עבודה זו נתמכת כספית על ידי NIH (מענקים 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), פרס הקריירה של NSF (1653702) ואוניברסיטת קונטיקט.

1. סינתזה של JBNTs
הערה: מונומר JBNT הוכן כפי שפורסם בעבר11.
<ol><li>סינתזה של תרכובת A1<ol>
<li>הכן פתרון המכיל 8.50 גרם של חומצה 2-ציאנואצטית ו 9.80 גרם של אתילקרבמאט ב 25 מ"ל של טולואן ו 2.5 מ"ל של N, N-dimethylformamide. הוסף 4.90 מ"ל של זרחן כלוריד dropwise. לאחר מכן מחממים את התערובת ל 70 מעלות צלזיוס וממשיכים לבחוש במשך 1.5 שעות.</li>
		<li>מצננים את תערובת התגובה לטמפרטורת החדר ויוצקים פנימה 100 גרם מי קרח. לחלץ את השכבה מימית עם אצטט אתיל (3 x 250 מ"ל), ולשטוף עם 100 מ"ל של מלח. יבשו את השכבה האורגנית מעל נתרן גופרתי נטול מים, מסננים ומאדים נדיפים תחת ואקום כדי לקבל מוצק צהוב חיוור.</li>
		<li>הכפפ את המוצק הצהוב לכרומטוגרפיה של עמודת פלאש ג'ל סיליקה (3% מתנול/דיכלורומתאן) כדי להניב 15.61 גרם של תרכובת A1 כאבקה לבנה.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A2<ol>
<li>מערבבים 3.12 גרם של תרכובת A1 ו 2.75 גרם של אשלגן פחמתי ב 50 מ"ל של N, N-דימתילפורממיד. מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות.</li>
		<li>הוסף 2.6 מ"ל של פחמן דיסולפיד להשעיית התגובה. ממשיכים לבחוש במשך 4 שעות.</li>
		<li>מוסיפים אתנול מוחלט לתערובת התגובה ב 0 מעלות צלזיוס. מסננים את הצהוב מזרזים החוצה ולשטוף עם אתר diethyl. יבש תחת ואקום בן לילה כדי להניב 6.18 גרם של תרכובת A2 כמו מוצק צהוב חיוור.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A3<ol>
<li>הוסף 2.7 מ"ל של מתיל יודיד ב 15 מ"ל של אצטוניטריל. כמו כן, בנפרד להכין פתרון של תרכובת A2 על ידי הוספת 6.18 גרם של A2 כדי 80 מ"ל של מים / אצטוניטריל (יחס 7:3). מערבבים את שני הפתרונות ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.</li>
		<li>מחממים את תערובת התגובה ל 95 מעלות צלזיוס וממשיכים לבחוש במשך 3 שעות.</li>
		<li>מצננים את תערובת התגובה לטמפרטורת החדר, ואז מתאדים את הנדיפים תחת ואקום.</li>
		<li>לחלץ את השאריות 3x עם 100 מ"ל של אתיל אצטט ולשטוף עם מלח. יבש את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי נטול מים, סנן ואייד את הנדיפים תחת ואקום כדי להשיג מוצק צהוב.</li>
		<li>הכפיף את מוצק צהוב כדי כרומטוגרפיה עמוד פלאש ג'ל סיליקה (30% אתיל אצטט / הקסנים) כדי להניב 4.52 גרם של המתחם A3 כמו מוצק צהוב בהיר.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A4<ol>
<li>הכן פתרון אליאמין על ידי הוספת 925 μL של אליאמין ב 20 מ"ל של אתנול. הוסף פתרון זה dropwise לפתרון של תרכובת A3, מוכן על ידי הוספת 3.14 גרם של A3 ב 75 מ"ל של אתנול מוחלט, מעל 30 דקות. לאחר מכן מחממים את תערובת התגובה לרפלוקס במשך 16 שעות.</li>
		<li>מצננים את תערובת התגובה לטמפרטורת החדר ומאדים את הנדיפים כדי לתת מוצק צהוב.</li>
		<li>הכפפ את המוצק הצהוב לכרומטוגרפיה של עמודת פלאש ג'ל סיליקה (50% אתיל אצטט/הקסנים ל-2% מתנול/דיכלורומתאן) כדי להניב 1.80 גרם של תרכובת A4 כקריסטל לבן.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A5<ol>
<li>הוסף 2.05 גרם של גואנידיניום הידרוכלוריד ו 7.8 מ"ל של נתרן אתוקסיד (21 wt% באתנול) ב 14 מ"ל של אתנול מוחלט. מחממים את התערובת ל 45 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.</li>
		<li>לסנן את החומר מסיס ולהוסיף את הסינון ישירות לתוך הפתרון של תרכובת A4, מוכן על ידי הוספת 2.70 גרם של A4 ב 40 מ"ל אתנול מוחלט. מחממים את תערובת התגובה לרפלוקס במשך 16 שעות.</li>
		<li>לסנן את המשקעים החוצה כדי לקבל 2.65 גרם של תרכובת A5 כמו מוצק לבן.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A6<ol>
<li>הוסף 24.9 מ"ל של טריאתילאמין לאט לתערובת תרחיף המתקבל על ידי הוספת 2.11 גרם של תרכובת A5 ו 1.10 גרם של 4-דימתילאמינופירידין ב 120 מ"ל של טטרהידרופורן מעל 1 דקות. מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות.</li>
		<li>מוסיפים 20.7 מ"ל של די-טרט-בוטיל דיקרבונט לתערובת התגובה וממשיכים לבחוש בטמפרטורת החדר במשך 40 שעות.</li>
		<li>הוסף 20 מ"ל של מים כדי להרוות את התגובה. לאדות את volatiles תחת ואקום.</li>
		<li>לחלץ את שאריות צמיג אדום עם 500 מ"ל של אתיל אצטט. לאחר מכן, לשטוף אותו עם 250 מ"ל של מים, 75 מ"ל של 10% חומצת לימון, 2x עם 200 מ"ל של מים, 200 מ"ל של סודיום ביקרבונט רווי, ו 200 מ"ל של מלח. יבשו את השכבה האורגנית מעל נתרן גופרתי נטול מים, מסננים ומאדים את הנדיפים תחת ואקום כדי לתת מוצק אדום/כתום.</li>
		<li>הכפיף את מוצק chromatography עמוד פלאש ג'ל סיליקה (0-20% אתיל אצטט / הקסנים) כדי להניב 3.87 גרם של תרכובת A6 כמו קצף לבן.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A7<ol>
<li>הוסף N-מתילמורפוליין N-תחמוצת (50 wt.% במים, 1.64 מ"ל) dropwise לפתרון של תרכובת A6 (2.93 גרם) באצטון / מים (8:1, 58.5 מ"ל) ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
