מחקר במעבדה נתמכה על ידי מענקים מ( DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) והמשרד הפדרלי לחינוך ולמחקר (BMBF) Genomics זיהום רפואי (FKZ 0315828A) לSH.

הניסויים בבעלי החיים הזיהום המתוארים כאן יש לבצע בהתאם קפדן עם (למשל חוק הבריאות האירופית של הפדרציה של מדעי מעבדה עמותות בעלי חיים (FELASA)) המקומי ובינלאומי הנחיות ותקנות לשימושם של בעלי חיים בעלי חוליות. הניסויים צריכים להיות מאושרים על ידי ועדת האתיקה המקומית והוועדה טיפול בבעלי חיים מוסדית. כל הניסויים עם ס &#39; דלקת ריאות במעבדה או בזיהומים בבעלי החיים מתבצעות בClass II בטיחות ביולוגית קבינט. 1. הכנת מלאי זיהומיות של Bioluminescent Pneumocococi <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרבויות pneumococcal המניה במרק טוד יואיט בתוספת 1% (w / v) תמצית שמרים וריכוז סופי של גליצרול 20% לתחזוקה ב80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת כמות קטנה של תרבות pneumococcal המניה בהקפאה עמוקה על צלחת אגר דם ודגירת החיידקים ל10 שעות ב 37 ° C ב 5% CO 2. Tהוא צלחת אגר הדם מכילה אנטיביוטיקה המתאימה כגון kanamycin (150 מיקרוגרם / מיליליטר) להחדרת transposon של קלטת גן luxABCDE לתוך הגנום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת לטפח מושבה טרי על צלחת אגר דם חדש לתקופה מקסימלית של 10 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן הבינוני THY תוספת 10% (v / v) חום מומת (30 דקות ב 56 מעלות צלזיוס) בסרום שור העובר (FBS) עם pneumococci ולהתחיל התרבות בOD 600 של 0.05-.07. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה pneumococci ללא תסיסה ב37 ° C ו 5% CO 2 עד התרבות מגיעה OD של 600 .35-.40. צמיחה תיקח בין 3-4 HR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pneumococci קציר על ידי צנטריפוגה ב3,750 XG עבור 10 דקות ו resuspend pneumococci bioluminescent בpH שנאגרו מלוח פוספט 7.4 (PBS) בתוספת FBS 0.5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הבידוד לריכוז הרצוי בFBS PBS/10%. מינון הזיהום תלוי בזן pneumococcal משמש והרקע הגנטי של המיקרופוןדואר. כדי להדביק עכברי CD-1 outbred intranasally עם ס &#39; pneumoniae D39 LUX מינון הזיהום צריך להיות מותאם ל1 x 10 7 CFU בהשעיה של 20 μl בתוספת hyaluronidase 90 יחידות. אין לנער או pneumococci מערבולת, שכן זה יפעיל autolysis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ריכוז הבידוד על ידי ציפוי 10 דילולים סדרתי של פי על אגר דם וספירה של המושבות לאחר צמיחת הלילה בשעה 37 ° C ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את פליטת אור של הבידוד pneumococcal על ידי מדידת פליטת אור באמצעות מערכת הדמיה אופטית. </li></ol> 2. Intranasal וזיהום Intraperitoneal של עכברים עם Bioluminescent Pneumococci <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעכברי outbred נשיים בגיל 7-10 שבועות לדלקת ריאות חריפות ומודל אלח דם. משקלם של עכברים אלה צריך להיות בין 20-30 גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברים על ידי הזרקת intraperitoneal של קטמין ו xylazine. הכן מ&quot;ג 1.0 תערובתxylazine קטמין ו0.1 מ&quot;ג ב100 0.9% μl סטרילי (w / v) נתרן כלורי לעכברים עם משקל גוף של 20 גרם. זה עולה בקנה אחד עם מנה של 50 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף לקטמין ו5 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף לxylazine. כדי להיות מדויק, שוקלים עכברים לפני ההזרקה של חומרי ההרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את התערובת לתוך חלל intraperitoneal ולמקם את בעלי החיים בחזרה לכלוב עד שחומרי ההרדמה לפעול ובעלי החיים הם השפעה הנרקוטית. נשימה של עכברים תהיה מאוד איטית וקבועה. עכברים צריכים להיות השפעה הנרקוטית באופן מלא, כך שהחיסון אפי ושהאיפה של ההשעיה החיידקים לא יגרמו להתעטשות ולכן, אובדן של הבידוד. זה יכול להיות מוערך על ידי צובט את העכבר בסוף הזנב שלהם; עכבר השפעה הנרקוטית באופן מלא יהיה חוסר היענות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להרים את עכבר השפעה הנרקוטית והחזק את העכבר בין האצבעות והאגודל עם האף זקוף (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה עם טיפים צרים וארוכים (ג&#39;ל Loaderטיפים) ושחרר pneumococci bioluminescent בטיפין קטנות מרובות על nares (10 μl / נחיר) של העכבר 26-29. העכבר שלא מרצון יהיה לשאוף את החיידקים. החזק את דקות 1-2 העכבר זקוף ולראות אם העכבר מתעטש או שומר על הבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק עכברי CD-1 7-10 בן השבוע intranasally עם מינון זיהום של 1 x 10 x 7 או 7.5 10 7 pneumococci של D39 המתח וTIGR4, בהתאמה, כדי לפקח על הזיהום בזמן אמת. גבול הגילוי של המערכת ללא כל ספיג של רקמת המארח הוא כ 1 x 10 6 חיידקים bioluminescent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק עכברי intraperitoneally (IP) כדי להעריך וארסיות bioimage של pneumococci במודל עכבר זיהום אלח דם. השתמש 5 x 10 3 CFU בD39 של מתח 