עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממכון אונטריו לחקר הסרטן (# 08NOV230), קרן קנדה עבור חדשנות (# 13199), סרטן ערמונית קנדה, Janssen אונקולוגיה, התכנית למלחמה בסרטן האזורית בלונדון, ותמיכת תורמים מג&#39;ון ודונה בריסטול דרך קרן לונדון למדעי בריאות (לALA). LEL נתמך על ידי בנטינג פרדריק ומלגות לתארים מתקדמים צ&#39;רלס בסט קנדה דוקטורט פרס. ALA נתמך ניו פרס חוקר CIHR ופרס חוקר מוקדם ממשרד אונטריו של מחקר וחדשנות על ידי.

כל המחקרים בבני האדם שתוארו בכתב היד הזה בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי אדם מחקר האתיקה מועצת המנהלים של האוניברסיטה המערבית. כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להמלצות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים, על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת מערב השימוש בבעלי חי ועדת המשנה. 1. CTC ספירה סטנדרטית מדגימות דם חולה באמצעות CSS 1. איסוף דם אדם לדוגמא והכנה לעיבוד בכלי ההכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שימוש בטכניקות phlebotomy אספטיים סטנדרטיות, לצייר מינימום של 8.0 מיליליטר של דם אדם לתוך צינור CellSave 10 מיליליטר (להלן כצינור CTC חומר משמר), המכיל חומצת אתילן diaminetetraacetic (EDTA) וחומר משמר סלולארי קניינית. הפוך 5x הצינור כדי למנוע קרישת דם. דוגמאות יכולות להיות מעובד באופן מיידי או מאוחסנות בטמפרטורת חדר למשך עד 96 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Removריאגנטים CSS דואר מהמקרר ולאפשר להם לחמם לטמפרטורת חדר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה חד פעמית 10 מיליליטר וpipettor אוטומטית, לאסוף 7.5 מיליליטר של דם מצינור משמר CTC ולוותר לאט דם לתוך צינור עיבוד שכותרתו כראוי הכנת מכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 6.5 מיליליטר של חיץ דילול מדגם זה. מערבבים על ידי היפוך 5x מדגם. צנטריפוגה מדגם ב XG 800 עבור 10 דקות עם הבלם במצב &quot;כבוי&quot;. בצע את ההוראות המופיעים על מסך על מכשיר ההכנה לטעון את כל דגימות המטופל על המערכת לעיבוד. דגימות חייבות להיות מעובד בתוך 1 שעות של הכנה. </li></ol> 2. בקרת הכנה לעיבוד בכלי ההכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבולת בקבוקון השליטה ולהפוך 5x לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הפקק מבקבוקון השליטה ולמקם את צינור עיבוד הפוך הכנת מכשיר על גבי הבקבוקון הסיר את המכסה. בתנועה אחת מהירה, להפוך אתלשלוט בבקבוקון, ויוצקים את התוכן לתוך צינור העיבוד. אמנם הפוך, בעדינות קפיצית הצדדים של בקבוקון השליטה לשחרר את כל תכנים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את בקבוקון שליטה ההפוכה מצינור העיבוד, הבטחה כי נוזל לא הולך לאיבוד ומניח בצד. בעזרת פיפטה 1,000 μl, לאסוף כל תוכן שנותר מהבקבוקון ואת המכסה ובעדינות פיפטה לתוך צינור העיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההוראות המופיעים על מסך על מכשיר ההכנה כדי לטעון את השליטה על המערכת לעיבוד. </li></ol> 3. סריקה לדוגמא על כלי ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההוראות המופיעים על מסך על מכשיר ההכנה לפרוק את כל הדגימות מהמערכת. באופן רופף כובע כל מחסנית מכשיר מגנטית והקש על המכשיר המגנטי באמצעות ידיים או במעבדת ספסל כדי לשחרר את כל בועות שנדבקו לקצוות של המחסנית. ברגע שכל הבועות הוסרו, בתוקף מכסה את המחסנית, להניח את המכשיר המגנטי שטוח, ואניncubate בחושך לפחות 20 דקות בטמפרטורת חדר. דגימות חייבות להיות נסרקו תוך 24 שעות של הכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כלי הניתוח ולאתחל את המנורה. ברגע שחמם (~ 15 דקות), טענת את מחסנית אימות מערכת על גבי מכשיר הניתוח ובחר את כרטיסיית בדיקת QC. בצע את ההוראות המופיעים על מסך כדי לבצע את אמצעי בקרת איכות הנדרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מדגם על כלי הניתוח ובחר את כרטיסיית בדיקת החולה. כל המידע שנשמר ממכשיר ההכנה יוצג. לחץ על התחל כדי לאתחל סריקת מדגם. המערכת תבצע מיקוד גס וגילוי קצה של מחסנית המכשיר המגנטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את כל הקצוות לפי צורך באמצעות מקשי הכיוון. בחר קבל. המערכת תבצע להתמקד בסדר ולהתחיל סריקת מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שליטה בעקבות סריקת התוצאות צריכה להיות מאומתת באמצעות הקריטריונים שהוגדרו לתאים זינקו ב גבוה (CK + DAPI + CD45 - APC +) ונמוך (CK + DAPI + CD45 - FITC + ריכוזים). מדגם מטופל בעקבות סריקת התוצאות צריך להיבדק לCTCs נתפס באמצעות הקריטריונים המוגדרים CTC (CK + DAPI + CD45 -). </li></ol> 2. אפיון CTC לסמנים המוגדר על ידי משתמש באמצעות CSS 1. הכנת סמנים מוגדר משתמש ומכשיר האתחול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנוגדן של עניין באמצעות ונד ראשי נוגדן ממס לריכוז הרצוי בכוס מגיב סמן באמצעות הנוסחה הבאה, שבו ריכוז העבודה הוא הריכוז של הנוגדנים לאחר בנוסף למדגם וריכוז המניות הוא הריכוז של נוגדנים ב כוס מגיב. לקבלת דוגמיות מרובה, להתאים את כמויות הנוגדנים כפי שמתואר בטבלה 1. מניחים את הכוס מגיב סמן למקום 1 במחסנית מגיב וload המחסנית על CSS. ריכוז מניות = (ריכוז עבודה x 850 μl) / 150 μl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם, להכין את הדגימות, ולטעון את מכשיר ההכנה כפי שמתואר בתקן הנ&quot;ל CTC ספירה מדגימות דם חולה תוך שימוש בפרוטוקול ה-CSS. כדי לאפשר תוספת סמן מותאמת אישית, בחר מוגדר משתמש Assay כאשר תתבקש לעשות זאת על ידי מכשיר ההכנה. קלט את שם הסמן ובחר שמור. כדגימות הועמסו על המכשיר, המפעיל יתבקש לציין שאמור לקבל סמן מותאם אישית על ידי בחירה כן או לא בהתאם לצורך. </li></ol> 2. סריקת מדגם של סמנים מוגדרי משתמש בכלי ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כלי הניתוח, אתחל את המנורה, ולבצע בקרת איכות ואימות מערכת כפי שתואר בסעיף 3.2 של התקן CTC הספירה מדגימות דם חולה באמצעות CSS </sטרונג&gt; פרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מדגם על כלי הניתוח ובחר בכרטיסייה ההגדרות. כדי לאתחל את ערוץ FITC, בחר CellSearch CTC כזהות קיט תחת סעיף בדיקת הפרוטוקולים. מתפריט זה, מחקר CTC בחר, לחץ על לחצן ערוך ולהגדיר את זמן החשיפה בהתאם לצורך. מומלץ כי זמן חשיפה של 1.0 שניות לא יהיה חריגה בעת שימוש בערכת CSS CTC כמו זה יכול להגדיל לדמם דרך לערוצי ניאון אחרים מנוצלים לזיהוי CTC. </li></ol> 3. עיבוד של CSSProtocol התקן לשימוש במודלים פרה מאוס ** מעובד מתוך Veridex עכבר / עכברוש CellCapture ערכה (כבר לא זמין באופן מסחרי) 1. עכבר של אוסף דם ואחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני איסוף דם, לרוץ ~ 30 μl של 0.5 M EDTA קדימה ואחורה באמצעות מחט G 22, משאיר כמות קטנה של EDTA ברכזת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">לאסוף מינימום של 50 μl של דם עכברים מעכברים שהוזרק בעבר עם תאים סרטניים אנושיים דרך נתיבים, וריד זנב, או intracardiac orthotopic. לאסוף דם מוריד saphenous (לניתוח CTC סידורי) או על ידי לנקב לב (לניתוח CTC מסוף). הסר את המחט ולוותר על דם לתוך צינור איסוף דם microtainer EDTA 1 מיליליטר. מערבבים על ידי היפוך או צינור בעדינות קפיצי למניעת קרישת דם. דם עשוי להיות מעובד באופן מיידי או מאוחסן בטמפרטורת חדר למשך עד 48 שעות הבאות התוספת של נפח שווה של חומר משמר סלולארי CytoChex. </li></ol> 2. CTC העשרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ריאגנטים CSS מהמקרר ולאפשר להם לחמם לטמפרטורת חדר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המקבילה של 50 μl של דם לזרימת x 75 מ&quot;מ 12 cytometry צינור. הוסף 500 μl של חיץ דילול מדגם זה, שוטף את כל דם שנשאר על הדפנות של הצינור. במידת צורך, ספין צנטריפוגות קצרניתן להשתמש בם כדי לאסוף את כל דם שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבולת ferrofluid אנטי EpCAM ולהוסיף 25 μl לכל דגימה על ידי הצבת קצה פיפטה ישירות לתוך המדגם. הוסף 25 μl של מגיב שיפור לכידת ומערבולת בעדינות לתערובת. דגירה דגימות בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צינורות מדגם לתוך המגנט ודגירה של 10 דקות. בעוד צינורות המדגם עדיין במגנט, להשתמש פיפטה זכוכית כדי לשאוב בזהירות את הנוזל שיורית בלי לגעת בקיר של הצינור ליד המגנט וזורק. </li></ol> 3. CTC מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינורות מדגם מהמגנט וresuspend ב 50 μl של חומצות גרעין דאי, 50 μl של הכתמה מגיב, 1.5 μl של