Pesquisas em laboratório foi apoiado por subsídios da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, 3125/4-2 DFG HA) e do Ministério Federal de Educação e Pesquisa (BMBF) Genomics Infecção Médico (FKZ 0315828A) para SH.

Os experimentos de infecção de animais aqui descritos devem ser executados em estrita conformidade com o (por exemplo, o direito europeu de Saúde da Federação das Associações de Laboratório Ciência Animal (FELASA)) local e internacional diretrizes e normas para o uso de animais vertebrados. Os experimentos têm de ser aprovados pelo conselho de ética local e do Comitê Animal Care Institucional. Todas as experiências com S. pneumoniae no laboratório ou as infecções animais são conduzidos em uma Classe II Biossegurança Gabinete. 1. Preparação de Doenças Infecciosas da Bolsa de Bioluminescent Pneumocococi <ol><li> Prepare culturas estoque de pneumococos em caldo de Todd-Hewitt suplementado com 1% (w / v) de extracto de levedura e uma concentração final de 20% de glicerol para a manutenção a 80 ° C. </li><li> Placa de uma pequena quantidade de cultura de pneumococos ultracongelado sobre uma placa de agar de sangue e incubar as bactérias durante 10 horas a 37 ° C em 5% de CO 2. Tele placa de ágar de sangue contém os antibióticos adequados, tais como canamicina (150 ng / ml) para a inserção de transposões da cassete do gene luxABCDE no genoma. </li><li> Sub-cultivar uma nova colônia para uma nova placa de ágar sangue para um máximo de 10 horas. </li><li> THY inocular meio suplementado com 10% (v / v) inactivado pelo calor (30 min a 56 ° C) de soro fetal bovino (FBS) com pneumococos e iniciar a cultura a uma DO 600 de 0,05-0,07. </li><li> Incubar pneumococos, sem agitação, a 37 ° C e 5% de CO 2 até a cultura atingir uma OD 600 de 0,35-0,40. Crescimento levará entre 3-4 horas. </li><li> Colheita pneumococos por centrifugação a 3750 xg durante 10 min e ressuspender pneumococos bioluminescente em solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 (PBS) suplementada com 0,5% de FBS. </li><li> Ajustar o inoculo para a concentração desejada em PBS/10% de FBS. A dose infecção depende da cepa de pneumococo utilizado eo fundo genético do microfonee. Para infectar outbred ratinhos CD-1 por via intranasal com S. pneumoniae D39 lux a dose de infecção deve ser ajustada a 1 x 10 7 UFC de uma suspensão de 20 ul suplementados com 90 unidades de hialuronidase. Não agite ou vórtice pneumococo, uma vez que este irá desencadear autólise. </li><li> Verificar a concentração de inoculo por plaqueamento de 10 diluições em série de dobragem em agar de sangue e contagem das colónias após crescimento durante a noite a 37 ° C em 5% de CO 2. </li><li> Verifique a bioluminescência do inoculo pneumocócica medindo a bioluminescência utilizando um sistema de imagem óptica. </li></ol> 2. Intranasal e Infecção intraperitoneal de camundongos com Bioluminescent pneumococos <ol><li> Utilizar ratos fêmea consanguíneos na idade de 7-10 semanas para o modelo de pneumonia aguda e sépsis. O peso destes ratinhos deve estar entre 20-30 g. </li><li> Anestesiar ratos por injeção intraperitoneal de ketamina e xilazina. Prepara-se uma mistura de 1,0 mgde cetamina e xilazina 0,1 mg em 100 ul estéril a 0,9% (w / v) de cloreto de sódio para os ratinhos com um peso corporal de 20 g. Isto é consistente com uma dose de 50 mg / kg de peso corporal para a cetamina e 5 mg / kg de peso corporal para a xilazina. Para ser exato, pesar camundongos antes da injeção do anestésico. </li><li> Injectar a mistura na cavidade intraperitoneal e colocar os animais de volta para dentro da gaiola, até os anestésicos agem e os animais são narcotizada. A respiração dos ratos se tornará muito lento e regular. Os ratos têm de ser totalmente narcotizado, de modo que a inoculação intranasal e inalação da suspensão bacteriana não vai resultar em espirros e, portanto, a perda de inoculo. Isso pode ser avaliado por beliscar o mouse no final de sua cauda; um mouse totalmente narcotizada faltará capacidade de resposta. </li><li> Gentilmente pegar um rato narcotizada e segure o mouse entre os dedos eo polegar, com o nariz em pé (Figura 1). </li><li> Use uma pipeta com longas pontas estreitas (Gel CarregadorDicas) e soltar pneumococos bioluminescente em várias gotas pequenas para as narinas (10 mL / narina) do mouse 26-29. O rato vai involuntariamente inalar as bactérias. Segure o mouse 1-2 min na posição vertical e observar se o mouse espirra ou mantém o inóculo. </li><li> Infect 7-10 semanas de idade ratinhos CD-1 por via intranasal com uma dose de infecção de 1 x 10 7 ou 7,5 x 10 7 pneumococos da estirpe D39 e TIGR4, respectivamente, para monitorar a infecção em tempo real. O limite de detecção para o sistema sem qualquer absorção pelo tecido do hospedeiro é de cerca de 1 x 10 6 bactérias bioluminescentes. </li><li> Infectar camundongos por via intraperitoneal (IP) para avaliar e BioImage virulência do pneumococo em um modelo de infecção sepsis mouse. Use 5 x 10 3 UFC em 100 ul de D39 tensão e 1 x 10 4 de tensão TIGR4. Ratos não são anestesiados quando se utiliza a via IP. </li><li> Inocular camundongos controle com PBS. <img alt="Figura 1" fo:content-width = &quot;5 