100 μl ו1 x 10 4 של מתח TIGR4. עכברים אינם מורדמים בעת שימוש במסלול ה-IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן עכברי שליטה עם PBS. <img alt="איור 1" fo:conteNT-width = &quot;5in&quot; עבור: רוחב src = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1.jpg&quot; = /&gt; &quot;500px&quot; איור 1. זיהום Intranasal של עכברי CD-1 עם ס &#39; דלקת ריאות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> </li></ol> 3. חזותי דלקת ריאות הפצה לריאות והדם באמצעות מערכת ההדמיה הפצת דימוי של pneumococci לאחר הדבקה אפי של נקבות עכברי outbred CD1 בזמן אמת באמצעות מערכת הדמיה vivo ב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מערכת ההדמיה ולהפעיל את תוכנת ניתוח תמונה נמצאת על מחשב preconfigurated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת ההדמיה מאתחלת באופן אוטומטי ומצלמת CCD מקוררת thermoelectrically 90 מעלות צלזיוס לפני להיות פעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההגדרות וbinning תלויות במספר העכברים נמדדבו זמנית, ועל כוחו של אות bioluminescent. שדה הראייה (FOV) כדי לפקח על פליטת אור של בעלי החיים משתנה ונעה בין הגדלת שדה ראייה של 22.5 סנטימטר למדוד חמישה עכברים, ושדה ראייה של 3.9 סנטימטר למדוד עכבר או חלקים בודדים של בעלי החיים כמו החזה או בראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משתמש באופן שגרתי זמן חשיפה של 1 דקות, במידת מדיום של binning, ושדה ראייה של 22.5 סנטימטר (ד &#39;סט). ראשית, בחר את מצב ההדמיה זורח ולאחר מכן להגדיר את הפרמטרים ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפליטה של ​​האות עשויה להיות תלויה בזן החיידקים וזן עכבר בשימוש, והפיגמנט של העכבר. לגלח את החזה של עכברים בעת שימוש לדוגמא: עכברי C57BL / 6, אשר יכולה להיות יתרון כאשר ההדמיה התפתחות דלקת הריאות בעכברים אלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת עכברים נגועה במרווחי זמן prechosen. למדוד את פליטת אור של עכברים במודל דלקת הריאות החריף במרווחים של שעות 8-12 מקסימום זמן. לפקח גם את רווחתם של עכברים נגועים בobserving המראה שלהם, התנהגות, ונחישות של הירידה במשקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברים בתא נרקוטיים של מערכת ההרדמה של ציוד ההדמיה לפני המדידות בחדר. התחל משאיפת תערובת של isoflurane וחמצן ולחכות עד שהעכברים לנשום לאט ובאופן קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח חיות מורדמים לחדר ההדמיה של המערכת ולשמור על עכברים במצב שכיבה. מצלמת CCD בחלק העליון של החדר תהיה לאחר מכן תמונה בדרכי נשימה העכברית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את החיות עם האף שלהם לתוך צינורות כדי לאפשר שאיפה של חומרי ההרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כניסת Isoflurane לחדר ההדמיה באמצעות צינורות גז מותר לשמור על הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפעיל את מצלמת CCD בחלק העליון של החדר ולהתחיל הדמיה אופטית bioluminescent, &quot;לרכוש&quot; עיתונות בתוכנת ההדמיה. מייד תצלום של העכברים בחדר הסגור מופיע על המסך. לאחר דקה אחת של<html> מדידת כיסוי של נתוני פליטת אור והתמונה מוצגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק הרדמה לאחר שכבת התמונה מופיעה בחלון של התוכנה ולשים את העכברים בחזרה לכלובים שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים מנוטרים להתאוששות. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2.jpg" width="500px" /> איור 2. הרדמה וניטור של עכברים נגועים בpneumococci bioluminescent באמצעות מערכת IVIS ספקטרום ההרדמה וIVIS, בהתאמה.) מערכת IVIS ספקטרום ההדמיה. ב &#39;) מערכת ההרדמה IVIS עם תא הדגירה. C) עכברים מורדמים בתא הדגירה עכברים. ד &#39;) הממוקמים בתוך תא IVIS ספקטרום ההדמיה עם האף שלהם שאף את חומר ההרדמה._blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. </li></ol> 4. כימות והערכה של פליטת אור של עכברים נגועים Bioluminescent ס pneumoniae <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את עוצמות פליטת אור של העכברים או מאזור הנבחר של העכברים על ידי הכימותים סך כל פליטת הפוטון (פוטונים / sec) באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בערכים של פליטת הפוטונים המסופקים בגיליון נתוני Excel להכין גרף. מאז הווריאציה נתונים היא לעתים קרובות גבוהה בעכברי מקובצים, ליצור גרף זיף תיבה כדי להציג את ההבדלים בעכברים נגועים בזני pneumococcal השונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק את הפוטונים לעכברים או לחלופין תוצאות כממוצע של זוהר (2 / SR פוטונים / sec / סנטימטר) של אזור שנבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני מדידה של החזר על השקעה (אזור של ריבית) במצב פוטון ניתן להשוות כמותית על פני שונה במערכות הדמיה vivo עם שונה באוהגדרות ra, מאז המדידות ביחידות של זוהר לוקחות בחשבון באופן אוטומטי את הגדרות מצלמה (למשל זמן אינטגרציה, binning, f / לעצור, ושדה הראייה). </li></ol>

