La recherche dans le laboratoire a été financé par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, 3125/4-2 DFG HA) et le ministère fédéral de l&#39;Éducation et de la Recherche (BMBF) génomique d&#39;infection médicale (FKZ 0315828A) à SH.

Les expériences d&#39;infection animale décrites ici doivent être effectuées en stricte conformité avec la (par exemple le droit européen de la santé de la Fédération des animaux de laboratoire Sciences associations (FELASA)) locale et internationale guidelines et règlements pour l&#39;utilisation d&#39;animaux vertébrés. Les expériences doivent être approuvés par le Comité de protection des animaux institutionnels comité d&#39;éthique local et. Toutes les expériences avec S. pneumoniae dans le laboratoire ou les infections animales sont réalisées dans un cabinet de biosécurité de classe II. Une. Préparation de la Banque infectieuses de bioluminescentes Pneumocococi <ol><li> Préparer cultures stock pneumocoque dans un bouillon Todd-Hewitt additionné de 1% (p / v) d&#39;extrait de levure et une concentration finale de 20% de glycérol pour la maintenance à 80 ° C. </li><li> Plaque une petite quantité de stock de culture pneumocoque surgelés sur une plaque de gélose au sang et incuber les bactéries pour 10 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2. Til plaque de gélose au sang contenant les antibiotiques appropriés, tels que la kanamycine (150 pg / ml) pour l&#39;insertion du transposon de la cassette de gène dans le génome luxABCDE. </li><li> Sous-cultiver une nouvelle colonie sur une nouvelle plaque de gélose au sang pour un maximum de 10 heures. </li><li> Inoculer un milieu THY complété avec 10% (v / v) inactivé par la chaleur (30 min à 56 ° C) de sérum fœtal bovin (FBS) par des pneumocoques et de commencer la culture à une DO 600 de 0,05-0,07. </li><li> Incuber les pneumocoques sans agitation à 37 ° C et 5% de CO2 jusqu&#39;à ce que la culture atteint une DO600 de 0,35 à 0,40. Croissance prendra entre 3-4 heures. </li><li> Récolte des pneumocoques par centrifugation à 3750 xg pendant 10 min et remettre en suspension les pneumocoques bioluminescent dans du tampon phosphate salin à pH 7,4 (PBS) supplémenté avec 0,5% de FBS. </li><li> Ajuster l&#39;inoculum à la concentration désirée dans PBS/10% de FBS. La dose dépend de l&#39;infection par la souche pneumococcique utilisé et l&#39;arrière-plan génétique du microe. Pour infecter consanguine souris CD-1 par voie intranasale avec S. pneumoniae D39 lux la dose d&#39;infection doit être ajustée à 1 x 10 7 CFU dans une suspension de 20 ul supplémenté avec 90 parts de la hyaluronidase. Ne pas secouer ou vortex pneumocoques, car cela va déclencher autolyse. </li><li> Vérifier la concentration d&#39;inoculum par étalement des dilutions en série 10 de pliage sur une gélose au sang et le dénombrement des colonies après culture pendant une nuit à 37 ° C dans 5% de CO 2. </li><li> Vérifier la bioluminescence de l&#39;inoculum à pneumocoques en mesurant la bioluminescence en utilisant un système d&#39;imagerie optique. </li></ol> 2. Intranasale et l&#39;infection par voie intrapéritonéale des souris avec bioluminescentes pneumocoques <ol><li> Utilisez la souris consanguine de femmes dans l&#39;âge de 7-10 semaines pour la pneumonie aiguë et modèle de septicémie. Le poids de ces souris devrait se situer entre 20 à 30 g. </li><li> Anesthésier les souris par injection intraperitoneale de kétamine et de xylazine. Préparer un mélange de 1,0 mgkétamine et de xylazine 0,1 mg dans 100 ul de 0,9% stérile (p / v) de chlorure de sodium pour les souris ayant un poids corporel de 20 g. Ceci est cohérent avec une dose de 50 mg / kg de poids corporel de la kétamine et 5 mg / kg de poids corporel pour la xylazine. Pour être précis, peser souris avant l&#39;injection de l&#39;anesthésique. </li><li> Injecter le mélange dans la cavité intrapéritonéale et placer les animaux dans la cage jusqu&#39;à ce que les anesthésiques agissent et les animaux sont narcose. La respiration de souris va devenir très lent et régulier. Les souris doivent être entièrement narcotisé, de sorte que l&#39;inoculation intranasale et l&#39;inhalation de la suspension bactérienne ne donneront pas lieu à des éternuements et, par conséquent, une perte d&#39;inoculum. Ceci peut être évalué par le pincement de la souris à la fin de leur queue, une souris entièrement narcotisé manquera de réactivité. </li><li> Prendre doucement une souris narcose et maintenez la souris entre les doigts et le pouce avec le nez en position verticale (figure 1). </li><li> Utiliser une pipette avec de longues pointes étroites (Gel LoaderConseils) et déposez-les pneumocoques bioluminescentes dans plusieurs petites gouttelettes sur les narines (10 pl / narine) de la souris 26-29. La souris involontairement inhaler les bactéries. Maintenez la souris 1-2 min verticale et observer si la souris éternue ou maintient l&#39;inoculum. </li><li> Infecter vieux 7-10 semaines souris CD-1 par voie intranasale avec une dose d&#39;infection de 1 x 10 7 et 7,5 x 10 7 pneumocoques de souche D39 et TIGR4, respectivement, afin de contrôler l&#39;infection en temps réel. La limite de détection pour le système sans aucune absorption par le tissu de l&#39;hôte est de 1 x 10 6 bactéries bioluminescentes. </li><li> Infecter des souris par voie intrapéritonéale (IP) afin d&#39;évaluer la virulence et BioImage de pneumocoques dans un modèle de sepsis infection de la souris. Utilisation de 5 x 10 3 CFU dans 100 ul de la souche D39 et 1 x 10 4 de la souche TIGR4. Souris ne sont pas anesthésiés en utilisant le routage