我们要感谢帕特里克·威尔逊的单克隆抗体CR9114。我们也感谢詹妮弗Debeauchamp和理查德·威比原A/Anhui/1/13质粒。由国立过敏规定这项工作的部分支持和传染病资助计划项目资助AI097092-01A1和CEIRS（卓越中心的流感研究和监测，HHSN26620070010C）。 FK是由来自奥地利科学基金会（FWF）的薛定谔奖学金（十3232）的支持。

1。重组杆状病毒的一代<ol><li>克隆到杆状病毒转移质粒<ol><li>克隆H7 HA和NA的N9胞外结构域（或任何其他HA或NA基因）插入修饰的pFastBac转移质粒（见介绍）。载体为含有C-末端三聚结构域和六组氨酸标记的HA，以及为NA含N-末端四聚结构域和六组氨酸标记，已经描述1,10,11,22（ 图1），并且可以从被请求的作者。 解释性说明：表示没有三聚化域医管局胞外结构域将被折叠不当，导致构象表位的中和损失，尤其是在茎部区域。同样，NA酶的功能依赖于正确的四聚。 </li><li>杆粒的产生 根据使用杆状病毒表达转换含有HA和NA基因导入DH10Bac感受态细菌杆状病毒转移质粒系统按照生产商的说明。隔离，并且使用按照制造商的说明（ 图2）一个Midiprep试剂盒纯化杆粒。 </li></ol></li><li>重组杆状病毒蛋白表达和验证的救援 解释性说明：下面的步骤必须在层流罩无菌条件下进行。独立执行此过程的HA和NA（或任何其他感兴趣的基因）。昆虫细胞通常生长在28°C，无二氧化碳 。 Sf9细胞对于此协议是生长在补充了10％FBS，1％青霉素-链霉素*和0.1％的Pluronic F68溶液，充分的TNM-FH昆虫细胞培养基，如果没有另外说明，并传代1点04分，每周两次。高五细胞生长在SFX无血清培养基传代1时15每周两次。 *添加抗生素应被视为可选的整个协议，并根据每个实验室中使用的做法调整。 <ol><li>板Sf9昆虫细胞中6孔板在2×10 5细胞/ cm 2的密度和让坐在在28℃培养箱中培养20分钟（不含CO 2）。 </li><li>拌2微克的重组杆状病毒质粒用100μl的TNM-FH培养基（无血清，1％青霉素 - 链霉素）中的（浓度0.5-2微克/微升）。搭配6微升转染试剂与100微升的TNM-FH培养基（无血清，青霉素 - 链霉素）的。结合两卷，轻轻混匀，让坐20分钟，在室温（转染混合物）。包括一个模拟转染对照（ 图3）。 </li><li>从接种Sf9细胞取出上清液（细胞现在坚持自己制版）和替换用2毫升含青霉素 - 链霉素（1％），血清游离TNM-FH培养基中。加入转染混合物的完整的体积（从步骤1.2.2）并轻轻摇动的6孔板中，持续5秒。孵育在28℃培养箱中无CO 2的6小时（ 图3）。 </li><li>更换介质无线个新鲜完整的TNM-FH培养基（含10％FBS，1％青霉素 - 链霉素，0.1％的Pluronic F68）。孵育在28℃培养箱中无CO 2的6天。检查偶见细胞在显微镜下。受感染的细胞通常会出现较大而圆，有细胞核增大，并开始分离（ 图4）。 </li><li>细胞和确认蛋白表达的收获<ol><li>收获细胞后第6天的转染通过离心在2000×g离心5分钟，在室温下进行。上清含有重组杆状病毒 - 这将被用于产生工作股马上，或可以被存储在4℃下多年。 </li><li>要检查蛋白表达收集颗粒重悬在500微升PBS。混合50微升悬浮液与50微升SDS-PAGE上样缓冲液（含有还原剂）。运行SDS-PAGE和用抗-六聚组氨酸抗体进行Western印迹分析来确认基因表达。包括从模拟囚室转染作为阴性对照（ 图3）。 </li></ol></li><li>工作个股的制备<ol><li>板5×10 5 Sf9细胞/厘米2的T175厘米2瓶，让坐20分钟让他们重视的菜。用含3％FBS（和1％青霉素 - 链霉素，0.1％的Pluronic F68）TNM-FH媒体取代完整的TNM-FH媒体。 </li><li>感染细胞用100微升救援上清液。孵育在28℃培养箱中无CO 2的6天，偶尔检查电池是否被感染（如步骤1.2.5中所述）。 </li><li>旋在2000×g离心，在室温下放置5分钟，并收集上清液。这是现在你的P2股票。这个股票可以无限期地在4°C下贮存用100微升的P2股票感染细胞重复感染程序。所得到的股票被称为P3或工作原液，它可以储存在4℃或直接用于蛋白质的表达。 P3的股票通常含有10 &lt;SUP&gt; 7 -10 9菌斑形成单位/毫升。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2。蛋白质表达与纯化 解释性说明：Sf9细胞支持杆状病毒的成长非常好。