<ol>
	<li>Niederman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+management+of+adults+with+community-acquired+pneumonia.+Diagnosis,+assessment+of+severity,+antimicrobial+therapy,+and+prevention.">Guidelines for the management of adults with community-acquired pneumonia. Diagnosis, assessment of severity, antimicrobial therapy, and prevention.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1730-1754 (2001).</li><li>WHO, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+disease:+2004+update.">The global burden of disease: 2004 update.</a> World Health Organization. , (2008).</li><li>Bogaert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonisation+by+Streptococcus+pneumoniae+and+Staphylococcus+aureus+in+healthy+children.">Colonisation by Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus in healthy children.</a> Lancet. 363, 1871-1872 (2004).</li><li>Gamez, G., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combat+pneumococcal+infections:+adhesins+as+candidates+for+protein-based+vaccine+development.">Combat pneumococcal infections: adhesins as candidates for protein-based vaccine development.</a> Curr. Drug Targets. 13, 323-337 (2012).</li><li>Mook-Kanamori, B. B., Geldhoff, M., vander Poll, T., Dvan de Beek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+pathophysiology+of+pneumococcal+meningitis.">Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 24, 557-591 (2011).</li><li>Musher, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+contagious+are+common+respiratory+tract+infections.">How contagious are common respiratory tract infections.</a> N. Engl. J. Med. 348, 1256-1266 (2003).</li><li>Brueggemann, A. B., Pai, R., Crook, D. W., Beall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+escape+recombinants+emerge+after+pneumococcal+vaccination+in+the+United+States.">Vaccine escape recombinants emerge after pneumococcal vaccination in the United States.</a> PLoS Pathog. 3, (2007).</li><li>Munoz-Almagro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+invasive+pneumococcal+disease+caused+by+nonvaccine+serotypes+in+the+era+of+7-valent+conjugate+vaccine.">Emergence of invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes in the era of 7-valent conjugate vaccine.</a> Clin. Infect. Dis. 46, 174-182 (2008).</li><li>Whitney, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+conjugate+pneumococcal+vaccines.">Impact of conjugate pneumococcal vaccines.</a> Pediatr. Infect. Dis. J. 24, 729-730 (2005).</li><li>Whitney, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decline+in+invasive+pneumococcal+disease+after+the+introduction+of+protein-polysaccharide+conjugate+vaccine.">Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine.</a> N. Engl. J. Med. 348, 1737-1746 (2003).</li><li>Lynch, J. P., Zhanel, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae:+epidemiology+and+risk+factors,+evolution+of+antimicrobial+resistance,+and+impact+of+vaccines.">Streptococcus pneumoniae: epidemiology and risk factors, evolution of antimicrobial resistance, and impact of vaccines.</a> Curr. Opin. Pulm. Med. 16, 217-225 (2010).</li><li>Singleton, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+pneumococcal+disease+caused+by+nonvaccine+serotypes+among+Alaska+native+children+with+high+levels+of+7-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+coverage.">Invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes among Alaska native children with high levels of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine coverage.</a> JAMA. 297, 1784-1792 (2007).</li><li>Dockrell, D. H., Whyte, M. K., Mitchell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumococcal+pneumonia:+mechanisms+of+infection+and+resolution.">Pneumococcal pneumonia: mechanisms of infection and resolution.</a> Chest. 142, 482-491 (2012).</li><li>Lieberman, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+bacterial+evolution+within+multiple+patients+identifies+candidate+pathogenicity+genes.">Parallel bacterial evolution within multiple patients identifies candidate pathogenicity genes.</a> Nat. Genet. 43, 1275-1280 (2011).</li><li>Yang, J., Tauschek, M., Robins-Browne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+bacterial+virulence+by+AraC-like+regulators+that+respond+to+chemical+signals.">Control of bacterial virulence by AraC-like regulators that respond to chemical signals.</a> Trends Microbiol. 19, 128-135 (2011).</li><li>Young, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+dynamics+of+Staphylococcus+aureus+during+progression+from+carriage+to+disease.">Evolutionary dynamics of Staphylococcus aureus during progression from carriage to disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4550-4555 (2012).</li><li>Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors+in+host+respiratory+colonization+and+disease.">The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 288-301 (2008).</li><li>Voss, S., Gamez, G., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+pneumococcal+microbial+surface+components+recognizing+adhesive+matrix+molecules+on+colonization.">Impact of pneumococcal microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules on colonization.</a> Mol. Oral Microbiol. 27, 246-256 (2012).</li><li>Koppe, U., Suttorp, N., Opitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Streptococcus+pneumoniae+by+the+innate+immune+system.">Recognition of Streptococcus pneumoniae by the innate immune system.