、特異的抗体を用いたウェスタンブロットまたはELISAアッセイを行うことをお勧めします。理想的には、ELISAアッセイは、立体配座エピトープに結合する抗体（ 例えば抗HA茎抗体1）を用いて行っている。そのような抗体を用いてタンパク質の正しいフォールディング（ 図8C）を確認することができる。 </li><li>活動NA測定 ウイルスのNAの正確​​なフォールディングはまた、NA活性を測定することによって決定することができる。我々は（単なるユーザガイドラインに従ってください）​​市販のNA * STARのアッセイを使用してこのテストを実行することをお勧めします。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

バキュロウイルス発現系を用いた昆虫細胞におけるインフルエンザウイルスHAおよびNAタンパク質の発現は、一般的に単純であるが、いくつかの考慮すべき重要な点がある。導入部で指摘したようにこれは、HAとNAの細胞外ドメインは、それぞれ、三量体化又は四量体化ドメインとの融合で発現されることが、重要である。これらのドメインは、通常、細胞外ドメインが発現されている場合存?...

中国における新規H7N9インフルエンザウイルス株の最近の出現に対する最初の応答として、赤血球凝集素（HA）およびノイラミニダーゼ（NA）は、最初の2つの分離株の遺伝子についてのゲノム配列を有するプラスミドを買収した。我々はすぐに昆虫細胞における組換えHAおよびNAの生産のためのバキュロウイルス発現ベクターを構築することができたこれらのプラスミドを使用した。この発現系はよく我々の研究室で確立されていると私たちの現在進行中の研究プロジェクト1-8の多くに極めて重要であることが判明した。昆虫細胞は、正しくフォールディングおよび翻訳後のタンパク質複合体を改変することができる。これらの修飾は、多くのウイルス糖タンパク質のために重要であるN-結合型グリコシル化を含む。このように、バキュロウイルス系は、非常にインフルエンザウイルス表面抗原を発現するために確立されていることは驚くべきことではない。実際には、HAおよびNAの結晶構造の多くは、昆虫細胞発現タンパク質9-11を使用して解決されている。の別の利点強力なポリヘドリンプロモーターからのウイルス感染駆動発現の結果 - システムは、（50種類以上のHAタンパク質の経験に基づいて）、HA / Lの細胞培養の最大30ミリグラム、その信頼性の高いタンパク質収量にある。 HAおよびNAタンパク質の膜貫通及びエンドドメインの除去は、タンパク質の分泌、可溶性バージョンの発現を可能にし、大幅精製プロセスを容易にする。さらに、これらの外部ドメインは、ヘキサヒスチジンは、タグ付けされ、したがって、 の Ni 2 + -樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができる。 HAおよびNAタンパク質の膜貫通ドメインは、それぞれ、ホモ三量体およびホモ四量体の形成に寄与する。これらのオリゴマー化を維持するために、我々はNAにHA-およびN-末端四量体化ドメインへのC末端三量体化ドメインを追加する（ 図1）を構築する。私たちは、このような三量体化ドメインは、機能、conseを安定化することを決定的に示しているHAの1の茎ドメインに立体配座エピトープをrved。 NAの正しい四も折り畳みおよびNA機能10を修正するために貢献するかもしれない。三量化や四のドメインを保有する配列と、バキュロトランスファーベクターは、著者からまたはフィールド、9,10,12における他の研究室から要求することができます。 昆虫細胞における分泌タンパク質の発現のためのもう一つの重要な問題は、右の細胞株の選択である。 スポドプテラ·フルギペルダに由来しながら、Sf9細胞は非常によくバキュロウイルス複製を支持し、一般に、ウイルスレスキューおよび増殖のために使用され、それらは、大量のタンパク質を分泌する能力が限られている。 イラクサギンウワバが （一般にハイファイブとして知られている）BTI-TN-5B1-4細胞由来高い分泌能力を有し、このプロトコル13,14における発現のために選択される細胞株である。さらには、ウシ胎児血清を減らしたり、除去しておくと便利です（FB発現培養からのS）。そこで我々は、ウイルスワーキングストックを増殖させるために減少（10％）のFBS含有量のメディアを使用し、我々は、無血清培地におけるタンパク質発現を行う。 組換えHAおよびNAタンパク質は、多くの免疫学的技術のために使用される。おそらく、最も一般的なものは、ヒトまたは動物にワクチン接種時4,6,7,15血清変換を測定するためのELISAアッセイである。有したNAは、抗体分泌細胞を16刺激分子および検出試薬の両方としてELISPOTアッセイにおいて使用される。ベイト分子としてのそれらの使用は、具体的には、次いで（治療的）モノクローナル抗体（mAb）を単離するために使用することができる形質芽又はB-細胞の他のタイプのソートすることを可能にする。組換えHAおよびNA分子はさらに、これらのmAb 8の特徴付けに使用される。他の例では、pH安定性又は受容体特異性が異なるウイルス分離株によって発現有する研究、または定量的に特異的なNAの酵素を評価することが含まれる阻害剤に対する活動や抵抗。さらに、組換え、精製されたHAは、不活性化インフルエンザウイルスワクチンのHA含量を標準化するために使用することができる。 重要なのは、rHAの（そしてある程度NA）ワクチン候補は、現在、1ワクチン候補が2013 2,17-19にFDAによって認可されていると、動物モデルおよびヒト臨床試験で検証されています。これらの新規なワクチンの利点は、これらのタンパク質の組換え性質のために、高い成長再集合ウイルスの発生の労働集約的なプロセスを回避することができる、ということである。おそらく、より関連性の高い彼らのHA収率が高く、歪みの歪みに再現可能であるという事実である。これらのワクチンは、卵を含まない系で生産されるためにも、彼らは卵アレルギーを持つ人々のための問題となるタンパク質の汚染物質を含んでいない。 ここでは、新たな中国のH7N9インフルエンザウイルスは、A /アインの2分離株からのHAおよびNA蛋白質を発現することにしましたui/1/13とA/Shanghai/1/13 20,21。これらは、タイムリーな例であるが、記載されたプロトコルは、任意のインフルエンザA及びB HA又はNAタンパク質の発現のために使用することができ、任意の他の分泌されたウイルスまたは細胞性蛋白質を発現するように適合させることができる。三量体または四量体の膜貫通タンパク質は、それぞれ、HA及びNAために使用される発現カセットにクローニングすることができる。しかし、ほとんど可溶性分泌細胞タンパク質は、例えば、インターフェロンのように、安定化のための追加のドメインを必要としないし、C末端ヘキサヒスチジンタグと共にのみ表現することができる。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus expression system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10359-016</td>
			<td>Follow manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNM-FH insect medium</td>
			<td>Gemini Bioproducts</td>
			<td>600-311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone SFX-Insect</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N58760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000702664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC902024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Columns (5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max efficiency DH10Bac bacteria</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10361-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399-100G</td>
			<td>for elution and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Five cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B85502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of functional recombinant hemagglutinin and neuraminidase proteins from the novel h7n9 influenza virus using the baculovirus expression system