		<li>מוסיפים אוסמיום טטראוקסיד (4% פתרון מימי) טיפה לתערובת על פני תקופה של 3 דקות וממשיכים לבחוש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות.</li>
		<li>להרוות את התגובה עם 1.0 M מימית נתרן גופרתי עד הפתרון הופך חסר צבע. הסר את volatiles תחת ואקום כדי לגרום תרחיף לבן במים. לחלץ את השאריות עם 350 מ"ל של dichloromethane ולאחר מכן לשטוף עם 150 מ"ל של מים ואחריו לשטוף עם 150 מ"ל של מלח.</li>
		<li>יבש את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי נטול מים, סנן ואייד את הנדיפים תחת ואקום כדי להניב 2.45 גרם של תרכובת A7 כמוצק לבן.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A8<ol>
<li>הוסף 760 גרם של תקופת נתרן לתערובת של 1.36 גרם של תרכובת A7 ב 35 מ"ל של דיכלורומתאן / מים (6:1, 35 מ"ל) ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 42 שעות.</li>
		<li>מסננים את החומר הבלתי מסיס ומרכזים את הסינון תחת ואקום. לחלץ את השאריות וכתוצאה מכך עם 250 מ"ל של dichloromethane, ולאחר מכן לשטוף עם 100 מ"ל של מים ו 100 מ"ל של מלח. יבש את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי נטול מים, סנן ואייד את הנדיפים תחת ואקום כדי לתת את המוצר הגולמי.</li>
		<li>הכפפ את המוצר הגולמי לכרומטוגרפיה של עמודת פלאש ג'ל סיליקה (5-40% אתיל אצטט/הקסנים, ולאחר מכן 5% מתנול/דיכלורומתאן) כדי להניב 1.08 גרם של תרכובת A8.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A9<ol>
<li>הכן פתרון של 830 מ"ג של תרכובת A8 ב 15 מ"ל של 1,2-dichloroethane. הוסף את הפתרון של dropwise לתערובת של 6-בנזילוקסיקקרבונילמינו-2-L-אמינו-hexanoic חומצה טרימתילסיליל אתיל אסתר (649.5 מ"ג) ו N,N-diisopropylethylamine (591 μL) ב 24 מ"ל של 1,2-dichloroethane מעל 3 דקות ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.</li>
		<li>מוסיפים 360.3 מ"ג נתרן triacetoxyborohydride לפתרון וממשיכים לבחוש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות.</li>
		<li>להרוות את תערובת התגובה עם 6 מ"ל של מים. לחלץ את תערובת התגובה 3x עם 200 מ"ל של דיכלורומתאן ולשטוף עם 200 מ"ל של 10% חומצת לימון במים, 2x עם 200 מ"ל מים, 200 מ"ל של סודיום ביקרבונט רווי, ו 200 מ"ל של מלח בסדר זה. יבש את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי נטול מים, סנן ואייד את הנדיפים תחת ואקום כדי להשיג את המוצר הגולמי.</li>
		<li>הכפיפה את המוצר הגולמי כרומטוגרפיה עמוד פלאש ג'ל סיליקה (5-30% אתיל אצטט / הקסנים) להניב 885 תרכובת מ"ג A9.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של מונומר JBNT<ol>
<li>להמיס 0.54 גרם של תרכובת A9 (0.54 גרם) ב 10 מ"ל של 94% תמיסת חומצה trifluoroacetic / thioanisole ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 72 שעות.</li>
		<li>מוסיפים אתר diethyl (80 מ"ל) לתערובת התגובה וצנטריפוגה משקעים למטה. יוצקים את החומצה trifluoroacetic ברור המכיל supernatant החוצה ולשטוף את המשקעים הלבנים עם אתר diethyl ומתנול להניב 168.6 מ"ג מונומר JBNT גס (קובץ משלים 1).</li>
		<li>טיהור מונומר JBNT גולמי על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) עם עמודת פאזה הפוכה. תוכנית הבידוד מפורטת להלן: ממס A: 100% מים; ממס B: 100% אצטוניטריל; ממס C: pH = 1 פתרון מים HCl; קצב זרימה: 3 מ"ל / דקה (ראה טבלה 1).</li>
		<li>לאסוף את הפסגה הגדולה ביותר בערך 7.2 דקות.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ייצור עבור JBNT / FN
<ol><li>הוסף 80 μL של 1 מ"ג / מ"ל JBNT פתרון מימית 40 μL של 1 מ"ג / מ"ל FN פתרון מימית פיפטה מספר פעמים.</li>
	<li>בדוק אם יש נוכחות של מתלה מוצק לבן לאחר pipetting במשך כ 10 s. הערה: סרטון צולם כדי ללכוד את תהליך ההרכבה העצמית של NM (קובץ משלים 2).</li>
</ol>3. התבוננות בדגימות לויאופיליות
הערה: שלב זה מבוצע כדי להציג את מבנה הפיגומים של NM עשוי JBNTs ו- FN.
<ol><li>הכן פתרונות FN, JBNT ו- FN / JBNT NM לתצפית חומרים ליאופיליים. לדלל 10 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל של FN עם 40 μL של מים מזוקקים לעשות פתרון 20 מיקרוגרם / מ"ל של FN.</li>
	<li>הכן 100 מ"ג / מ"ל פתרון של JBNTs על ידי דילול 5 μL של 1 JBNTs מ"ג / מ"ל ב 45 μL של מים DI.</li>
	<li>מערבבים 10 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל FN ו 5 μL של 1 מ"ג / מ"ל של JBNTs ב 35 μL של מים DI כדי ליצור את הפתרון NM.</li>
	<li>מעיל שלוש בארות של מיקרופלטות עגולות עגולות ברורות 96-היטב עם FN, פתרון JBNT ופתרון NM, בהתאמה. כל באר מקבלת 50 μL של הפתרון.</li>
	<li>בצע lyophilization, כמתואר להלן, כדי לדמיין את מבנה הפיגומים של NM.<ol>
<li>להקפיא את הצלחת ב -80 מעלות צלזיוס לילה.</li>
		<li>הפעל את המכשיר lyophilized ומשאבת ואקום.</li>
		<li>לחץ על כפתור הקירור כדי להפחית את הטמפרטורה של המערכת ל -50 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>מכניסים את הצלחת הקפואה לתוך המכשיר lyophilized ולסגור את כל פתחי המכשירים.</li>
