ברצוננו להודות לכל חברי המעבדה מקמהון לסיוע והתמיכה שלהם. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מR01 CA176839-01 NIH / NCI (לMM) ופרס מחקר מוסדי ואקדמי לפיתוח קריירה (IRACDA לJS).

1. הכנת lysates תא השלם מתרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מנות תרבית תאים על קרח ולהוסיף PBS הקר עם 5 מ&quot;מ EDTA (לדוגמא 5 מיליליטר של PBS עם 5 מ&quot;מ צלחת EDTA/10 2 סנטימטר). הסרת תאים חסיד מהצלחת באמצעות מגרד תא ולאחר מכן להעביר את ההשעיה תא צינור חרוטי 15 מיליליטר קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה השעיות התא על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה על 1,000 סל&quot;ד (230 XG) במשך 5 דקות ב 4 ° C. הנח צינורות חרוטי על קרח ולשאוב supernatant בזהירות מבלי להפריע לגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר של PBS עם 5 מ&quot;מ EDTA ולהעביר את השעיה תא צינור צנטריפוגות קר 1.5 מיליליטר. השעיה מהירה ספין על 13,000 סל&quot;ד (13,226 XG) במשך 10 שניות עד גלולה תאים. מוציא בזהירות את supernatant מבלי להפריע גלולה צינורות ומניחים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור ב25-200 μl (תלוי בגודל גלולה, כלומר עבור 3 x 10 6 תאים להוסיף ~ 150 μl של חיץ ריפה) בחיץ ריפה (50 מ&quot;מ טריס, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 10 מ&quot;מ NAF, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate נתרן, 1% NP-40) המכיל פרוטאז הוסיף טרי ומעכבי phosphatase בריכוז סופי 2x. בקצרה מערבולת צינור כל דגירה השעיה של 20-30 דקות על קרח. הערה: יש כמה מאגרי תמוגה שיכול לשמש כדי לחלץ חלבונים, אשר נבדלים ביכולתם solubilize חלבונים וחוזק של חומר ניקוי denaturing (כלומר, SDS, טריטון X-100, או NP-40). חיץ ריפה הוא שימושי להכנת lysates תא כולו ושיבוש אינטראקציות בין חלבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור שבריר פוסט גרעיני, lysates צנטריפוגות ב 14,000 סל&quot;ד (15,339 XG) במשך 5 דקות ב 4 ° C. מעביר את supernatant לצינור חדש מבלי לשבש את צינורות גלולה ומקום מועשרים הגרעיניות על קרח. הערה: גלולה מועשרת הגרעינית יכולה גם להתנתק מהצינור בזמן חילוץ supernatant. כדי להימנע מאיסוף גלולה מועשר הגרעינית, הנח את קצה פיפטה ישירות in כדי גלולה מועשרת הגרעינית צמיגה ולצייר אותו עם פיפטה כדי להיפטר ממנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את ריכוז החלבון של כל דגימה על פי הוראות היצרן באמצעות מבחני כימות חלבון כגון BCA או ברדפורד. </li></ol> 2. לדוגמא הכנה ואלקטרופורזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל דגימה על פי הטבלה הבאה המפורטת להלן. כחלופה, β-mercaptoethanol יכול לשמש גם בריכוז סופי של .2.5%. עם זאת, סוכן צמצום יש להוסיף לכל דגימה של עד שעה לפני טעינת ג&#39;ל. חשבונות הנפח הכולל עבור וריאציות pipetting עם רק 20 μl של כל דגימה שהוכנה עמוסים בכל טוב. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> מדגם מופחת </td></tr><tr><td> לדוגמא חלבון </td><td> X μl </td></tr><tr><td> חיץ מדגם 4x LDS </td><td> 6 μl </td></tr><tr><td> 500 ננומטר DTT אדוםucing סוכן </td><td> 2.4 μl </td></tr><tr><td> מים Deionized </td><td> עד 15.6 μl </td></tr><tr><td> נפח כולל </td><td> 24 μl </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מחמם על C ° 70 10 דקות. בעוד דגימות חימום, להכין 1,000 מיליליטר של MES או מגבים 1x חיץ ריצה (50 MES מיליליטר 20x או מגבים הפעלת מאגר בתוספת 950 מיליליטר מים deionized). מגבים ריצת חיץ פותר חלבונים בגודל בינוני בין 14-200 kDa, ואילו MES הפעלת מאגר פותר חלבוני משקל מולקולריים קטנים יותר בין 2-200 kDa עם pKa נמוך יותר, המאפשר MES הפעלת מאגר לרוץ מהר יותר מהמגבים 4. לפיכך, שני מאגרים אלה מנוגדים השפעות על ההגירה של יונים בתוך הג&#39;ל לערום שמוביל להבדלים בהפרדה של להקות חלבון 4. מניח בצד ולשלב 200 מיליליטר של MES 1x או מגבים הפעלת מאגר עם 500 μl של נוגדי חמצון, אשר ישמש למילוי העליון הצפת לשכת המינימליתיחידת אלקטרופורזה i-Cell. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגימות סיימו חימום, דגימות סיבוב מהירות לפני ששם אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכבה של ג&#39;לי Bis-טריס טרומי ליחידת המיני הנייד אלקטרופורזה לעקוב אחר ההוראות של היצרן. הערה: ודא שכל ג&#39;ל מכוון בצורה כזאת שהקלטת קצרה יותר (קטנה יותר) של כל ג&#39;ל פונה פנימה לכיוון ליבת הצפת וג&#39;לים הם ברמה ולחץ בחוזקה נגד Core המאגר כדי למנוע דליפה מהמאגר העליונה הקאמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא עליון הצפת קאמרית עם 200 מיליליטר של MES או מגבים הפעלת מאגר המכיל נוגדי חמצון והתחתון הצפת לשכת יחידת המיני הנייד עם כ 600 מיליליטר של MES או מגבים הפעלת מאגר 1x 1x. 200-300 מיליליטר הנוסף של הפעלת מאגר ניתן לשמור לשימוש מאוחר יותר. עם זאת, היא אינה מומלצת למחזר החיץ בשימוש בזמן ריצת אלקטרופורזה כpH והאיכות של המאגר עלול להיות שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 20 μl של כל SAMP חלבוןle לכל אחד. אם חתך את הקרום לרצועות שונות על מנת לחקור לנוגדנים מרובים (כלומר יותר מ -2), מומלץ מאוד לטעון 2-5 μl של תקן חלבון prestained בבארות הראשונות והאחרונה של כל ג&#39;ל שזה ישמש חיתוך מדריכים להפרדת החלקים השונים של הקרום מבלי להשפיע על ההדמיה של להקות החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;לים לרוץ ב200 V קבוע לדקות 35 עם נוכחית צפוי של 110-125 mA / ג&#39;ל בתחילת ו70-80 mA לג&#39;ל בסוף. אלקטרופורזה תושלם כאשר צבע המעקב נודד לחוט הפלטינה לאורך Core הצפת. </li></ol> 3. העברת חלבונים באמצעות מערכת סופג iBlot יבש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפרד לחלוטין מיני ג&#39;לים על ידי שבירת הצדדים ערובה של הקלטת (עשוי לייצר רעש פצפוצים). מחק את הצלחת קצרה יותר (קטנה יותר) ולהעביר בזהירות את הג&#39;ל מהצלחת ארוכה יותר (מחוררת) לתוך מיכל עם מים deionized ולהסיר את החלק עבה רגל של הג&#39;ל הממוקם בתחתית. הערה: במקרים נדירים, ג&#39;ל עשוי לצרף לצלחת קצרה יותר במקום זמן רב יותר, מחוררת צלחת. במקרה זה, לבטל את הצלחת ארוכה יותר, מחוררת ולהסיר את החלק עבה רגל של הג&#39;ל הממוקם בתחתית. ואז, בזהירות להעביר את הג&#39;ל מהצלחת הקצרה למים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את