</a> Cell. Microbiol. 14, 460-466 (2012).</li><li>Paterson, G. K., Mitchell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+and+the+pneumococcus.">Innate immunity and the pneumococcus.</a> Microbiology. 152, 285-293 (2006).</li><li>Gerber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Streptococcus+pneumoniae+meningitis+mimicking+several+features+of+human+disease.">A mouse model of Streptococcus pneumoniae meningitis mimicking several features of human disease.</a> Acta Neuropathol. 101, 499-508 (2001).</li><li>Gingles, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+genetic+resistance+in+invasive+pneumococcal+infection:+identification+and+study+of+susceptibility+and+resistance+in+inbred+mouse+strains.">Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains.</a> Infect. Immun. 69, 426-434 (2001).</li><li>Holmes, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pavA+gene+of+Streptococcus+pneumoniae+encodes+a+fibronectin-binding+protein+that+is+essential+for+virulence.">The pavA gene of Streptococcus pneumoniae encodes a fibronectin-binding protein that is essential for virulence.</a> Mol. Microbiol. 41, 1395-1408 (2001).</li><li>Koedel, U., Klein, M., Pfister, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+understandings+on+the+pathophysiology+of+bacterial+meningitis.">New understandings on the pathophysiology of bacterial meningitis.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 23, 217-223 (2010).</li><li>Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+pneumococcal+pneumonia.">Murine model of pneumococcal pneumonia.</a> Methods Mol. Biol. 602, 405-410 (2010).</li><li>Hartel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+glutamine+transporters+on+pneumococcal+fitness+under+infection-related+conditions.">Impact of glutamine transporters on pneumococcal fitness under infection-related conditions.</a> Infect. Immun. 79, 44-58 (2011).</li><li>Hermans, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+streptococcal+lipoprotein+rotamase+A+(SlrA)+is+a+functional+peptidyl-prolyl+isomerase+involved+in+pneumococcal+colonization.">The streptococcal lipoprotein rotamase A (SlrA) is a functional peptidyl-prolyl isomerase involved in pneumococcal colonization.</a> J. Biol. Chem. 281, 968-976 (2006).</li><li>Jensch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PavB+is+a+surface-exposed+adhesin+of+Streptococcus+pneumoniae+contributing+to+nasopharyngeal+colonization+and+airways+infections.">PavB is a surface-exposed adhesin of Streptococcus pneumoniae contributing to nasopharyngeal colonization and airways infections.</a> Mol. Microbiol. 77, 22-43 (2010).</li><li>Kadioglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumococcal+protein+PavA+is+important+for+nasopharyngeal+carriage+and+development+of+sepsis.">Pneumococcal protein PavA is important for nasopharyngeal carriage and development of sepsis.</a> Mol. Oral Microbiol. 25, 50-60 (2010).</li><li>Orihuela, C. J., Gao, G., Francis, K. P., Yu, J., Tuomanen, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+contributions+of+pneumococcal+virulence+factors+to+pathogenesis.">Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis.</a> J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).</li><li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon.">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infect. Immun. 69, 3350-3358 (2001).</li><li>Basavanna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+methionine+acquisition+and+synthesis+on+Streptococcus+pneumoniae+growth+and+virulence.">The effects of methionine acquisition and synthesis on Streptococcus pneumoniae growth and virulence.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Hartel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+central+carbon+metabolism+of+Streptococcus+pneumoniae+by+isotopologue+profiling.">Characterization of central carbon metabolism of Streptococcus pneumoniae by isotopologue profiling.</a> J. Biol. Chem. 287, 4260-4274 (2012).</li><li>Hammerschmidt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+immune+regulator+factor+H+interacts+via+two+contact+sites+with+the+PspC+protein+of+Streptococcus+pneumoniae+and+mediates+adhesion+to+host+epithelial+cells.">The host immune regulator factor H interacts via two contact sites with the PspC protein of Streptococcus pneumoniae and mediates adhesion to host epithelial cells.</a> J. Immunol. 178, 5848-5858 (2007).</li><li>Voss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choline-binding+protein+PspC+of+Streptococcus+pneumoniae+interacts+with+the+C-terminal+heparin-binding+domain+of+vitronectin.">The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin.</a> J. Biol. Chem. , (2013).</li><li>Cartwright, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumococcal+disease+in+western+Europe:+burden+of+disease,+antibiotic+resistance+and+management.">Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management.</a> Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).</li><li>vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+pneumococcal+isolates+from+pets+and+laboratory+animals.">Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Brehm, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+the+adenine+methylase+gene+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+pAM+beta+1.">Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1.</a> Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