		<li>לחץ על לחצן התחל כדי להפחית את לחץ המערכת ל- 0.9 mbar.</li>
		<li>לאחר 4 שעות, לחץ על כפתור aerate ולפתוח את השסתום כדי להגביר את לחץ המערכת ללחץ האטמוספרי.</li>
		<li>תוציא את הצלחת מהמכשיר הליאופילי.</li>
		<li>השתמש במיקרוסקופ כדי להתבונן ב- FN, JBNTs וב- NM שהרכיב את עצמו. צלם מספר תמונות עם מצלמה לחומרים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. מדידת ספקטרום ספיגה
הערה: השתמש בשינוי הספקטרום עבור FN ו- JBNTs כדי להציג את JBNT / FN NM12שהרכיב את עצמו .
<ol><li>מערבבים 30 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל FN עם 15 μL של מים מזוקקים ו 5 μL של 1 מ"ג / מ"ל JBNTs להכין את הפתרון JBNT / FN NM. השעיה מוצקה לבנה ניתן לראות לאחר pipetting הפתרון מספר פעמים. הערה: הריכוזים הסופיים של JBNTs ו- FN בתמיסה הם 100 מיקרוגרם / מ"ל ו 60 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה. פתרונות JBNTs ו- FN באותו ריכוז לזה המשמש בפתרון NM הוכנו גם כפתרונות בקרה.</li>
	<li>לדלל 5 μL של 1 מ"ג / מ"ל של JBNTs עם 45 μL של מים מזוקקים כדי להכין פתרון בקרת JBNT.</li>
	<li>לדלל 30 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל FN עם 20 μL של מים מזוקקים כדי להכין את פתרון בקרת FN.</li>
	<li>למדוד את ספקטרום הספיגה UV-vis של פתרונות FN, JBNT ו JBNT / FN NM עם ספקטרופוטומטר (ראה טבלה של חומרים)כדי לאפיין את ההרכבה של NM.<ol>
<li>לחץ על לחצן UV-Vis. לנקות את משטח הבדיקה של ספקטרופוטומטר ושחרר 2 μL של מים מזוקקים על זה. למדוד אותו ריק מ 190-850 ננומטר.</li>
		<li>לנקות את משטח הבדיקה של ספקטרופוטומטר ושחרר 2 μL של פתרון FN על זה. למדוד את ספקטרום הספיגה UV-Vis של פתרון FN מ 190 ננומטר עד 850 ננומטר.</li>
		<li>לנקות את משטח הבדיקה של ספקטרופוטומטר ושחרר 2 μL של פתרון JBNT על זה. למדוד את ספקטרום הספיגה של פתרון JBNT מ 190 ננומטר ל 850 ננומטר.</li>
		<li>לנקות את משטח הבדיקה של ספקטרופוטומטר ושחרר 2 μL של פתרון JBNT / FN NM על זה. למדוד את ספקטרום הספיגה של פתרון JBNT / FN NM מ 190 ננומטר ל 850 ננומטר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. הכנת JBNT / FN NM להעברת מיקרוסקופיה אלקטרונית (TEM)
<ol><li>נקה מספר רשתות לפני כתמים שליליים עם מנקה פלזמה בסיסי (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>בצע את הכתמים השליליים לדגימות לאחר שני תהליכים שונים.<ol>
<li>שחרר 3 μL של 1 מ"ג / מ"ל של פתרון מימי JBNTs ו 3 μL של פתרון JBNT / FN NM על רשתות מופרדות ולהשאיר אותו במשך 2 דקות. לאחר מכן לשטוף כל רשת עם 100 μL של 0.5% Uranyl אצטט (UA) פתרון. מסננים את הפתרון העודף עם נייר מסנן ואוויר לייבש את הרשתות.</li>
		<li>לערבב 9 μL של פתרון JBNT / FN NM עם 3 μL של 2.0% פתרון UA ופיפט אותו מספר פעמים. פיפטה הפתרון המעורב על הרשתות ולשמור אותו על הרשתות במשך 2 דקות. השתמש בנייר סינון כדי להסיר את הפתרון המעורב מהרשתות ולייבש את הרשתות בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבסוף, לאפיין את הדגימה עבור JBNTs, JBNT / FN NM מוכתם בשלב 5.2.1, ו JBNT / FN NM מוכתם עם שלב 5.2.2 עם TEM.</li>
</ol>6. במבחנה ביולוגית פונקציה מבחנה
<ol><li>הוסף 200 μL של פקדים שליליים (NC, PBS), JBNTs, FN ופתרונות JBNT / FN NM לבאר אחת של שקופית 8 בארות, בהתאמה.</li>
	<li>להקפיא לייבש את כיסוי 8-היטב תאים עם המכשיר lyophilized לציפוי חומרים בתחתית בארות. הפרוטוקול לייבוש הקפאה זהה לשלב 3.5.</li>
	<li>לאחר מכן להוסיף 10,000 תאים / בארות hMSCs (מעבר 3) לתוך הבארות ולהדגיר אותם במשך 24 שעות ב 37 °C (69 °F) עם 5% CO2.</li>
	<li>לאחר הדגירה, פיפטה את מדיום תרבות התא מן הבארות ולשטוף את התרבות עם פתרון 1x PBS.</li>
	<li>הוסף 100 μL של הפתרון המתקן לכל באר עם תאים ולהשאיר במשך 5 דקות. יש לשטוף את התאים בעדינות עם 1x PBS פעמיים.</li>
	<li>מדללים 1% טריטון-X 100 עד 0.1%. הוסף 100 μL של 0.1% טריטון-X 100 לכל באר עם תאים ולהשאיר במשך 10 דקות. יש לשטוף את התאים בעדינות עם 1x PBS פעמיים.</li>
	<li>לדלל את הרודמין Phalloidin ל 1.65 מיקרומטר. להוסיף 100 μL של רודמין Phalloidin לכל באר עם תאים דגירה כיסוי התאי שמירה על אור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. יש לשטוף את התאים בעדינות עם 1x PBS פעמיים.</li>
	<li>לכוד את תמונות התא באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
	<li>ספירת מספרי התאים בתמונות פלואורסצנטיות עבור כל קבוצה. לחשב את צפיפות הידבקות התא על ידי ממוצע של שלושה אזורים אקראיים בכל באר.</li>