然而，它们的分泌大量重组蛋白的能力是有限的。因此，我们使用另一种昆虫细胞系，击掌细胞，分泌的重组蛋白质的表达。这些细胞不支持杆状病毒复制到非常高滴度13，但具有较高的分泌能力。 <ol><li>长大后击掌细胞 长高五细胞SFX昆虫细胞培养液中T175厘米2瓶。通道每隔1:3一天。对于200毫升表达培养你将需要增长5汇合烧瓶。 </li><li>采收和感染击掌细胞<ol><li>通过敲击瓶用你的手从分离5 T175厘米2瓶击掌细胞。收集细胞suspension并转移到50ml离心管中。 </li><li>旋在1200×g下在室温下7分钟。用倾析法除去上清液，并通过他们再悬浮于15ml P3股票的团结颗粒。 </li><li>让在流罩坐15分钟（ 图5）。 </li><li>转移200毫升Hyclone公司SFX培养基倒入干净的，无菌千毫升摇瓶中（不含buffles，用高压灭菌前的铝箔密封的，不应该被用于细菌培养物之前）。 </li><li>转移P3/cell悬挂到摇瓶。轴封采用无菌铝箔和转移烧瓶成振动筛。摇在70转，28℃72-96小时。 </li></ol></li><li>从高五细胞表达上清收获重组蛋白<ol><li> 72-96小时后感染转让培养上清液到500ml离心桶。转速为5,500×g离心20分钟，在4°C。在此期间，冲洗摇瓶3倍用双蒸水（双蒸2 O）。 </li><li>转让3毫升镍树脂浆料倒入50毫升的试管用45毫升的PBS（一个需要每200毫升培养）的。摇匀和自旋在3000 XG在室温下10分钟。倒出PBS中，并保持颗粒。混合昆虫细胞上清与镍树脂颗粒，并转移到已经清洗摇瓶。孵育在4℃下2-4小时，同时振荡（ 图6）。 </li><li>上一个支撑架夹子山10毫升聚丙烯列。卸下两个盖子，并把该栏下方的烧杯中通（垃圾）收集流量。就拿摇瓶出振动筛，并开始上清/矿浆混合传输到列，它会保留镍树脂和只取上清液流过。通过整卷在列（ 图7）。 </li><li>用15ml洗涤缓冲液（50mM的Na 2 HCO 3，300 mM氯化钠，20 mM咪唑，pH 8）中洗涤树脂4倍。让所有的洗涤液漏从柱中，并与盖（下侧）将其关闭。 </li><li>加入2毫升洗脱缓冲液（50毫米的Na 2 HCO 3，300 mM氯化钠，300 mM咪唑，pH值8），并让坐5分钟。打开柱，收集洗脱液。重复此3次以上（含总共8毫升洗脱缓冲液）。洗脱液是含有高浓度蛋白质的通常显示时的泡沫振荡（ 图7）。不断洗出液对湿冰只要有可能。 </li></ol></li><li>缓冲液交换和浓度<ol><li>用PBS（pH值7.4-7.6），在3000 XG在4°C下20分钟Prespin15毫升超滤离心装置（视纯化蛋白大小30 kDa的截止用于HA / NA，但可能会有所不同）。丢弃流过负载和洗脱液到离心柱。用5ml无菌的，冰冷的PBS中，并旋为在3000×g离心60分钟，填充在4℃下</li><li>通过再次排出流，填充用15毫升冰冷的PBS及自旋为在3000×g离心60分钟，在4℃下重复此过程杜热一次。 </li><li>取离心柱出来的离心机，并收集交换缓冲液浓缩液（通常为200微升）。这是高度集中的重组蛋白质。冲洗离心柱用400微升无菌冰冷的PBS中并添加到精矿。保持该浓缩物在冰上在任何时候。 </li></ol></li></ol> 3。表征和质量控制<ol><li>测量蛋白质浓度 取浓缩液等分并使用你选择的蛋白质定量方法测量。通过加入PBS中设置的蛋白质浓度至1毫克/毫升，冷冻小等分试样至-80℃。冻融循环损害的蛋白质结构，并可能导致聚集。 </li><li> SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色 运行500纳克的蛋白在SDS-PAGE和进行考马斯染色。快速和方便的染色使用考马斯亮蓝试剂结合微波协议。 HA蛋白通常出现在64kDa的，而NA蛋白应该运行在大约56 kDa的（ 图8A和B）的大小。使用所描述的协议，你应该不会看到任何降解产物。如果发生退化，通常表现在酵母/真菌污染的迹象。在这种情况下重复上述步骤，并确保保留一切无菌。 </li><li> Western blot检测/酶联免疫吸附 为了验证蛋白质身份，我们建议做Western印迹或ELISA测定与特定的抗体。理想情况下，酶联免疫吸附测定法是用其结合构象表位（ 例如，抗-HA抗体秆1）的抗体进行的。使用这样的抗体的蛋白质的正确折叠，可以证实（ 图8C）。 </li><li>测量NA活动 病毒NA的正确折叠，也可以通过测量NA活性的测定。我们建议您使用市售NA * STAR试验（只需按照用户指南）来执行此测试。 </li></ol>