polegadas&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figura 1. Infecção intranasal de murganhos CD-1 com S. pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . </li></ol> 3. Visualizando pneumocócica Divulgação no Pulmão e Sangue Utilizando o Sistema de Imagem Imagem de divulgação de pneumococos após a infecção intranasal de camundongos fêmeas outbred CD1 em tempo real usando um sistema de imagem in vivo. <ol><li> Ligue o sistema de imagem e iniciar o software de análise de imagem localizado no computador pré-configuração. </li><li> O sistema de imagem inicia automaticamente e a câmara CCD é termoelectricamente arrefecido a 90 ° C antes de ser activo. </li><li> As configurações e binning depender do número de ratinhos medidoe, simultaneamente, com a força do sinal bioluminescente. O campo de visão (FOV) para monitorar a bioluminescência dos animais é variável ea ampliação varia entre um FOV de 22,5 cm a medir cinco ratos, e um FOV de 3,9 cm para medir um único rato ou partes do animal como o peito ou na cabeça. </li><li> Use rotineiramente um tempo de exposição de 1 min, um grau médio de binning, e um FOV de 22,5 cm (conjunto D). Em primeiro lugar, selecione o modo de imagem luminescente e, em seguida, definir os parâmetros de imagem. </li><li> A emissão do sinal pode depender da estirpe bacteriana e estirpe de ratinhos utilizada, e o pigmento do rato. Raspar o peito dos ratos quando se utiliza por exemplo, ratinhos C57BL / 6, o que pode ser vantajoso na obtenção de imagens do desenvolvimento da pneumonia nestes ratinhos. </li><li> Imagem ratinhos infectados, a intervalos de tempo previamente escolhida. Medir a bioluminescência de ratos no modelo de pneumonia aguda em intervalos de tempo de 8-12 horas no máximo. Monitorar também o bem-estar de camundongos infectados por observing sua aparência, comportamento e determinação da perda de peso. </li><li> Anestesiar os ratos na câmara narcótico do sistema de anestesia do equipamento de imagem antes das medições na câmara. Comece a inalação de uma mistura de isoflurano e oxigênio e esperar até que os camundongos respirar lenta e regularmente. </li><li> Coloque animais anestesiados para a câmara de formação de imagens do sistema e manter os ratos na posição supina. A câmara CCD sobre a parte superior da câmara será então a imagem do tracto respiratório murino. </li><li> Colocar os animais com o seu nariz em tubos para permitir a inalação do anestésico. </li><li> Isoflurano entrada para a câmara de imagiologia por meio de uma tubagem de gás é permitido para manter a anestesia. </li><li> Para ativar a câmera CCD no topo da câmara e começar a imagem óptica bioluminescente, pressione &quot;Acquire&quot; no software de imagem. Imediatamente uma fotografia dos ratinhos na câmara fechada, aparece no ecrã. Após um minuto de<html> medição uma sobreposição dos dados bioluminescência ea foto é mostrada. </li><li> Pare de anestesia após a sobreposição de imagem aparece na janela do software e colocar os ratos de volta em suas gaiolas. </li><li> Ratos são monitorados para a recuperação. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Anestesia e monitoramento de camundongos infectados com pneumococos bioluminescente utilizando a anestesia eo sistema IVIS IVIS Spectrum, respectivamente. A) O sistema IVIS Spectrum imagem. B) O sistema de anestesia IVIS com a câmara de incubação. C) Ratos anestesiados na câmara de incubação . D) Ratos localizado no interior da câmara IVIS Espectro de imagem com o nariz a inalação do anestésico._blank &quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. </li></ol> 4. Quantificação e Avaliação da bioluminescência de camundongos infectados com S. Bioluminescent pneumoniae <ol><li> Determinar as intensidades de bioluminescência dos ratos ou de uma região seleccionada dos ratinhos por quantificar a emissão de fotões totais (fotões / sec) usando o software de análise de imagem. </li><li> Use os valores da emissão de fótons que são fornecidos em uma folha de dados do Excel para preparar um gráfico. Uma vez que a variação de dados é frequentemente elevado nos ratinhos agrupados, gerar um gráfico de caixa suiça para mostrar as diferenças de ratinhos infectados com diferentes estirpes de pneumococos. </li><li> Proporcionar os fotões por ratinhos ou alternativamente os resultados como a média de brilho (fotões / sec / cm 2 / SR) de uma área seleccionada. </li><li> Os dados de medição de ROI (região de interesse) no modo de fóton pode ser quantitativamente comparados entre diferentes em sistemas de imagem in vivo com diferente veioconfigurações ra, uma vez que as medidas em unidades de irradiação têm automaticamente em conta as definições da câmara (por exemplo, o tempo de integração, binning, f / stop, e campo de visão). </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+pneumococcal+isolates+from+pets+and+laboratory+animals.">Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Brehm, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+the+adenine+methylase+gene+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+pAM+beta+1.">Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1.</a> Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