IP. </li><li> Inoculer les souris de contrôle avec du PBS. <img alt="Figure 1" fo:content-width = &quot;5 po&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figure 1. Infection intranasale de souris CD-1 avec S. pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . </li></ol> 3. Visualisation pneumocoque diffusion dans le poumon et sang en utilisant le système d&#39;imagerie La diffusion de l&#39;image pneumocoques après infection par voie intranasale des souris CD1 femelles non consanguines en temps réel en utilisant un système d&#39;imagerie in vivo dans. <ol><li> Allumez le système d&#39;imagerie et lancer le logiciel d&#39;analyse d&#39;image situé sur l&#39;ordinateur preconfigurated. </li><li> Le système d&#39;imagerie et initialise automatiquement la caméra CCD est refroidi thermoélectriquement à 90 ° C avant d&#39;être actif. </li><li> Les réglages et binning dépendent du nombre de souris mesuréen même temps et sur la puissance du signal de bioluminescence. Le champ de vision (FOV) pour surveiller la bioluminescence des animaux est variable et le grossissement varie entre un champ de vision de 22,5 cm pour mesurer cinq souris, et un champ de vision de 3,9 cm pour mesurer un simple clic ou parties de l&#39;animal comme la poitrine ou la tête. </li><li> Utilisez systématiquement un temps d&#39;exposition de 1 min, un degré moyen de catégorisation, et un champ de vision de 22,5 cm (ensemble D). Tout d&#39;abord, sélectionnez le mode d&#39;imagerie de luminescence et puis définissez les paramètres d&#39;imagerie. </li><li> L&#39;émission du signal peut dépendre de la souche bactérienne et de la souche de souris utilisée, et le pigment de la souris. Raser le thorax de la souris lors de l&#39;utilisation, par exemple souris C57BL / 6, ce qui peut être avantageux lorsque l&#39;imagerie du développement de la pneumonie chez ces souris. </li><li> L&#39;image des souris infectées à des intervalles de temps préalablement choisie. Mesurer la bioluminescence de la souris dans le modèle de pneumonie aiguë à des intervalles de temps de 8-12 heures au maximum. Surveillez aussi le bien-être des souris infectées par observing leur apparence, le comportement et la détermination de la perte de poids. </li><li> Anesthésier les souris dans la chambre narcotique du système d&#39;anesthésie de l&#39;équipement de formation d&#39;image avant que les mesures effectuées dans la chambre. Lancer inhalation d&#39;un mélange d&#39;isoflurane et de l&#39;oxygène et attendre que les souris respirent lentement et régulièrement. </li><li> Placer les animaux anesthésiés dans la chambre de formation d&#39;image du système et conserver les souris dans la position couchée sur le dos. La caméra CCD sur le dessus de la chambre sera alors l&#39;image de la voies respiratoires murin. </li><li> Placez les animaux avec leur nez dans des tubes pour permettre l&#39;inhalation des anesthésiques. </li><li> L&#39;isoflurane entrée dans la chambre de formation d&#39;image par l&#39;intermédiaire d&#39;un tube à gaz est autorisé à maintenir une anesthésie. </li><li> Pour activer la caméra CCD sur le dessus de la chambre et de commencer à l&#39;imagerie optique de bioluminescence, appuyez sur &quot;Acquire&quot; dans le logiciel d&#39;imagerie. Immédiatement une photographie de la souris dans la chambre fermée apparaît sur l&#39;écran. Après une minute d&#39;<html> mesure d&#39;une superposition des données de bioluminescence et la photo est affiché. </li><li> Arrêtez l&#39;anesthésie après la superposition d&#39;image apparaît dans la fenêtre du logiciel et de mettre les souris de nouveau dans leurs cages. </li><li> Les souris sont surveillés pour la récupération. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2.jpg" width="500px" /> Figure 2. Anesthésie et la surveillance des souris infectées par des pneumocoques bioluminescente utilisant l&#39;anesthésie IVIS et système IVIS du spectre, respectivement. A) Le système IVIS Spectre de formation d&#39;image. B) Le système d&#39;anesthésie IVIS avec la chambre d&#39;incubation. C) de souris anesthésiées dans la chambre d&#39;incubation . D) Souris situé dans la chambre d&#39;imagerie IVIS spectre avec le nez inhalation de l&#39;anesthésique._blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir l&#39;image. </li></ol> 4. Quantification et l&#39;évaluation de la bioluminescence des souris infectées avec des bioluminescentes S. pneumoniae <ol><li> Déterminer les intensités de bioluminescence des souris ou d&#39;une région sélectionnée de la souris par la quantification de l&#39;émission de photons totale (photons / seconde) en utilisant le logiciel d&#39;analyse d&#39;image. </li><li> Utilisez les valeurs de l&#39;émission de photons qui sont fournis dans une feuille de données Excel pour préparer un graphique. Depuis la variation des données est souvent élevé dans les souris groupés, générer un graphique boîte à moustaches pour voir les différences chez les souris infectées par les différentes souches de pneumocoques. </li><li> Fournir les photons par souris ou encore les résultats que la moyenne de rayonnement (photons / sec / cm 2 / sr) d&#39;une zone sélectionnée. </li><li> Les données de mesure de ROI (région d&#39;intérêt) en mode de photons peuvent être quantitativement comparés entre différents systèmes d&#39;imagerie in vivo avec différents sont venusparamètres de ra, puisque les mesures en unités de rayonnement prennent automatiquement en compte les paramètres de l&#39;appareil photo (par exemple le temps d&#39;intégration, binning, f / arrêt, et le champ de vision). </li></ol>