	<li>הצג את כל הנתונים כסטיית תקן (SD) ± ממוצעת. בצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות מבחן t חד-זנבי, ואחריו ניתוח שונות (ANOVA) עם p<0.05, הנחשב מובהק סטטיסטית.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+mobilization+of+exogenous+mesenchymal+stem+cells+to+bone+for+fracture+healing+and+sex+difference.">Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference.</a> Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).</li><li>Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+vitronectin+and+collagen+I+promotes+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).</li><li>Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+convergence+of+fracture+repair+and+stem+cells:+interplay+of+genes,+aging,+environmental+factors+and+disease.">The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).</li><li>De Becker, A., Riet, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homing+and+migration+of+mesenchymal+stromal+cells:+How+to+improve+the+efficacy+of+cell+therapy.">Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy.</a> World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).</li><li>Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+encapsulate+and+slowly+release+dexamethasone.">Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).</li><li>Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+for+incorporating+hydrophobic+drugs+in+physiological+environments.">Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).</li><li>Fenniri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+Rosette+Nanotubes:+Design,+Self-Assembly,+and+Characterization.">Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotube/hydrogel+composites+for+cartilage+tissue+engineering.">Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).</li><li>Van den Bogaerdt, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+cross-linking+by+adipose-derived+mesenchymal+stromal+cells+and+scar-derived+mesenchymal+cells:+Are+mesenchymal+stromal+cells+involved+in+scar+formation.">Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).</li><li>Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+molecule+visualized+in+electron+microscopy:+a+long,+thin,+flexible+strand.">Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand.</a> Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).</li><li>Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> U. S. Patent. , (2017).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+biomimetic+Nano-Matrix+for+stem+cell+Anchorage.">Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage.</a> Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).</li><li>Jones, M., Leroux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+micelles+-+a+new+generation+of+colloidal+drug+carriers.">Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).</li><li>Singh, P., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+and+stem+cell+differentiation+-+lessons+from+chondrogenesis.">Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).</li><li>Martino, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+integrin+specificity+and+stem+cell+differentiation+in+2D+and+3D+environments+through+regulation+of+fibronectin+domain+stability.">Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability.</a> Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).</li><li>Somaiah, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+promotes+higher+adhesion,+survival+and+proliferation+of+mesenchymal+stem+cells.">Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells.</a> PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).</li><li>Ogura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow+and+enhancement+of+cell+attachment+by+fibronectin.">Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin.</a> Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).</li><li>Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Printing+of+scaffolds+for+tissue+regeneration+applications.">3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+and+functionally+optimized+silk-fibroin-gelatin+scaffold+using+3D+printing+to+repair+cartilage+injury+in+vitro+and+in+vivo.">Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo.</a> Advanced Material. 29, 1701089 (2017).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+inflammatory+activation+by+self-assembling+Rosette+nanotubes+in+human+Calu-3+pulmonary+epithelial+cells.">Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells.</a> Small. 4 (6), 817-823 (2008).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosette+nanotubes+show+low+acute+pulmonary+toxicity+in+vivo.">Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).</li></ol>