<html> Todos os experimentos realizados em animais têm de ser aprovados pelas autoridades locais e comissões de ética. Em experiências in vivo de infecção a carga bacteriana nos vários nichos hospedeiras de animais infectados tem de ser determinada a diferentes pontos de tempo após a infecção. Sob estas condições experimentais, os animais têm de ser sacrificados antes do isolamento de bactérias a partir do sangue, a nasofaringe, lavado bronchoalvelar, ou órgãos tais como os pulmões, baço e cér...

Infecções respiratórias causadas por vírus ou bactérias continuam a ser um dos problemas adquiridas na comunidade ou clínicas mais comuns em todo o mundo, causando cerca de um terço de todas as mortes no mundo inteiro. As espécies de bactérias principais são o Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae 2. No entanto, estas espécies de bactérias são normalmente constituintes comuns da flora natural do tracto respiratório. Assim, a carga bacteriana também é de certo risco para doença invasiva e, dependendo do estado imunitário ou predisposições dos indivíduos. A colonização assintomática é acionado para infecções invasivas. Streptococcus pneumoniae é o principal patógeno da pneumonia adquirida na comunidade (PAC) e uma das causas mais comuns de bacteremia em humanos. Em indivíduos saudáveis ​​S. pneumoniae (pneumococo) são muitas vezes assintomáticas colonizadores e inofensivos do trato respiratório superior, onde são confrontados com bactérias não patogênicasda flora residente, mas também com agentes patogênicos, como Haemophilus spp. ou de Staphylococcus aureus e a primeira linha de defesa do sistema imunitário humano. A freqüência de colonização são os mais altos em crianças pequenas (37%) e ainda mais dentro de creches lotadas (58%) 3-5. A população mais jovem e os idosos, que recebe o pneumococo através da transmissão aerossol de operadoras e secreções nasofaríngeas 6, pertencem aos grupos de alto risco e vacinação utilizando uma das vacinas conjugadas pneumocócicas (PCV10 ou PCV13 em crianças e polissacarídica 23-valente PPSV23 em adultos) É recomendado nos Estados Unidos (EUA) e muitos países europeus 4. O PPSV23 cobre sorotipos responsáveis ​​por ~ 90% das doenças pneumocócicas bacteremia em os EUA e na Europa, evitando, assim, doenças pneumocócicas invasivas de forma eficiente (IPD) em adultos, enquanto as PCVs cobrir os sorotipos mais prevalentes em crianças. Consequentemente, IPD devido a tipos de vacinas (VT) são redusorotipos não incluídos na vacina ced mas exibindo um elevado potencial de virulência e resistência a antibióticos surgiram 4,7-12. A nasofaringe como o reservatório é o ponto de partida para pneumococos a se espalhar para os seios ou orelhas médias iniciando infecções locais prejudiciais. Mais importante ainda, pneumococos espalhar diretamente através das vias aéreas ao brônquios e pulmão, resultando em CAP risco de vida 4,13. Infecções pulmonares são frequentemente acompanhadas com e destruição do tecido de barreira, permitindo que o agente patogénico a propagar-se no sangue e causar IPD. As incidências de PAC e IPD são mais elevados em pessoas imunocomprometidas ou nos extremos da idade 4,13. As circunstâncias responsáveis ​​pela conversão de um comensal a um patógeno com alta virulência ainda estão em debate. No entanto, têm sido sugeridas, além mudanças na suscetibilidade do hospedeiro e adaptação evolutiva acompanhado com maior virulência eo aumento da resistência a antibióticos para ter um impacto crucial sobre PNEinfecções umococcal 14-16. O patógeno é dotado de uma multiplicidade de adesinas mediando o contato íntimo com as células epiteliais da mucosa. Depois de superar o muco das vias aéreas, a adesão às células hospedeiras pneumocócica é facilitada através de interações diretas de adesinas de superfície exposta com receptores celulares e através da exploração de componentes da matriz extracelular ou proteínas séricas como ponte moléculas 4,17,18. Patógenos tão versátil pneumococos também estão equipados com fatores envolvidos na evasão dos mecanismos de defesa do hospedeiro imune. Além disso, eles têm a capacidade de se adaptar a ambientes diversos hospedeiros, tais como o pulmão, sangue e fluido cerebrospinal (CSF), respectivamente 5,17,19,20. O impacto dos fatores bacterianos sobre patogênese e inflamatória do hospedeiro respostas é investigada em modelos animais experimentais de pneumonia, bacteremia ou meningite 21-25. Apesar de ser um patógeno humano, estes modelos são nósll-estabelecidos para decifrar tropismo pneumocócica tecidos, mecanismos de virulência, ou protectivity de vacinas pneumocócicas. O fundo genético de linhagens puras determina a susceptibilidade a pneumococos. Ratinhos BALB / c por via intranasal infectados com pneumococos foram consideradas resistentes, enquanto que a CBA / Ca e SJL ratinhos eram mais susceptíveis às infecções pneumocócicas 22. Isto implica que, semelhante aos seres humanos, o fundo genético e os mecanismos