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Immunol. 178, 5848-5858 (2007).</li><li>Voss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choline-binding+protein+PspC+of+Streptococcus+pneumoniae+interacts+with+the+C-terminal+heparin-binding+domain+of+vitronectin.">The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin.</a> J. Biol. Chem. , (2013).</li><li>Cartwright, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumococcal+disease+in+western+Europe:+burden+of+disease,+antibiotic+resistance+and+management.">Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management.</a> Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).</li><li>vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+pneumococcal+isolates+from+pets+and+laboratory+animals.">Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Brehm, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+the+adenine+methylase+gene+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+pAM+beta+1.">Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1.</a> Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

<html> Toutes les expériences menées sur des animaux doivent être approuvés par les autorités locales et les commissions d&#39;éthique. Expériences in vivo d&#39;infection dans la charge bactérienne dans les différents créneaux d&#39;accueil des animaux infectés doit être déterminée à différents moments après l&#39;infection. Dans ces conditions expérimentales, les animaux doivent être sacrifiés avant l&#39;isolement des bactéries à partir du sang, du nasopharynx, lavage bronchoalv...

Infections des voies respiratoires causées par des virus ou des bactéries restent l&#39;un des problèmes les plus courants cliniques acquis communautaires ou à travers le monde causant environ un tiers de tous les décès dans le monde. Les espèces bactériennes clés sont Haemophilus influenzae et Streptococcus pneumoniae 2. Cependant, ces espèces bactériennes sont habituellement des constituants communs de la flore naturelles respiratoires des voies. Ainsi chariot de bactéries est également certain risque de maladie invasive et en fonction de l&#39;état immunitaire ou prédispositions des individus. La colonisation asymptomatique est déclenché pour les infections invasives. Streptococcus pneumoniae est le principal agent pathogène de la pneumonie communautaire (PAC) et l&#39;une des causes les plus courantes de bactériémie chez les humains. Chez les individus sains S. pneumoniae (pneumocoque) sont souvent asymptomatiques colonisateurs et inoffensifs des voies respiratoires supérieures, où ils sont confrontés à des bactéries non pathogènesde la flore résidente, mais aussi par des agents pathogènes tels que Haemophilus spp. ou Staphylococcus aureus et la première ligne du système immunitaire humain de la défense. Les taux de portage sont les plus élevés chez les jeunes enfants (37%) et encore plus élevé dans les centres de soins de jour bondés (58%) 3-5. La population la plus jeune et les personnes âgées recevant le pneumocoque par la transmission par aérosol des transporteurs et des sécrétions naso-pharyngées 6, appartiennent à des groupes à haut risque et la vaccination à l&#39;aide de l&#39;un des vaccins antipneumococciques conjugués (de PCV10 ou PCV13 chez les enfants et 23-valent polysaccharide PPSV23 chez les adultes) Il est recommandé aux États-Unis (US) et de nombreux pays européens 4. Le PPSV23 couvre sérotypes responsables de ~ 90% des maladies pneumococciques bactériémiques aux États-Unis et en Europe, la prévention des maladies pneumococciques invasives ainsi efficacement (IPD) chez les adultes, tandis que les PCVs couvrent les sérotypes les plus fréquents chez les enfants. Par conséquent, IPD en raison de types de vaccins (VT) sont redusérotypes non vaccinaux ced mais présentant un potentiel de virulence élevée et résistance aux antibiotiques ont émergé 4,7-12. Le nasopharynx que le réservoir est le point de départ pour les pneumocoques se propager aux sinus ou des oreilles moyennes initiateurs infections locales dangereuses. Plus important encore, les pneumocoques se propager directement par la voie aérienne pour les bronches et les poumons entraînant mortelle PAC 4,13. Les infections pulmonaires sont souvent accompagnés de tissus et destruction de la barrière, permettant ainsi à l&#39;agent pathogène de se propager dans le sang et provoquer IPD. Les incidences de la PAC et IPD sont les plus élevés chez les personnes immunodéprimées ou aux extrêmes de 4,13 ans. Les circonstances responsables de la conversion d&#39;un commensal à un agent pathogène à haute virulence sont encore en discussion. Toutefois, outre l&#39;évolution de la sensibilité de l&#39;hôte et adaptation évolutive accompagnée de virulence plus élevée et l&#39;augmentation des résistances aux antibiotiques ont été suggéré d&#39;avoir un impact crucial sur pneinfections umococcal 14-16. L&#39;agent pathogène est doté d&#39;une multiplicité d&#39;adhésines médiatrices contact intime de cellules épithéliales des muqueuses. Après avoir surmonté le mucus des voies respiratoires, l&#39;adhésion des pneumocoques à des cellules hôtes est facilitée par l&#39;intermédiaire d&#39;interactions directes des adhésines de surface exposée avec des récepteurs cellulaires et en exploitant des composants de la matrice extracellulaire ou des protéines sériques comme des molécules de pontage 4,17,18. Pathogènes polyvalents pneumocoques sont également équipées de facteurs impliqués dans l&#39;évasion des mécanismes de défense immunitaire de l&#39;hôte. En outre, ils ont la capacité de s&#39;adapter à différents milieux d&#39;accueil tels que les poumons, le sang et le liquide céphalo-rachidien (LCR), respectivement 5,17,19,20. L&#39;impact des facteurs bactériens sur les réponses de la pathogenèse et