ערימות העברת האנודה וקתודה בהתאם להוראות היצרן. הערה: קרומי שני ניטרוצלולוזה או PVDF לספק העברה באיכות גבוהה ויעילה של חלבונים והם תואמים עם זיהוי ניאון 8. עם זאת, קרום PVDF אכן יש קיבולת גבוהה יותר מחייבת (240 מיקרוגרם / 3 סנטימטר) מאשר ניטרוצלולוזה (200 מיקרוגרם / סנטימטר 3) 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את כל בועות אוויר שנלכד בין או ג&#39;ל והקרום זה ימנעו כל עיוות של להקות החלבון במהלך ההעברה. שים לב: לא לקצץ את הקרום או transfאה מחסנית כדי שיתאים לגודל ג&#39;ל שלך כמו זה יגרום למגע ישיר בין ערימות האנודה וקתודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרכבת כראוי ערימות ההעברה במכשיר הסופג היבש, בחר את התכנית המתאימה מתח (כלומר תכנית 3: 20 V עבור 7 דקות) ותתחיל את ההעברה. הערה: חלבונים גדולים מ 150 kDa נוטים להגר יותר לאט ועשויים לדרוש זמן העברה ארוך יותר של 8-10 דקות. בנוסף, דגירה מוקדמת של ג&#39;ל באתנול 20% עבור 5-10 דק גם תעזור לשפר את יעילות ההעברה של חלבונים הגדולים אלה. לאחר תכנית ההעברה הושלמה, המכשיר יכבה באופן אוטומטי הנוכחי. עדיף להסיר באופן מיידי את הקרום ולהמשיך בהליך החסימה כדי להבטיח זיהוי חלבון טוב יותר ולהימנע מהתייבשות הקרום. </li></ol> 4. איתור חלבון פלואורסצנטי אינפרא אדום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום בלוק (ים) במינימום של 0.8 מיליליטר / 2 סנטימטר של אודיסיאה חיץ חסימה (אלתוסיף 20-Tween) במשך שעה או 1הלילה בשעה 4 ° C. קרום (ים) גם יכול להיחסם עם חלב יבש ללא שומן, אולם זה עלול לגרום רקע גבוה יותר ולהפריע לגילוי חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קרום (ים) בנוגדן ראשוני בריכוז הרצוי באודיסיאה חסימת הצפת עם Tween-20 0.1% הלילה בשעה 4 ° C. לזיהוי בשני צבעים, שבו שני אנטיגנים שונים הם דמיינו באותו הכתם, שני הנוגדנים עיקריים חייבים להיות נגזרים ממינים מארח שונים והוסיפו בו זמנית על הקרום (ים). הערה: לפני דוגרים הקרום (ים) בנוגדן ראשוני, הקרום (ים) יכול להיות מחולק לחתיכות שונות על מנת לחקור לנוגדנים מרובים (כלומר יותר מ -2) על אותו הקרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x קרום (ים) עבור 10 דקות בכפות תוספת Tween-20 0.1% עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קרום (ים) עם הנוגדנים משני שכותרתו fluorescently בדילול של 1:20,000 עבור הערוץ 700 ננומטר ו1:6,000-1:10,000 לערוץ 800 ננומטר בOdyssey חסימת הצפת עם Tween-20 0.1% עבור 30-60 דקות (דוגרים קרום (ים) במשך שעה ארוכה יותר מ1 עשוי להגדיל ברקע). הגן על קרום (ים) מהאור. הערה: הנוגדנים משני צריכים להיות נגזרים מאותו המין המארח כמו כל אחד מהנוגדנים הראשוניים ומסומן עם fluorophores שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x קרום (ים) עבור 10 דקות בכפות תוספת Tween-20 0.1% עם רעד עדין. הגן על קרום (ים) מהאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום (ים) עשוי להיות מיובש או מאוחסן בשתי כפות או PBS ללא Tween-20 על 4 מעלות צלזיוס עד סרקו וצלם עם מערכת הדמיה אינפרא אדום. אות ניאון תישאר יציבה במשך כמה חודשים אם מוגנת כראוי מפני האור. </li></ol>