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作者什么都没有透露。

虽然使用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中流感病毒HA和NA蛋白的表达通常是直接的，也有考虑几个重要的点。这一点很重要，因为在引进指出的，HA和NA的胞外结构域是，表达的融合与三聚或四聚域分别。这些结构域确保通常由跨膜结构域，这是不存在，如果只有胞外结构域被表达辅助分子的正确折叠。例如，在HA胞外域的无三聚化域的表达导致低聚和在茎结构域1的重要的中和表位的不稳定...

至于新型H7N9流感病毒株在中国最近出现的第一个反应，我们收购的质粒携带的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的前两个菌株的基因组序列。用这些质粒，我们能够在昆虫细胞中快速构建杆状病毒表达载体生产重组HA和NA的。该表达系统是公认的在我们的实验室，并已被证明举足轻重的我们很多正在进行的研究项目1-8。昆虫细胞能够正确折叠和翻译后修饰的蛋白质复合物。这些修饰包括N-连接的糖基化，这对许多病毒糖蛋白重要。因此，它是不足为奇的杆状病毒系统是相当既定用于表达流感病毒的表面抗原。事实上，许多的HA和NA的晶体结构已被使用昆虫细胞表达的蛋白9-11解决。的另一个优点系统掌握在HA / L的细胞培养（基于我们有超过50个不同的HA蛋白的经验）高达30毫克其可靠的高蛋白质产量 - 病毒感染驱动的表达从强多角体蛋白启动子的结果。 除去HA和NA蛋白的跨膜和endodomain的允许蛋白质分泌的，水溶性的版本的表达，从而极大地方便了纯化过程。此外，这些胞外结构域是六聚组氨酸标签，因此可以利用亲和层析纯化，用Ni 2 +的树脂进行纯化。 HA和NA蛋白的跨膜结构域有助于同源三聚体和同源四聚体的形成，分别。为了保存这些低聚，我们添加了一个C-端结构域三聚到HA-和N-端四聚功能域的NA构造（ 图1）。我们已经表明得出结论说，这样的三聚化域稳定功能，形成机制RVED医管局1的秆域的构象表位。对NA的正确四聚也可能有助于正确折叠和NA功能10。序列和杆状病毒转移载体窝藏三聚或四聚域可以从作者或在外地，9,10,12其他实验室要求。 对于分泌蛋白在昆虫细胞中表达的另一个重要问题是正确的细胞系的选择。虽然草地夜蛾源性Sf9细胞支持杆状病毒复制非常好，一般用于病毒拯救和繁殖，他们只有有限的容量分泌大量蛋白质。 粉纹夜蛾 BTI衍生-TN-5B1-4细胞（俗称高五）有较高的分泌能力而且是表达所选择的在本协议13,14的细胞系。此外，它是有用的，以减少或什至除去胎牛血清（FB从表达培养S）。因此，我们利用媒体与减少（3％）胎牛血清含量为越来越多的病毒工作的股票，我们在无血清培养基中进行表达。 重组HA和NA蛋白可用于许多免疫学技术。也许是最常见的一种是在酶联免疫吸附测定法用于在接种测定血清转换在人类或动物4,6,7,15。具有和NAS还用在ELISPOT分析既刺激分子和检测试剂为抗体分泌细胞16。它们作为分子毒饵使用允许具体排序为浆母或其他类型的B细胞，然后可以用来隔离（治疗）的单克隆抗体（mAb）。重组HA和NA分子被进一步用于这些单克隆抗体8的表征。其他的例子包括研究pH稳定性都有所不同病毒株明示或受体特异性，或定量评估特定酶NA活性或抗抑制剂。此外，重组的，纯化的HA可用于标准化的灭活流感病毒疫苗的HA含量。 重要的是，的rHA（并在一定程度上不适用）候选疫苗目前正在在动物模型和人体临床试验，其中一个候选疫苗正在2013年2,17-19许可被FDA测试。这些新颖的疫苗的优点是，由于这些蛋白质的重组体的性质，可避免产生的高生长重配病毒的劳动密集的过程。也许更加重要的是，他们的HA产量高，重复性好从应变应变。此外，因为这些疫苗都产的蛋的无系统，它们不含有蛋白质污染物，是有问题的鸡蛋过敏的个体。 在这里，我们选择了从小说中国H7N9流感病毒，A /映的两个菌株表达的HA和NA蛋白ui/1/13和A/Shanghai/1/13 20,21。这些是及时的例子，但是所描述的协议，可用于任何流感A和B的HA或NA蛋白的表达，并且可以适合于表达的任何其他分泌的病毒或细胞蛋白。三聚或四跨膜蛋白可以分别克隆到用于HA和NA的表达盒。然而，大多数可溶性分泌细胞蛋白，如干扰素例如，不需要为稳定一个额外的域，并且可以完全表达与C-末端六组氨酸标签。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus expression system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10359-016</td>
			<td>Follow manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNM-FH insect medium</td>
			<td>Gemini Bioproducts</td>
			<td>600-311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone SFX-Insect</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N58760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000702664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC902024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Columns (5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max efficiency DH10Bac bacteria</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10361-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399-100G</td>
			<td>for elution and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Five cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B85502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of functional recombinant hemagglutinin and neuraminidase proteins from the novel h7n9 influenza virus using the baculovirus expression system