d&#39;accueil inflammatoire est étudiée dans des modèles animaux expérimentaux de la pneumonie, la bactériémie, la méningite ou 21-25. En dépit d&#39;être un agent pathogène humain, ces modèles sont nousll établi à déchiffrer tropisme pneumocoque de tissu, les mécanismes de virulence, ou protectivity de candidats vaccins contre le pneumocoque. Le fond génétique des souches de souris consanguines détermine la susceptibilité à pneumocoques. Des souris BALB / c infectées par voie intranasale les pneumocoques se sont révélés être résistants, alors que les souris CBA / Ca et SJL étaient plus sensibles contre les infections à pneumocoque 22. Cela implique que, comme pour les humains, la génétique et les mécanismes de défense de l&#39;hôte de déterminer le résultat de l&#39;infection. Par conséquent, des efforts supplémentaires sont nécessaires pour démêler locus de résistance dans le génome de la souris moins sensibles aux infections pneumococciques. Les résultats ont conduit à des changements in vivo dans des protocoles de virulence. Au lieu des souris BALB / c consanguines souvent utilisés dans le passé, les souches de souris consanguines très sensibles de CD-1/MF1 sont aujourd&#39;hui souvent utilisées pour étudier l&#39;effet de la virulence ou d&#39;adaptation à pneumocoques perte de fonction de facteurs 26-28. En outre, la disponibilitédes pneumocoques bioluminescentes et techniques d&#39;imagerie optique permet en temps réel bioluminescence bio-imagerie des infections. En pneumocoques la cassette du gène luxABCDE optimisé (plasmide Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km r) a été inséré dans un site unique d&#39;insertion du chromosome par mutagénèse par transposon. Pneumocoques Bioluminescent ont été employés pour évaluer l&#39;atténuation de mutants pneumococciques virulence ou déficients en facteurs de remise en forme et de leur translocation d&#39;un site anatomique dans un autre 26,28-31. Ici, nous fournissons un protocole pour la bio-imagerie des infections à pneumocoque dans une pneumonie murine ou modèle de septicémie. L&#39;amplification et la diffusion des pneumocoques chez des souris par voie intranasale bioluminescent ou infectées par voie intrapéritonéale peuvent facilement être contrôlées au cours du temps en utilisant un système d&#39;imagerie optique et le même animal, à différents points dans le temps.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="985">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Todd Hewitt broth</td>
			<td style="width:280px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">X936.1</td>
			<td style="width:280px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:280px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Blood agar plates</td>
			<td style="width:280px;">Oxoid, Wesel, Germany</td>
			<td style="width:129px;">PB5039A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:280px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:280px;">Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:129px;">E6376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:280px;">PAA Laboratories, Coelbe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">A11-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">CD-1 mice, female</td>
			<td style="width:280px;">Charles River, Sulzfeld, Germany</td>
			<td style="width:129px;">CD1SIFE06W08W</td>
			<td>female CD-1 mice, six to eight weeks old</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamin 500mg, Curamed injection solution</td>
			<td>Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Rompun 2%, injection solution</td>
			<td>Bayer Animal Health, Monheim, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Plastipak 1 ml syringes</td>
			<td>Becton Dickinson, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:129px;">300015</td>
			<td>sterile Luer-Lok&#8482; syringes with needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Gel Loader Tips</td>
			<td style="width:280px;">peqlab</td>
			<td style="width:129px;">81-13790</td>
			<td>M&#181;ltiFlex&#8482; Tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Hyaluronidase</td>
			<td style="width:280px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">H3884-100mg</td>
			<td>Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Oxygen</td>
			<td style="width:280px;">Air Liquide, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td style="width:129px;">M1001L50R2A001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Isofluoran</td>
			<td style="width:280px;">Baxter, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">pGEM-T Easy</td>
			<td style="width:280px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Oligonucleotides </td>
			<td style="width:280px;">Eurofins MWG, Ebersberg, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Qiaprep Spin Midiprep Kit </td>
			<td style="width:280px;">Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:129px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:296px;">PCR DNA purification kit</td>
			<td style="width:280px;">Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:129px;">28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:296px;">Equipment</td>
			<td style="width:280px;"> </td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Living Image 4.1 software</td>
			<td style="width:280px;">Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td style="width:280px;">Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">IVIS Spectrum Imaging System </td>
			<td style="width:280px;">Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Biophotometer</td>
			<td style="width:280px;">Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following in real time the impact of pneumococcal virulence factors in an acute mouse pneumonia model using bioluminescent bacteria