de defesa do hospedeiro determinar o resultado da infecção. Por isso, são necessárias para desvendar locos de resistência no genoma de ratinhos menos susceptíveis a infecções por pneumococos esforços suplementares. Os resultados levaram a mudanças na in vivo protocolos de virulência. Em vez dos ratinhos BALB / c consanguíneos muitas vezes utilizados no passado, as estirpes de ratinho outbred CD-1/MF1 altamente sensíveis são hoje em dia, muitas vezes utilizado para estudar o efeito de virulência ou aptidão pneumocócica perda de função factores 26-28. Além disso, a disponibilidadede pneumococos bioluminescente e técnicas de imagem óptica permite que o tempo real de bioluminescência bioimaging de infecções. Em pneumococos a cassete do gene luxABCDE optimizado (plasmídeo Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km r) foi inserido num local de integração único de cromossoma por mutagénese por transposões. Pneumococos bioluminescente têm sido empregados para avaliar a atenuação de mutantes pneumocócicas deficientes em virulência ou aptidão fatores e sua translocação de um sítio anatômico para outro 26,28-31. Aqui nós fornecemos um protocolo para a bioimaging das infecções pneumocócicas em uma pneumonia ou modelo murino sepse. A amplificação e disseminação de pneumococos bioluminescente em ratinhos por via intranasal ou por via intraperitoneal infectadas podem ser facilmente monitorizados ao longo do tempo utilizando um sistema de imagiologia óptica e do mesmo animal em diferentes pontos de tempo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="985">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Todd Hewitt broth</td>
			<td style="width:280px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">X936.1</td>
			<td style="width:280px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:280px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Blood agar plates</td>
			<td style="width:280px;">Oxoid, Wesel, Germany</td>
			<td style="width:129px;">PB5039A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:280px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:280px;">Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:129px;">E6376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:280px;">PAA Laboratories, Coelbe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">A11-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">CD-1 mice, female</td>
			<td style="width:280px;">Charles River, Sulzfeld, Germany</td>
			<td style="width:129px;">CD1SIFE06W08W</td>
			<td>female CD-1 mice, six to eight weeks old</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamin 500mg, Curamed injection solution</td>
			<td>Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Rompun 2%, injection solution</td>
			<td>Bayer Animal Health, Monheim, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Plastipak 1 ml syringes</td>
			<td>Becton Dickinson, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:129px;">300015</td>
			<td>sterile Luer-Lok&#8482; syringes with needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Gel Loader Tips</td>
			<td style="width:280px;">peqlab</td>
			<td style="width:129px;">81-13790</td>
			<td>M&#181;ltiFlex&#8482; Tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Hyaluronidase</td>
			<td style="width:280px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">H3884-100mg</td>
			<td>Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Oxygen</td>
			<td style="width:280px;">Air Liquide, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td style="width:129px;">M1001L50R2A001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Isofluoran</td>
			<td style="width:280px;">Baxter, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">pGEM-T Easy</td>
			<td style="width:280px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Oligonucleotides </td>
			<td style="width:280px;">Eurofins MWG, Ebersberg, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Qiaprep Spin Midiprep Kit </td>
			<td style="width:280px;">Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:129px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:296px;">PCR DNA purification kit</td>
			<td style="width:280px;">Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:129px;">28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:296px;">Equipment</td>
			<td style="width:280px;"> </td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Living Image 4.1 software</td>
			<td style="width:280px;">Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td style="width:280px;">Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">IVIS Spectrum Imaging System </td>
			<td style="width:280px;">Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Biophotometer</td>
			<td style="width:280px;">Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following in real time the impact of pneumococcal virulence factors in an acute mouse pneumonia model using bioluminescent bacteria