杆状病毒表达系统是一种强大的工具，用于重组蛋白的表达。在这里，我们用它来产生流感的正确折叠和糖基化版本的病毒表面糖蛋白 - 血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。作为一个例子，我们选择了新的H7N9病毒，最近出现在中国所表达的HA和NA蛋白。然而，该协议可以很容易地适应任何其他甲型和乙型流感病毒株表达HA和NA蛋白。重组HA（的rHA）和NA（RNA）的蛋白质是免疫学测定法，例如酶联免疫斑点法和ELISA法重要的试剂，并且还广泛使用的疫苗标准化，抗体筛选，分离和表征。此外，重组NA分子可以用于筛选的小分子抑制剂，并用于表征与NA的酶的功能，以及其对抗病毒药物的敏感性是有用的。重组HA蛋白也蓓NG测试作为试验性疫苗在动物模型，并根据重组HA疫苗最近被FDA批准用于人体。我们在这里描述，以产生这些分子的方法是直线前进，并且可以在流感实验室研究方便，因为它允许产生大量的蛋白快速和低成本的。虽然这里我们专注于流感病毒表面糖蛋白，这种方法也可以用于生产其它病毒和细胞表面蛋白。

从A/Shanghai/1/13和A/Anhui/1/13 HA分子的表达以及与约20 mg / L的文化的产量。这两个菌株的NA分子呈中度表达水平，从0.2 A/Shanghai/1/13 mg / L的文化到0.7毫克/升A/Anhui/1/13。所有四种蛋白质制剂有很少到没有杂质（ 图8A和B）与已被纯度高于港人士可通过表达水平来解释。 A/Shanghai/1/13 HA用ELISA法与广谱中和茎-反应性人体单克隆抗体CR9114 23进一步分析。该mAb结合的茎部区域敏感...

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Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

在这里，我们描述来表达在昆虫细胞来源于小说中国H7N9病毒的正确折叠和功能的流感病毒表面抗原的方法。该技术可适于表达任何病毒或细胞表面蛋白的胞外结构域。

从新型H7N9流感病毒利用杆状病毒表达系统的功能重组血凝素和神经氨酸酶蛋白的表达

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

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JoVE Journal

Immunology and Infection

23.7K 次观看.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. 在这里，我们描述来表达在昆虫细胞来源于小说中国H7N9病毒的正确折叠和功能的流感病毒表面抗原的方法。该技术可适于表达任何病毒或细胞表面蛋白的胞外结构域。 

视频: Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System