La pneumonie est l&#39;un des principaux problèmes de santé dans les pays en développement et les pays industrialisés et est associée à une morbidité et une mortalité considérables. Malgré les progrès dans la connaissance de cette maladie, la disponibilité des unités de soins intensifs (USI), et l&#39;utilisation d&#39;agents antimicrobiens puissants et des vaccins efficaces, les taux de mortalité restent élevés 1. Streptococcus pneumoniae est le principal agent pathogène de la pneumonie communautaire (PAC) et l&#39;une des causes les plus courantes de bactériémie chez l&#39;homme. Cet agent pathogène est équipé d&#39;un arsenal de adhésines de surface exposée et facteurs de virulence qui contribuent à la pneumonie et les maladies invasives à pneumocoques (IIP). L&#39;évaluation du rôle in vivo de facteurs de forme physique ou virulence bactérienne est de la plus haute importance à démêler S. mécanismes de pathogénicité pneumoniae. Les modèles murins de la pneumonie, la bactériémie et la méningite sont utilisés pour déterminer l&#39;impact des facteurs de pneumocoques à différents stades de l&#39;infection. Ici, nous décrivons un protocole pour surveiller en temps réel la diffusion pneumocoque chez la souris après des infections par des bactéries bioluminescentes intrapéritonéale ou intranasale. Les résultats montrent la multiplication et la diffusion des pneumocoques dans les voies respiratoires inférieures et du sang, qui peut être visualisée et évaluée en utilisant un système d&#39;imagerie et le logiciel d&#39;analyse d&#39;accompagnement.