<html> כל הניסויים שנערכו בבעלי חיים צריכים להיות מאושרים על ידי הרשויות המקומיות וועדות אתיקה. בניסויי in vivo זיהום עומס החיידקים בנישות המארח השונות של בעלי חיים נגועים צריך להיקבע בנקודות זמן שונות לאחר פגיעה. תחת תנאי ניסויים אלה בעלי החיים צריכים להיות מוקרבים ?...

זיהומים בדרכי נשימה הנגרמים על ידי וירוסים או חיידקים נשארים אחת בעיות הקהילה רכשה או קליניות הנפוצות ביותר בעולם גורמות כלשליש מכל המוות בכל עולם. מיני החיידקים העיקריים הם Haemophilus influenzae וStreptococcus pneumoniae 2. עם זאת, מיני חיידקים אלה הם בדרך כלל מרכיבים משותפים של הצמחייה בדרכי נשימה הטבעית. כך מרכבת חיידקים גם היא מסיכון מסוים למחלה פולשנית ובהתאם למצב או נטיות של יחידים חיסוניים. קולוניזציה אסימפטומטיים מופעלת לזיהומים פולשניים. Streptococcus pneumoniae הוא פתוגן המוביל של דלקת ריאות שנרכשו בקהילה (CAP) ואחד הגורמים השכיחים ביותר של קטרמיה בבני אדם. אצל אנשים בריאים ס pneumoniae (pneumococci) הם לעתים קרובות מתיישבים ללא תסמינים ובלתי מזיקים של דרך הנשימה העליונה, שבו הם מתמודדים עם חיידקי nonpathogenicשל צמחיית תושב, אלא גם עם פתוגנים כגון spp Haemophilus. או Staphylococcus aureus והשורה הראשונה של מערכת ההגנה החיסונית של האדם. שיעורי מרכבה הם הגבוהים ביותר בילדים צעירים (37%) ואף גבוהים יותר במעונות יום צפופות (58%) 3-5. האוכלוסייה הצעירה והקשישים, שקיבל את pneumococcus באמצעות שידור תרסיס מנישאים ופרשות האף והלוע 6, שייכות לקבוצות סיכון הגבוה וחיסון באמצעות אחת מהחיסונים המצומד pneumococcal (PCV10 או PCV13 בילדים וPPSV23 פוליסכריד 23 הערכי במבוגרים) מומלץ בארצות הברית (ארה&quot;ב) ומדינות רבות באירופה 4. PPSV23 מכסה קפסיד אחראים ל~ 90% מהמחלות bacteremic pneumococcal בארה&quot;ב ובאירופה, מניעת מחלות ובכך יעילות פולשנית pneumococcal (IPD) במבוגרים, בעוד PCVs לכסות קפסיד הנפוץ ביותר בילדים. כתוצאה מכך, IPD בשל סוגי חיסון (VT) הוא Reduקפסיד CED אבל nonvaccine מוצגות פוטנציאל אלימות גבוה ועמידות לאנטיביוטיקה צמחו 4,7-12. לוע האף כמאגר הוא הנקודה מוצא לpneumococci להתפשט להסינוסים או אוזני אמצע ייזום זיהומים מקומיים מזיקים. יותר חשוב, pneumococci להפיץ ישירות דרך דרכי הנשימה אל הסימפונות וריאות וכתוצאה מכך CAP סכנת החיים 4,13. דלקות ריאה הם מלווים לעתים קרובות ברקמות והרס מכשול, וכך לאפשר את הפתוגן להתפשט לדם וגורם לIPD. מקרים של CAP וIPD הם הגבוהים ביותר באנשים מדוכאי חיסון או על הקצוות של גיל 4,13. הנסיבות אחראי להמרה מcommensal לפתוגן עם ארסיות גבוהה הן עדיין תחת דיון. עם זאת, מלבד שינויים ברגישות המארח והסתגלות אבולוציונית מלווה באלימות גבוהה יותר והעלייה בהתנגדויות אנטיביוטיקה הוצעו להיות השפעה מכרעת על PNEזיהומי umococcal 14-16. הפתוגן הוא ניחן בריבוי adhesins תיווך מגע אינטימי לריריים תאי האפיתל. לאחר ההתגברות על הליחה בדרכי הנשימה, דלקת ריאות היצמדות לתאי מארח היא הקלה על דרך אינטראקציות ישירות של adhesins משטח חשוף עם קולטנים תאיים ועל ידי ניצול רכיבי מטריצה ​​תאיים או חלבונים בסרום כגישור מולקולות 4,17,18. פתוגנים כתכליתיים pneumococci מצוידים גם עם גורמים מעורבים בהתחמקות ממנגנוני הגנת מארחת חיסונית. יתר על כן, יש להם את היכולת להסתגל לחוגי מארח שונים, כגון ריאות, דם ונוזל השדרה (CSF), בהתאמה 5,17,19,20. ההשפעה של גורמי חיידקים על תגובות פתוגנזה ומארח דלקתי הוא נחקר במודלים של בעלי חיים ניסיוני של דלקת ריאות, בקטרמיה, או דלקת קרום המוח 21-25. למרות היותו הפתוגן אנושי, המודלים האלה הם אנחנומבוסס ll לפענח כמיהות pneumococcal רקמות, מנגנוני אלימות, או protectivity של מועמדי חיסון נגד דלקת ריאות. הרקע הגנטי של זנים טהורים עכבר קובע את הרגישות לpneumococci. עכברי BALB / ג intranasally נגוע בpneumococci נמצאו להיות עמיד, ואילו עכברי CBA / Ca וSJL היו רגישים יותר נגד זיהומי pneumococcal 22. משמעות הדבר הוא כי, בדומה לבני אדם, הרקע הגנטי ומנגנוני הגנת המארח לקבוע את התוצאה של הזיהום. לפיכך, מאמצים נוספים נדרשים כדי לפענח לוקוסי התנגדות בגנום של עכברים פחות רגישים לזיהומים pneumococcal. הממצאים הובילו לשינויים בin vivo פרוטוקולי ארסיות. במקום עכברי BALB / ג טהורים משמשים לעתים קרובות בעבר, זני העכבר רגישים מאוד CD-1/MF1 outbred כיום הם משמשים לעתים קרובות כדי לחקור את ההשפעה של ארסיות אובדן-of-פונקצית ריאות או כושר גורמי 26-28. יתר על כן, על הזמינותשל pneumococci bioluminescent וטכניקות הדמיה אופטיות מאפשרת bioimaging פליטת אור בזמן אמת של זיהומים. בpneumococci