A pneumonia é um dos principais problemas de saúde nos países em desenvolvimento e países industrializados e está associada com morbidade e mortalidade considerável. Apesar dos avanços no conhecimento desta doença, a disponibilidade de unidades de terapia intensiva (UTI), eo uso de antimicrobianos potentes e vacinas efetivas, as taxas de mortalidade continuam altas 1. Streptococcus pneumoniae é o principal patógeno da pneumonia adquirida na comunidade (PAC) e uma das causas mais comuns de bacteremia em humanos. Este patógeno é equipado com um arsenal de adesinas de superfície exposta e fatores de virulência que contribuem para pneumonia e doença pneumocócica invasiva (DPI). A avaliação do papel in vivo de aptidão ou de virulência fatores bacterianos é de extrema importância para desvendar S. mecanismos de patogenicidade pneumoniae. Modelos murinos de pneumonia, bacteremia e meningite estão sendo usados ​​para determinar o impacto de fatores pneumocócicas em difrente fases da infecção. Aqui nós descrevemos um protocolo para monitorar em tempo real a divulgação pneumocócica em ratos após intranasal ou infecções intraperitoneais com bactérias bioluminescentes. Os resultados mostram a multiplicação e difusão de pneumococos no tracto respiratório inferior e do sangue, que pode ser visualizado e avaliada utilizando um sistema de imagem e o software de análise que a acompanha.

A aquisição e absorção de metionina é de importância central para pneumococos para manter a forma em seu nicho de acolhimento 32,33. A metionina ABC transportador lipoproteína é codificado em D39 pelo SPD _ 0151 gene (TIGR4: sp_0149) e nomeado METQ 32. Os pneumococos produzir mais enzimas de biossíntese de metionina (D39: Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, mete e MetF). A falta de metionina num meio quimicamente definido afecta o crescimento de pneumoc...