<ol>
	<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+incubation+of+solutions+of+proteins+containing+dodecyl+sulfate+on+the+cleavage+of+peptide+bonds+by+boiling.">Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling.</a> Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).</li><li>Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yield+sequencing+of+proteins+electrophoretically+separated+and+transferred+to+an+inert+support.">Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support.</a> J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iBlot+Dry+Blotting+System.">iBlot Dry Blotting System.</a> Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blot+Analysis.">Western Blot Analysis.</a> LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odyssey+Infrared+Imaging+System+Application+Software+Version+3.030.">Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030.</a> LI-COR Biosciences. , (2007).</li><li>Hambaeus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Milk+Composition.">Human Milk Composition.</a> Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).</li><li>DenHollander, N., Befus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+antigens+from+immunoblotting+membranes.">Loss of antigens from immunoblotting membranes.</a> J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

השלבים הקריטיים ביצירה באיכות גבוהה, כתמים מערביים כמותיים על פי פרוטוקול זה את הדברים הבאים: 1) מדידת ריכוזי חלבון, 2) הכנת מדגם; 3) חוסמים את הקרום ו; 4) איכות ורמה של הנוגדן הראשוני. הדיוק של מדידה הכולל ריכוזי חלבון יכול להיות השפע?...

<html> הטכניקה של מערבי סופג פותחה לראשונה בין 1977 ו -1979 כדי ליצור שיטה טובה יותר לאיתור חלבונים באמצעות נוגדני 1-3. הליך זה מנוצל העברת electrophoretic של חלבונים לממברנות מג&#39;לי-SDS עם חלבוני היעד דמיינו באמצעות נוגדנים משני וזוהו על ידי autoradiography, אור UV, או מוצר תגובת peroxidase 3. לכן, אותם עקרונות בסיסיים אלה עדיין בשימוש נרחב בפרוטוקולי הכתם המערביים של היום. עם זאת, הטכניקה המערבית סופג הקלאסית הזה עושה חסרונות רבים בהווה, כגון פעמים איטיות ריצת אלקטרופורזה, ברזולוציה נמוכה ולהקות חלבון מלאכותיות, את רגישות לפירוק חלבונים, ורגישות מוגבלת, כמו גם איכות נתונים ירודה 4. לכן, פרוטוקול זה מתאר התקדמות ושיפורים משמעותיות להליך הכתם המערבי הסטנדרטי שמייצר נתונים איכותיים וכמותיים מדויקים יותר. &quot;&gt; מערכת Laemmli להפרדת מגוון רחב של חלבונים באמצעות SDS-PAGE היא מערכת ג&#39;ל הנפוצה ביותר למערבי סופג 5. למרות הפופולריות של מערכת מערבית סופג את זה, שיטה זו יכולה לגרום לעיוות להקה, אובדן של רזולוציה, ו להקות מזויפות 4. זה עשויה להיות תוצאה של deamination ואלקילציה של חלבונים בשל pH הגבוה (9.5) של ג&#39;ל המפריד, reoxidation של אגרות חוב מופחתים דיסולפיד בשל מצב חיזור השונים של ג&#39;ל, ומחשוף של aspartyl-prolyl איגרות חוב בשל חימום החלבון במאגר Laemmli (pH 5.2) 4,6 פפטיד. מערכת ג&#39;ל Bis-טריס, הפועלת ב-pH ניטראלי (7.0), מספקת יתרונות משמעותיים על פני מערכת Lamemmli. מערכת זו משפרת את יציבות חלבון, ממזערת שינויי חלבון, שומר על חלבונים במדינות מופחתות שלהם, מונעים מחשוף aspartyl-prolyl במהלך אלקטרופורזה, ויותר חשוב מכך, בפעם אלקטרופורזה להפעיל היא 35 4,6,7 דקות. בנוסף, לאמערכת ג&#39;ל הוא Bis-טריס גם מייצרת להקות חדות יותר, רזולוציה והפרדה גבוהות יותר, ורגישות מוגברת וכתוצאה מכך הנתונים אמינים יותר 4. בשיתוף עם מערכת הג&#39;ל Bis-טריס, המערכת הסופג היבשה iBlot משתמשת בעוצמת שדה גבוהה וזרמים כדי להפחית באופן משמעותי את זמן ההעברה של חלבונים מן ג&#39;לים על גבי קרומים תוך 7 דקות 8. מערכת העברה זו מבוססת על השיטה הסופג היבשה שיוצרת העברה יותר יעילה ואמינה של חלבונים 8. להשוואה מפורטת של היעילות של מערכת העברת iBlot למערכות העברה הקונבנציונלית עיינו באתר האינטרנט הבא: <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html">http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Application</a>s/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . הוא מנצל ערימת האנודה וקתודה, אשר מורכבות ממטריצת ג&#39;ל המכילה מאגרי ההעברה המתאימים, המשמשים כמאגרי יון 8. במהלך ההעברה, אלקטרוליזה של מים מסייעת במניעת הדור של חמצן מן האנודה הנחושת וכתוצאה מכך העברת חלבון עקבית יותר מבלי לגרום לעיוות להקת 8. יתר על כן, מערכת העברה זו גם מגדילה את מהירות העברה על ידי צמצום המרחק בין האלקטרודות 8. למרות chemiluminescence היא הטכניקה הנפוצה והמסורתית ביותר לגילוי חלבון של כתם המערבי מנתח, גילוי ניאון אינפרא אדום בשני צבעים משפר באופן משמעותי את הרגישות, איכות ודיוק נתוני כתם המערביים. שיטת זיהוי זה משתמשת בעירור לייזר אינפרא אדום בשני אורכי גל אופטימליים, 700 ננומטרו800 ננומטר, כדי ליצור תמונת נתונים ברורה עם היחס הגדול ביותר אות לרעש והרגישות הגבוהה ביותר 9. לפיכך, ניתן דמיינו שני חלבוני היעד בו זמנית על אותו הקרום באמצעות ננומטר 700 ו800 ערוצי גילוי ניאון ננומטר. וחשוב יותר, את הליניאריות והטווח דינמי של הקרינה אינפרא אדום מאפשר ניתוח כמות מדויק של להקות חלבון גם חזקות וגם חלשות 9. יתר על כן, פרוטוקול זה מספק יתרונות ושיפורים עצומים על פני הטכניקה מערבית סופג הקלאסית על ידי הפחתת אלקטרופורזה וזמני העברה של ניסוי זה מבלי להתפשר על היעילות של תהליכים אלה וניצול זיהוי חלבון פלואורסצנטי אינפרא אדום כדי לייצר נתונים כתם גדולים יותר איכותיים וכמותית מערביים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="624">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:297px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:204px;">Thermo Scientific/Pierce</td>
			<td style="width:123px;">23225</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">4x NuPAGE&#174; LDS Sample Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">10x NuPAGE&#174; Sample Reducing Agent&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0004</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0002</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MOPS SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NuPAGE&#174; Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0005</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0335BOX</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0336BOX</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SeeBlue&#174; Plus2 Pre-Stained Standard&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">XCell SureLock&#174; Mini-Cell&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, PVDF Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, Nitrocellulose Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, Nitrocellulose Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Gel Transfer Device&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB1001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-Actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2228</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-BIM (S69)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total BIM</td>
			<td>Epitomics</td>
			<td>1036-1</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total ERK1/2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9107</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Blocking Buffer&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-40000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-32211&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68020&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Western Incubation Box, Medium&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>929-97205&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Classic Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Application Software V3.0.30</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis

טכניקות הכתם המערביות שהוקמו במקור בסוף 1970s עדיין מנוצלים באופן פעיל היום. עם זאת, יש שיטה מסורתית זו מערבית סופג כמה חסרונות הכוללים ברזולוציה נמוכה איכות, להקות מזויפות, ירידה ברגישות, וביושר חלבון עני. ההתקדמות שחלה באחרונה השתפרה באופן דרסטי היבטים רבים של פרוטוקול הכתם המערבי הסטנדרטי כדי לייצר מידע איכותי וכמות גבוהה יותר. מערכת ג&#39;ל Bis-טריס, אלטרנטיבה למערכת Laemmli הקונבנציונלית, יוצרת הפרדת חלבון טובה יותר ורזולוציה, שומרת על שלמות חלבון, ומפחיתה אלקטרופורזה לזמן ריצת 35 דקות. יתר על כן, המערכת הסופג היבשה iBlot, משפרת באופן דרמטי את היעילות ומהירות של העברת חלבון על הקרום ב -7 דקות, שזה בניגוד לשיטות העברת חלבון המסורתיות, כי הם לעתים קרובות יעילים יותר עם זמני העברה ארוכים. בשילוב עם שינויים מאוד חדשניים אלה, ד החלבוןetection באמצעות תוצאות הדמיה ניאון אינפרא אדום באיכות גבוהה יותר, מדויקים יותר ונתונים עקביים בהשוואה לטכניקה המערבית סופג סטנדרטית של chemiluminescence. טכנולוגיה זו יכולה בו זמנית לזהות שני אנטיגנים שונים על אותו הקרום על ידי ניצול צבעים קרוב אינפרא אדום בשני צבעים שהם דמיינו בערוצי ניאון שונים. יתר על כן, את הליניאריות והטווח דינמי רחב של דימות פלואורסצנטי מאפשר לכימות המדויק של להקות חלבון גם חזקות וגם חלשות. לפיכך, פרוטוקול זה מתאר את שיפורי מפתח לשיטה הקלאסית המערבית סופג, שבו הפיתוחים האלה להגדיל באופן משמעותי את איכות הנתונים, תוך צמצום זמן ביצוע ניסוי זה באופן משמעותי.