הקלטת מותאמת luxABCDE הגן (פלסמיד Paul-r luxABCDE ק&quot;מ Tn 4001) הוכנסה לאתר אינטגרציה יחיד של כרומוזום ידי mutagenesis transposon. pneumococci bioluminescent להיות מועסק על מנת להעריך את הנחתה של מוטציות pneumococcal החסרות בגורמים ארסי או כושר וטרנסלוקציה שלהם מאתר אחד אנטומיים ל26,28-31 אחר. כאן אנו מספקים פרוטוקול לbioimaging של דלקות ריאות בדלקת ריאות עכבריות או מודל אלח דם. הגברה והפצה של pneumococci bioluminescent בעכברי intranasally או intraperitoneally נגועים בקלות יכולות להיות במעקב לאורך זמן באמצעות מערכת הדמיה אופטית והחיה אותו בנקודות זמן שונות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="985">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Todd Hewitt broth</td>
			<td style="width:280px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">X936.1</td>
			<td style="width:280px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:280px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Blood agar plates</td>
			<td style="width:280px;">Oxoid, Wesel, Germany</td>
			<td style="width:129px;">PB5039A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:280px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:280px;">Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:129px;">E6376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:280px;">PAA Laboratories, Coelbe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">A11-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">CD-1 mice, female</td>
			<td style="width:280px;">Charles River, Sulzfeld, Germany</td>
			<td style="width:129px;">CD1SIFE06W08W</td>
			<td>female CD-1 mice, six to eight weeks old</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamin 500mg, Curamed injection solution</td>
			<td>Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Rompun 2%, injection solution</td>
			<td>Bayer Animal Health, Monheim, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Plastipak 1 ml syringes</td>
			<td>Becton Dickinson, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:129px;">300015</td>
			<td>sterile Luer-Lok&#8482; syringes with needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Gel Loader Tips</td>
			<td style="width:280px;">peqlab</td>
			<td style="width:129px;">81-13790</td>
			<td>M&#181;ltiFlex&#8482; Tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Hyaluronidase</td>
			<td style="width:280px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">H3884-100mg</td>
			<td>Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Oxygen</td>
			<td style="width:280px;">Air Liquide, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td style="width:129px;">M1001L50R2A001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Isofluoran</td>
			<td style="width:280px;">Baxter, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">pGEM-T Easy</td>
			<td style="width:280px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Oligonucleotides </td>
			<td style="width:280px;">Eurofins MWG, Ebersberg, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Qiaprep Spin Midiprep Kit </td>
			<td style="width:280px;">Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:129px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:296px;">PCR DNA purification kit</td>
			<td style="width:280px;">Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:129px;">28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:296px;">Equipment</td>
			<td style="width:280px;"> </td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Living Image 4.1 software</td>
			<td style="width:280px;">Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td style="width:280px;">Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">IVIS Spectrum Imaging System </td>
			<td style="width:280px;">Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Biophotometer</td>
			<td style="width:280px;">Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following in real time the impact of pneumococcal virulence factors in an acute mouse pneumonia model using bioluminescent bacteria