L&#39;acquisition et l&#39;utilisation de la méthionine est d&#39;une importance centrale pour les pneumocoques pour se maintenir en forme dans leur créneau d&#39;accueil 32,33. La méthionine transporteur ABC lipoprotéine est codé dans D39 par le SPD _ 0151 gènes (TIGR4: sp_0149) et nommé MetQ 32. Pneumocoques produire plus d&#39;enzymes de biosynthèse de la méthionine (D39: Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, Mete et METF). L&#39;absence de méthionine...

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Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Streptococcus pneumoniae est l&#39;agent pathogène menant pneumopathies sévères acquis communautaire et responsable de plus de 2 millions de décès dans le monde. L&#39;impact des facteurs bactériens impliqués dans la virulence de remise en forme ou peut être contrôlé en temps réel dans une pneumonie ou une bactériémie modèle de souris en utilisant des bactéries bioluminescentes aiguë.

Après en temps réel l&#39;impact des facteurs de virulence contre le pneumocoque dans une souris modèle pneumonie aiguë avec bactéries bioluminescentes

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.0K vues.  University of Greifswald.  Streptococcus pneumoniae est l'agent pathogène menant pneumopathies sévères acquis communautaire et responsable de plus de 2 millions de décès dans le monde. L'impact des facteurs bactériens impliqués dans la virulence de remise en forme ou peut être contrôlé en temps réel dans une pneumonie ou une bactériémie modèle de souris en utilisant des bactéries bioluminescentes aiguë. 