הקרינה אינפרא אדום בשני צבעים מזהה להקות גם חזקות וגם חלשות באותו קרום עם רגישות משופרת ויחס אות לרעש הגבוה ביותר כדי להפיק תמונות כתם מערביות ברורות. תוצאות אופייניות שנוצרו על ידי זיהוי כתם המערבי שני צבעים דמיינו בשני ננומטר 700 ו800 ערוצי ניאון ננומטר מודגמות ב...

Watch this Scientific Journal Video about The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis at JoVE.com

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

פרוטוקול זה בוחן את הפיתוחים האחרונים בביצוע ניתוחי כתם מערבי. שינויים אלה רומן להעסיק מערכת ג&#39;ל Bis-טריס עם אלקטרופורזה לרוץ זמן 35 דקות, מערכת העברה הסופג יבשה 7 דק &#39;, וזיהוי אינפרא אדום חלבון פלואורסצנטי והדמיה שיוצר ברזולוציה גבוהה יותר, איכות, רגישות ודיוק משופר של נתונים מערביים.

המהיר ביותר במערב בעיר: טוויסט עכשווי על ניתוח הקלאסי הכתם המערבי

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

the-fastest-western-town-contemporary-twist-on-classic-western-blot

Research

JoVE Journal

Biology

26.9K Views.  University of California, San Francisco.  פרוטוקול זה בוחן את הפיתוחים האחרונים בביצוע ניתוחי כתם מערבי. שינויים אלה רומן להעסיק מערכת ג'ל Bis-טריס עם אלקטרופורזה לרוץ זמן 35 דקות, מערכת העברה הסופג יבשה 7 דק ', וזיהוי אינפרא אדום חלבון פלואורסצנטי והדמיה שיוצר ברזולוציה גבוהה יות...

Video: The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal model of the condition and an important correlate for human Meniere's disease. In 1965, Robert Kimura and Harold Schuknecht first described an intradural approach for obstruction of the endolymphatic duct (Kimura 1965). Although effective, this technique, which requires penetration of the brain's protective covering, incurred an undesirable level of morbidity and mortality in the animal subjects. Consequently, Andrews and Bohmer developed an extradural approach, which predictably produces fewer of the complications associated with central nervous system (CNS) penetration.(Andrews and Bohmer 1989) 
The extradural approach described here first requires a midline incision in the region of the occiput to expose the underlying muscular layer. We operate only on the right side. After appropriate retraction of the overlying tissue, a horizontal incision is made into the musculature of the right occiput to expose the right temporo-occipital suture line. The bone immediately inferio-lateral the suture line (Fig 1) is then drilled with an otologic drill until the sigmoid sinus becomes visible. Medial retraction of the sigmoid sinus reveals the operculum of the endolymphatic duct, which houses the endolymphatic sac. Drilling medial to the operculum into the area of the endolymphatic sac reveals the endolymphatic duct, which is then packed with bone wax to produce obstruction and ultimately ELH. 
In the following weeks, the animal will demonstrate the progressive, fluctuating hearing loss and histologic evidence of ELH.

This video shows how to surgically obstruct the guinea pig's endolymphatic duct to produce endolymphatic hydrops.

אינדוקציה כירורגי של Hydrops Endolymphatic על ידי מחיקה של צינור Endolymphatic

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

התמיינות של תאי העור של עכבר יילוד נגזר גזע לתאים דמוי נבט<em&gt; במבחנה</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

טרנספורמציה הפרחוני-Dip של פשתן (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) כדי ליצור progenies טרנסגניים עם שיעור שינוי גבוה

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

שיטה להערכת ההשפעות של טווח של אורכי גל ועוצמות של אדום / טיפול באור האינפרה-אדום קרוב בסטרס חמצוני<em&gt; במבחנה</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

הדמיה הסחר תאיים של APP עם GFP Photoactivatable

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...