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Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Streptococcus pneumoniae é o patógeno principal causador da pneumonia adquirida na comunidade grave e responsável por mais de 2 milhões de mortes em todo o mundo. O impacto dos fatores bacterianos implicados em fitness ou virulência pode ser monitorado em tempo real em uma pneumonia ou bacteremia modelo aguda mouse usando bactérias bioluminescentes.

A seguir em tempo real o impacto de fatores de virulência do pneumococo em um mouse Pneumonia aguda Modelo Usando bactérias bioluminescentes

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.0K visualizações.  University of Greifswald.  Streptococcus pneumoniae é o patógeno principal causador da pneumonia adquirida na comunidade grave e responsável por mais de 2 milhões de mortes em todo o mundo. O impacto dos fatores bacterianos implicados em fitness ou virulência pode ser monitorado em tempo real em uma pneumonia ou bacteremia modelo aguda mouse usando bactérias bioluminescentes. 

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Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Usando imagens Bioluminescent para Investigar sinergismo entre Streptococcus pneumoniae E Vírus da Influenza A em Ratos infantil

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Imunologia e Infecção

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Investigando os efeitos dos probióticos sobre pneumocócica Colonização Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Adesão Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

A sorotipagem capsular de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Usando o Reaction Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de um Ataque de T-Cell dirigiu-Oligodendrocyte em Agudos fatias de cérebro

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human diseases have been reported to be associated with four species of bacteria: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, and Aeromonas caviae. The model organism Caenorhabditis elegans is a bacterivore that provides an excellent infection model by which to study the bacterial pathogenesis of Aeromonas. Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection using a C. elegans model, including survival, liquid toxicity, and muscle necrosis assays. The results of the three methods determining the virulence of Aeromonas were consistent. A. dhakensis was shown to be the most toxic among the 4 major Aeromonas species causing clinical infections. These methods are shown to be a convenient way to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species and contribute to our understanding of the pathogenesis of Aeromonas infection.

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection in C. elegans. Using these convenient methods, it is easy to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species.

Avaliando virulência e patogênese da infecção por Aeromonas em um modelo de Caenorhabditis elegans

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

Imagem latente da produção in situ da gama do interferon no spleen do rato depois da infecção dos monocytogenes de Listeria

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

Geração de mutantes de deleção de genes no quadro em Pseudomonas aeruginosa e testes para atenuação de virulência em um modelo simples de infecção por camundongos

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration through the blood-brain barrier are indispensable steps for the development of E. coli meningitis. Reactive oxygen species (ROS) represent the major bactericidal mechanisms of neutrophils to destroy the invaded pathogens. In this protocol, the time-dependent intracellular ROS production in neutrophils infected with meningitic E. coli was quantified using fluorescent ROS probes detected by a real-time fluorescence microplate reader. This method may also be applied to the assessment of ROS production in mammalian cells during pathogen-host interactions.

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli is the leading cause of neonatal Gram-negative bacterial meningitis. During the bacterial infection, reactive oxygen species produced by neutrophils play a major bactericidal role. Here we introduce a method to detect the reactive oxygen species in neutrophils in response to meningitis E. coli.

Quantificação em tempo real de espécies de oxigênio reativo em neutrófilos infectados com meningite escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a large proportion of the infecting bacteria form biofilms within airway sputum. Pa biofilms isolated from CF sputum have been shown to grow in small, dense aggregates of ~10-1,000 cells that are spatially organized and exhibit clinically relevant phenotypes such as antimicrobial tolerance. One of the biggest challenges to studying how Pa aggregates respond to the changing sputum environment is the lack of nutritionally relevant and robust systems that promote aggregate formation. Using a synthetic CF sputum medium (SCFM2), the life history of Pa aggregates can be observed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) and image analysis at the resolution of a single cell. This in vitro system allows the observation of thousands of aggregates of varying size in real time, three dimensions, and at the micron scale. At the individual and population levels, having the ability to group aggregates by phenotype and position facilitates the observation of aggregates at different developmental stages and their response to changes in the microenvironment, such as antibiotic treatment, to be differentiated with precision.

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Synthetic cystic fibrosis sputum medium (SCFM2) can be utilized in combination with both confocal laser scanning microscopy and fluorescence-activated cell sorting to observe bacterial aggregates at high resolution. This paper details methods to assess aggregate populations during antimicrobial treatment as a platform for future studies.

Ferramentas para a avaliação em tempo real de um modelo de infecção por pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...