דלקת ריאות היא אחת הבעיות הגדולות הבריאות במדינות מתפתחים ומתועשות והיא קשורה עם תחלואה ותמותה ניכרות. למרות התקדמות בידע של מחלה זו, הזמינות של יחידות לטיפול נמרץ (ICU), והשימוש בסוכני מיקרוביאלית חזקים וחיסונים יעילים, שיעורי התמותה עדיין גבוהים 1. Streptococcus pneumoniae הוא פתוגן המוביל של דלקת ריאות שנרכשה בקהילה (CAP) ואחת הסיבות השכיחות ביותר של קטרמיה בבני אדם. פתוגן זה מצויד בארסנל של adhesins משטח חשוף וגורמים ארסי תורמים לדלקת ריאות ומחלת ריאות פולשנית (IPD). ההערכה של תפקיד vivo של גורמי כושר או ארסי חיידקים היא בעל חשיבות עליונה לפענח ס מנגנוני פתוגניות דלקת ריאות. מודלים עכבריים של דלקת ריאות, בקטרמיה, ודלקת קרום מוח נמצאים בשימוש כדי לקבוע את ההשפעה של גורמי דלקת ריאות בdifferent שלבים של הזיהום. כאן אנו מתארים פרוטוקול לפקח בהפצת דלקת ריאות בזמן אמת בעכברים לאחר אפי או זיהומי intraperitoneal עם חיידקי bioluminescent. התוצאות מראות כפל והפצת pneumococci בדרכי נשימה התחתונה ודם, אשר ניתן דמיינו והוערכו באמצעות מערכת הדמיה וניתוח התוכנה הנלווית.