ד"ר יופנג צ'ן הוא מייסד שותף של NanoDe Therapeutics בע"מ.

במחקר זה פיתחנו NM ביומימטי בהרכבה עצמית, אשר נוצר עם JBNTs בהשראת DNA ו- FN. בעת הכנת פתרון JBNT, אבקת lyophilized JBNT צריך להיות מומס לתוך המים במקום PBS כי PBS יגרום agglomeration של JBNTs, אשר מעכב את ההרכבה שלהם. יתר על כן, NM צריך גם להיות מורכב במים אם אנחנו רוצים לבחון את המבנים ננו סיבי של NM, כי המלח ב- PBS יהיה צרור ע...

תאי גזע mesenchymal האנושי (hMSCs) הראו את הפוטנציאל להתחדשות עצמית ובידול עצמי לאורך שושלת mesenchymal שונים, אשר מסייע התחדשות ותחזוקה שלרקמות 1. בהתבסס על פוטנציאל הבידול, hMSCs נחשבים כמועמדים לפציעות רקמה mesenchymal וטיפול בהפרעה hematopoietic2. hMSCs הראו את היכולת לקדם ריפוי פצעים על ידי הגדלת תיקון רקמות, אנגיוגנזה, והפחתת דלקת3. עם זאת, ללא סיוע ביוכימי או ביו-חומרים, היעילות של hMSCs להגיע לרקמת יעד ולתפקד במיקום הרצוי היא נמוכה4. למרות פיגומים מהונדסים שונים נוצלו כדי למשוך hMSCs לדבוק בנגעים, אתרים מסוימים כגון שבר צלחת צמיחה, באמצע עצם ארוכה, אינם נגישים בקלות על ידי פיגומים קונבנציונליים מראש מפוברק, אשר לא יכול להתאים באופן מושלם לתוך אתר פצוע בצורה לא סדירה.
כאן, פיתחנו ננו-חומר ביו-מימטי שיכול להרכיב את עצמו במקום ולהזריק אותו לאזור מטרה שקשה להגיע אליו. NM ביו פיגום להזרקה מורכב צינורות בסיס יאנוס (JBNTs) ו פיברונקטין (FN). JBNTs, הידוע גם בשם צינורות רוזט (RNTs), נגזרים זוגות בסיס DNA, במיוחד תימין אדנין, כאן5,6,7. כפי שניתן לראות באיור 1, הננו-צינוריות נוצרות כאשר שש מולקולות של בסיס הדנ"א הנגזר מרכיבות את עצמן באמצעות קשרי מימן ויוצרותמישור 6. שש מולקולות נערמות זו על זו במישור באמצעות אינטראקציית pi-stacking חזקה7, אשר יכול להיות עד 200-300 מיקרומטר אורך. JBNTs נועדו לחקות מורפולוגית סיבי קולגן כך FN יגיב איתם.
FN הוא דבק במשקל מולקולרי גבוה גליקופרוטאין, אשר ניתן למצוא במטריצה חוץ תאית (ECM)9. אלה יכולים לתווך את ההחזקה של תאי גזע לרכיבים אחרים של ECM, במיוחד קולגן10. עיצבנו JBNTs לחקות סיבי קולגן באופן מורפולוגי כך FN יכול להגיב איתם כדי ליצור NM בעוד כמה שניות באמצעות מליטה noncovalent. לכן, NM הוא ביו פיגום מבטיח להיות מוזרק לתוך אתר שבר עצם כי לא יכול להיות נגיש על ידי פיגומים מפוברק קונבנציונלי. כאן, NM להזרקה מציג יכולת מצוינת כדי לשפר את מעגן hMSC במבחנה, מציג את הפוטנציאל שלהם לשמש פיגום עבור התחדשות רקמות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dichloroethane</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>39121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-cyanoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C88505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dimethylaminopyridine</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>D1450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 wells Chambered Coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>allylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>145831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentrated hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15230147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl dicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>361941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethyl acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>319902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylcarbamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHE0023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R37814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A13543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hexanes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>227064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human mesenchymal stem cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A17114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methylmorpholine N-oxide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A19802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>45385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>20012050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoryl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>347825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse phase column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25305-154630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silica gel</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>S0821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium ethoxide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L13083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium periodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium sulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium triacetoxyborohydride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer(NanoDrop One/One&#7580; UV-Vis)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem Cell Growth Medium BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thioanisole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T28002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>toluene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triethylamine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion

NM ביומימטי פותחה כדי לשמש פיגום ביולוגי הנדסת רקמות, אשר יכול לשפר את עגינה תאי גזע. ה- NM הביומימטי נוצר מ- JBNTs ו- FN באמצעות הרכבה עצמית בתמיסה מימית. JBNTs למדוד 200-300 מיקרומטר אורך עם ערוצי חלול הידרופובי פנימי משטחים הידרופיליים החיצוניים. JBNTs מחויבים באופן חיובי ו- FNs מחויבים באופן שלילי. לכן, כאשר מוזרק לתוך פתרון מימית ניטרלי, הם מלוכדים יחד באמצעות מליטה noncovalent כדי ליצור את חבילות NM. תהליך ההרכבה העצמית הושלם תוך שניות ספורות ללא יוזמים כימיים, מקור חום או אור UV. כאשר רמת ה- pH של פתרון NM נמוכה מהנקודה האיזואלקטרית של FNs (pI 5.5-6.0), חבילות NM יופצו באופן עצמאי עקב נוכחות של FN טעון באופן חיובי.
NM ידוע לחקות את המטריצה חוץ תאית (ECM) מורפולוגית ולכן, יכול לשמש פיגום להזרקה, אשר מספק פלטפורמה מצוינת כדי לשפר את הידבקות hMSC. ניתוח צפיפות התא וניסויי הדמיית פלואורסצנטיות הצביעו על כך שה- NMs הגדילו באופן משמעותי את העיגון של רכיבי HMSCs בהשוואה לבקרה השלילית.