バキュロウイルス発現系は、組換えタンパク質の発現のための強力なツールです。ヘマグルチニン（HA）およびノイラミニダーゼ（NA） - ここでは、インフルエンザの正しく折り畳まれ、グリコシル化されたバージョンのウイルス表面糖タンパク質を産生するために使用すること。一例として、我々は最近、中国に出現した新規H7N9ウイルスにより発現HAおよびNA蛋白質を選びました。しかし、プロトコルが容易に任意の他のインフルエンザA及びBウイルス株によって発現されるHA及びNAタンパク質に適合させることができる。組換えHA（rHAの）とNA（RNA）タンパク質は、ELISPOTおよびELISAなどの免疫学的アッセイのための重要な試薬であり、ワクチンの標準化、抗体の検出、単離および特性のために広く使用されてもいる。さらに、組換えNA分子は、小分子阻害剤のスクリーニングに使用し、NAの酵素機能の特徴付け、ならびに抗ウイルス剤に対する感受性のために有用であることができる。組換えHAタンパク質はまた、バイあるNGは、動物モデルにおける実験ワクチンとしてテストされ、組換えHAに基づくワクチンは、最近、ヒトにおける使用のためのFDAによって認可されました。それは、迅速かつ低コストで大量のタンパク質の産生を可能にするため、我々はこれらの分子を産生するためにここで説明する方法は、単純であり、インフルエンザ実験室での研究を容易にすることができる。ここで我々は、インフルエンザウイルス表面糖タンパク質に焦点を当てているが、この方法はまた、他のウイルスおよび細胞表面タンパク質を産生するために使用することができる。

A/Shanghai/1/13とA/Anhui/1/13からのHA分子は、約20 mg / Lの文化の収量とよく表現。両株のNA分子はA/Shanghai/1/13 0.2 mg / Lの培養物からA/Anhui/1/13 0.7ミリグラム/ Lの範囲の中程度の発現レベルを示した。 4つ全てのタンパク質調製物は、発現レベルによって説明することができるのNAよりも高い純度であると有する（ 図8AおよびB）なしにはほとんど不純物を有していた。 A/Shanghai/1/...

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Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

ここでは、昆虫細胞中での新規な中国のH7N9ウイルス由来の正しく折り畳まれ、機能性インフルエンザウイルス表面抗原を発現する方法を記載している。技術は、任意のウイルスまたは細胞表面タンパク質の外部ドメインを発現するように適合させることができる。

バキュロウイルス発現系を用いた新規H7N9インフルエンザウイルス由来の機能組換えヘマグルチニンとノイラミニダーゼタンパク質の発現

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

expression-functional-recombinant-hemagglutinin-neuraminidase

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.7K ビュー.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. ここでは、昆虫細胞中での新規な中国のH7N9ウイルス由来の正しく折り畳まれ、機能性インフルエンザウイルス表面抗原を発現する方法を記載している。技術は、任意のウイルスまたは細胞表面タンパク質の外部ドメインを発現するように適合させることができる。 

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