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Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utiliser l&#39;imagerie Bioluminescent chargé d&#39;enquêter sur une synergie entre Streptococcus pneumoniae Et virus Influenza A de souriceaux

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Recherche

Immunologie et infection

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Étude des effets des probiotiques sur la colonisation pneumococcique l&#39;aide d&#39;un<em&gt; In Vitro</em&gt; Respect de dosage

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

Capsulaire sérotypage des<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilisation de la réaction Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle de T-Cell Attaque de Oligodendrocyte dirigée dans aigus tranches cérébrales

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

L&#39;application d&#39;un système d&#39;expression inductible pour étudier les interférences de facteurs de virulence bactérienne avec signalisation intracellulaire

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human diseases have been reported to be associated with four species of bacteria: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, and Aeromonas caviae. The model organism Caenorhabditis elegans is a bacterivore that provides an excellent infection model by which to study the bacterial pathogenesis of Aeromonas. Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection using a C. elegans model, including survival, liquid toxicity, and muscle necrosis assays. The results of the three methods determining the virulence of Aeromonas were consistent. A. dhakensis was shown to be the most toxic among the 4 major Aeromonas species causing clinical infections. These methods are shown to be a convenient way to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species and contribute to our understanding of the pathogenesis of Aeromonas infection.

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection in C. elegans. Using these convenient methods, it is easy to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species.

Évaluer la Virulence et la pathogenèse de l’Infection à Aeromonas dans un modèle de Caenorhabditis elegans

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

Imagerie de la production gamma d'interféron in situ dans la rate de souris suite à l'infection à Listeria monocytogenes

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

Génération de mutants de suppression de gène dans le cadre dans Pseudomonas aeruginosa et essai pour l'atténuation de virulence dans un modèle simple de souris de l'infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration through the blood-brain barrier are indispensable steps for the development of E. coli meningitis. Reactive oxygen species (ROS) represent the major bactericidal mechanisms of neutrophils to destroy the invaded pathogens. In this protocol, the time-dependent intracellular ROS production in neutrophils infected with meningitic E. coli was quantified using fluorescent ROS probes detected by a real-time fluorescence microplate reader. This method may also be applied to the assessment of ROS production in mammalian cells during pathogen-host interactions.

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli is the leading cause of neonatal Gram-negative bacterial meningitis. During the bacterial infection, reactive oxygen species produced by neutrophils play a major bactericidal role. Here we introduce a method to detect the reactive oxygen species in neutrophils in response to meningitis E. coli.

Quantification en temps réel des espèces réactives d’oxygène dans les neutrophiles infectés par escherichia coli méningitique

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a large proportion of the infecting bacteria form biofilms within airway sputum. Pa biofilms isolated from CF sputum have been shown to grow in small, dense aggregates of ~10-1,000 cells that are spatially organized and exhibit clinically relevant phenotypes such as antimicrobial tolerance. One of the biggest challenges to studying how Pa aggregates respond to the changing sputum environment is the lack of nutritionally relevant and robust systems that promote aggregate formation. Using a synthetic CF sputum medium (SCFM2), the life history of Pa aggregates can be observed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) and image analysis at the resolution of a single cell. This in vitro system allows the observation of thousands of aggregates of varying size in real time, three dimensions, and at the micron scale. At the individual and population levels, having the ability to group aggregates by phenotype and position facilitates the observation of aggregates at different developmental stages and their response to changes in the microenvironment, such as antibiotic treatment, to be differentiated with precision.

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Synthetic cystic fibrosis sputum medium (SCFM2) can be utilized in combination with both confocal laser scanning microscopy and fluorescence-activated cell sorting to observe bacterial aggregates at high resolution. This paper details methods to assess aggregate populations during antimicrobial treatment as a platform for future studies.

Outils pour l’évaluation en temps réel d’un modèle d’infection à Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...