הרכישה והספיגה של מתיונין היא בעלת חשיבות המרכזית לpneumococci כדי לשמור על כושר בנישה של המארח שלהם 32,33. ליפופרוטאין טרנספורטר מתיונין ABC מקודד בD39 ידי SPD _ גן 0151 (TIGR4: sp_0149) ושם MetQ 32. Pneumococci לייצר עוד אנזימי ביוסינתזה מתיונין (D39: Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - S...

Watch this Scientific Journal Video about Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria at JoVE.com

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Streptococcus pneumoniae הוא פתוגן המוביל גורם לדלקת ריאות שנרכשה בקהילה קשה ואחראית ליותר מ -2 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם. ההשפעה של גורמי חיידקים מעורבים בכושר או ארסיות יכולה להיות במעקב בזמן אמת במודל דלקת ריאות או בקטרמיה עכבר אקוטי באמצעות חיידקי bioluminescent.

בעקבות בזמן אמת השפעת גורמי דלקת ריאות ארסיים בעכבר דלקת ריאות דגם אקוטי באמצעות חיידקי Bioluminescent

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

following-real-time-impact-pneumococcal-virulence-factors-an-acute

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.9K Views.  University of Greifswald.  Streptococcus pneumoniae הוא פתוגן המוביל גורם לדלקת ריאות שנרכשה בקהילה קשה ואחראית ליותר מ -2 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם. ההשפעה של גורמי חיידקים מעורבים בכושר או ארסיות יכולה להיות במעקב בזמן אמת במודל דלקת ריאות או בקטרמיה עכבר אקוטי באמצעו...

Video: Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay דבקות

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

קופסית Serotyping של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש תגובת Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם של התקפת T-Cell-מכוון oligodendrocyte בפרוסות המוח חריף

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human diseases have been reported to be associated with four species of bacteria: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, and Aeromonas caviae. The model organism Caenorhabditis elegans is a bacterivore that provides an excellent infection model by which to study the bacterial pathogenesis of Aeromonas. Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection using a C. elegans model, including survival, liquid toxicity, and muscle necrosis assays. The results of the three methods determining the virulence of Aeromonas were consistent. A. dhakensis was shown to be the most toxic among the 4 major Aeromonas species causing clinical infections. These methods are shown to be a convenient way to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species and contribute to our understanding of the pathogenesis of Aeromonas infection.

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection in C. elegans. Using these convenient methods, it is easy to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species.

הערכת התקפה אלימה ו פתוגנזה של זיהום Aeromonas במודל Caenorhabditis elegans

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

הדמיה של אינטרפרון באתרו הפקת גמא בטחול העכבר בעקבות זיהום יסטריה חיידקי

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

הדור של המסגרת של גן In-Frame מוטציות מחיקה ב פסאודומונס aeruginosa ובדיקת התקפה אלימה מודל עכבר פשוט של זיהום

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration through the blood-brain barrier are indispensable steps for the development of E. coli meningitis. Reactive oxygen species (ROS) represent the major bactericidal mechanisms of neutrophils to destroy the invaded pathogens. In this protocol, the time-dependent intracellular ROS production in neutrophils infected with meningitic E. coli was quantified using fluorescent ROS probes detected by a real-time fluorescence microplate reader. This method may also be applied to the assessment of ROS production in mammalian cells during pathogen-host interactions.

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli is the leading cause of neonatal Gram-negative bacterial meningitis. During the bacterial infection, reactive oxygen species produced by neutrophils play a major bactericidal role. Here we introduce a method to detect the reactive oxygen species in neutrophils in response to meningitis E. coli.

כימות בזמן אמת של מינים חמצן תגובתי נויטרופילים נגועים מנינגיטי Escherichia קולי

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a large proportion of the infecting bacteria form biofilms within airway sputum. Pa biofilms isolated from CF sputum have been shown to grow in small, dense aggregates of ~10-1,000 cells that are spatially organized and exhibit clinically relevant phenotypes such as antimicrobial tolerance. One of the biggest challenges to studying how Pa aggregates respond to the changing sputum environment is the lack of nutritionally relevant and robust systems that promote aggregate formation. Using a synthetic CF sputum medium (SCFM2), the life history of Pa aggregates can be observed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) and image analysis at the resolution of a single cell. This in vitro system allows the observation of thousands of aggregates of varying size in real time, three dimensions, and at the micron scale. At the individual and population levels, having the ability to group aggregates by phenotype and position facilitates the observation of aggregates at different developmental stages and their response to changes in the microenvironment, such as antibiotic treatment, to be differentiated with precision.

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Synthetic cystic fibrosis sputum medium (SCFM2) can be utilized in combination with both confocal laser scanning microscopy and fluorescence-activated cell sorting to observe bacterial aggregates at high resolution. This paper details methods to assess aggregate populations during antimicrobial treatment as a platform for future studies.

כלים להערכה בזמן אמת של מודל זיהום פסאודומונס ארוגינוזה

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...