המחקרים שלנו גילו כי היווצרות NM של JBNTs ו FN הוא מהיר, אשר קרה ב 10 שניות. כפי שמוצג באיור 2, פלוקולה לבנה הושגה כאשר פתרון JBNT היה מעורבב עם פתרון FN ו pipetted מספר פעמים. תהליך היווצרות של NM הוא ביומימטי לחלוטין. אין צורך בגירויים חיצוניים. תהליך הייצור הוא הרבה יותר קל מזה של כמה biomater...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion at JoVE.com

Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

מטרת פרוטוקול זה היא להראות את ההרכבה של ננומטריקס ביומימטי (NM) עם צינוריות בסיס יאנוס (JBNTs) ו fibronectin (FN). כאשר הם מתרבים במשותף עם תאי גזע mesenchymal אנושי (hMSCs), NMs להפגין ביואקטיביות מעולה בעידוד הידבקות hMSCs.

ייצור ננו-מטריקס ביומימטי עם צינורות בסיס יאנוס ופיברונקטין להדבקת תאי גזע

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

fabrication-biomimetic-nano-matrix-with-janus-base-nanotubes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.0K Views.  University of Connecticut. מטרת פרוטוקול זה היא להראות את ההרכבה של ננומטריקס ביומימטי (NM) עם צינוריות בסיס יאנוס (JBNTs) ו fibronectin (FN). כאשר הם מתרבים במשותף עם תאי גזע mesenchymal אנושי (hMSCs), NMs להפגין ביואקטיביות מעולה בעידוד הידבקות hMSCs.

Video: Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

ייצור מיקרופלואידי של סיבים פולימריים וביוהיברידים עם גודל וצורה מעוצבים מראש

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and membrane environment2.
Coagulation Factor VIII (FVIII)3 is a multi-domain blood plasma glycoprotein. Defect or deficiency of FVIII is the cause for Hemophilia type A&#160;-&#160;a severe bleeding disorder. Upon proteolytic activation, FVIII binds to the serine protease Factor IXa on the negatively charged platelet membrane, which is critical for normal blood clotting4. Despite the pivotal role FVIII plays in coagulation, structural information for its membrane-bound state is incomplete5. Recombinant FVIII concentrate is the most effective drug against Hemophilia type A and commercially available FVIII can be expressed as human or porcine, both forming functional complexes with human Factor IXa6,7.
In this study we present a combination of Cryo-electron microscopy (Cryo-EM), lipid nanotechnology and structure analysis applied to resolve the membrane-bound structure of two highly homologous FVIII forms: human and porcine. The methodology developed in our laboratory to helically organize the two functional recombinant FVIII forms on negatively charged lipid nanotubes (LNT) is described.&#160;The representative results demonstrate that our approach is sufficiently sensitive to define the differences in the helical organization between the two highly homologous in sequence (86% sequence identity) proteins. Detailed protocols for the helical organization, Cryo-EM and electron tomography (ET) data acquisition are given. The two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) structure analysis applied to obtain the 3D reconstructions of human and porcine FVIII-LNT is discussed. The presented human and porcine FVIII-LNT structures show the potential of the proposed methodology to calculate the functional, membrane-bound organization of blood coagulation Factor VIII at high resolution.

We present a combination of Cryo-electron microscopy, lipid nanotechnology, and structure analysis applied to resolve the membrane-bound structure of two highly homologous FVIII forms: human and porcine. The methodology developed in our laboratory&#160;to helically organize the two functional recombinant FVIII forms on negatively charged lipid nanotubes (LNT) is described.

ארגון סליל של דם קרישת פקטור VIII ביפידים צינוריות

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

המצאה של ננוצלולוז בקטריאלי המגנטי פונקציונלי עם חלקיקים של תחמוצת ברזל

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

ייצור Biomembrane ידי השומנים bilayer (SALB) השיטה בסיוע מרכך

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

ה-DNA צינוריות כמו כלי רב-תכליתי ללמוד פולימרים Semiflexible

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

ייצור ואימות מערכת איברים על שבב עם אלקטרודות משולבת ישירות לכמת התנגדות חשמלית Transendothelial

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

ייצור של בארות Agarose מותאם אישית עבור תא זריעה וטבעת רקמות הרכבה עצמית תוך שימוש בתבניות מודפס 3D

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are an emerging treatment for photoreceptor degenerative diseases that seek to restore vision by artificially stimulating the surviving retinal neurons in the hope of eliciting comprehensible visual perception in patients. Current retinal prostheses have demonstrated success in restoring limited vision to patients using an array of electrodes to electrically stimulate the retina but face substantial physical barriers in restoring high acuity, natural vision to patients. Chemical neurostimulation using native neurotransmitters is a biomimetic alternative to electrical stimulation and could bypass the fundamental limitations associated with retinal prostheses using electrical neurostimulation. Specifically, chemical neurostimulation has the potential to restore more natural vision with comparable or better visual acuities to patients by injecting very small quantities of neurotransmitters, the same natural agents of communication used by retinal chemical synapses, at much finer resolution than current electrical prostheses. However, as a relatively unexplored stimulation paradigm, there is no established protocol for achieving chemical stimulation of the retina in vitro. The purpose of this work is to provide a detailed framework for accomplishing chemical stimulation of the retina for investigators who wish to study the potential of chemical neuromodulation of the retina or similar neural tissues in vitro. In this work, we describe the experimental setup and methodology for eliciting retinal ganglion cell (RGC) spike responses similar to visual light responses in wild-type and photoreceptor-degenerated wholemount rat retinas by injecting controlled volumes of the neurotransmitter glutamate into the subretinal space using glass micropipettes and a custom multiport microfluidic device. This methodology and protocol are general enough to be adapted for neuromodulation using other neurotransmitters or even other neural tissues.

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

This protocol describes a novel method for investigating a form of chemical neurostimulation of wholemount rat retinas in vitro with the neurotransmitter glutamate. Chemical neurostimulation is a promising alternative to the conventional electrical neurostimulation of retinal neurons for treating irreversible blindness caused by photoreceptor degenerative diseases.

מתודולוגיה Neuromodulation ביונים כימית של עכברוש הרשתיות עם ה עצבי גלוטמט במבחנה

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...