אנטי עכבר CD45-APC, 5.0 μl של אנטי אנושי HLA-Alexa פלואוריד 488, ושל permeabilization 100 μl מגיב. לקבלת דוגמיות מרובה, ריאגנטים אלה עשויים להיות מעורבבים מראש ו206.5 μl של תערובת ניתן להוסיף לכל מבחנה. מערבולת בעדינות לתערובתדגירה עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של חיץ דילול, מערבולת בעדינות, דוגמיות המקום אל המגנט, ודגירה של 10 דקות. בעוד צינורות המדגם עדיין במגנט, להשתמש פיפטה זכוכית כדי לשאוב בזהירות את הנוזל שיורית בלי לגעת בקיר של הצינור ליד המגנט וזורק. הסר את צינורות מדגם מהמגנט וresuspend ב350 μl של חיץ דילול. מערבולת בעדינות לתערובת. </li></ol> 4. טעינת התקנים מגנטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קצה טעינת ג&#39;ל, מעביר בזהירות את כל הנפח מצינור המדגם לתוך מחסנית במכשיר המגנטי. התחל בתחתית המחסנית ולסגת באיטיות את הקצה כמדגם הוא לוותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל הדגימה הועברה, באופן רופף מכסה את מחסנית המכשיר המגנטית והקש על המכשיר המגנטי באמצעות ידיים או במעבדת ספסל כדי לשחרר את כל בועות שנדבקו לקצוות של המחסנית, כמתואר בsection 3.1 של התקן CTC הספירה מדגימות דם חולה באמצעות CSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פופ כל בועות באמצעות מחט G 22 סטריליים על ידי לכידתם בין פוע וקצה המחסנית. ברגע שכל הבועות הוסרו, בתוקף מכסה את המחסנית, להניח את המכשיר המגנטי שטוח, ודגירה בחושך לפחות 10 דקות. דגימות חייבות להיות נסרקו תוך 24 שעות של הכנה. </li></ol> 5. סריקה של דוגמאות מופרדים באופן ידני בכלי ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כלי הניתוח, אתחל את המנורה, ולבצע בקרת איכות ואימות מערכת כפי שתואר בסעיף 3.2 של התקן CTC הספירה מדגימות דם חולה תוך שימוש בפרוטוקול ה-CSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המדגם על כלי הניתוח ובחר בכרטיסייה ההגדרות. נקה את כל הנתונים קיימים על כפתור נתוני מכשיר המגנטי על ידי לחיצה על הכפתור לדוגמא עיצוב. אפשר ערוץ FITCnd להגדיר את זמן חשיפה ל1.0 שניות כפי שתואר בסעיף 2.2 אפיון CTC לסמנים מוגדר משתמש באמצעות CSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כרטיסיית בדיקת החולה ובחר עריכה כדי קלט את המידע לדוגמה. בחר CellSearch CTC כזהות קיט ומחקר CTC כפרוטוקול בדיקה. קלט את המידע הדרוש שנותר כפי שצוין ככוכבית. שמור את המידע לדוגמא ולחץ על התחל. </li></ol>

<ol>
	<li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> 63 (1), 11-30 (2013).</li><li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites.">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).</li><li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+metastatic+cascade.">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nat. Rev. Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).</li><li>Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells,+disease+progression,+and+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).</li><li>De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li><li>Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer.">Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer.</a> Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).</li><li>Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+at+each+follow-up+time+point+during+therapy+of+metastatic+breast+cancer+patients+predict+progression-free+and+overall+survival.">Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival.</a> Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).</li><li>Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+versus+imaging--predicting+overall+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer.</a> Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).</li><li>Olmos, D., Arkenau, H. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cell+(CTC)+counts+as+intermediate+end+points+in+castration-resistant+prostate+cancer+(CRPC):+a+single-centre+experience.">Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience.</a> Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).</li><li>De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li><li>Allan, A. L., Keeney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+analysis:+technical+and+statistical+considerations+for+application+to+the+clinic.">Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic.</a> J. Oncol. 2010, 426218 (2010).</li><li>Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+cytometry+analysis+of+circulating+tumor+cells.">Image cytometry analysis of circulating tumor cells.</a> Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).</li><li>Lianidou, E. S., Markou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+in+breast+cancer:+detection+systems,+molecular+characterization,+and+future+challenges.">Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges.</a> Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).</li><li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells:+liquid+biopsy+of+cancer.">Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer.</a> Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).</li><li>Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+in+the+development+of+circulating+tumor+cell+technology+for+clinical+use.">Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use.</a> J. Transl. Med. 10, 138 (2012).</li><li>Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=User-defined+protein+marker+assay+development+for+characterization+of+circulating+tumor+cells+using+the+CellSearch+system.">User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system.</a> Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).</li><li>Fehm, T., M&#252;ller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+status+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+breast+cancer:+a+prospective,+multicenter+trial.">HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial.</a> Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).</li><li>Liu, Y., Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+in+HER2-positive+metastatic+breast+cancer+patients:+a+valuable+prognostic+and+predictive+biomarker.">Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker.</a> BMC Cancer. 13, 202 (2013).</li><li>Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chemotherapy+plus+a+monoclonal+antibody+against+HER2+for+metastatic+breast+cancer+that+overexpresses+HER2.">Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2.</a> New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).</li><li>Marty, M., Cognetti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+phase+II+trial+of+the+efficacy+and+safety+of+trastuzumab+combined+with+docetaxel+in+patients+with+human+epidermal+growth+factor+receptor+2-positive+metastatic+breast+cancer+administered+as+first-line+treatment:+the+M77001+study+group.">Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group.</a> J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).</li><li>Slamon, D., Eiermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+trastuzumab+in+HER2-positive+breast+cancer.">Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer.</a> New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).</li><li>Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+considerations+for+studying+cancer+metastasis+in+vivo.">Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo.</a> Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).</li><li>Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+tumor+cell+dissemination+patterns+in+preclinical+models+of+cancer+metastasis+using+flow+cytometry+and+laser+scanning+cytometry.">Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry.</a> Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).</li><li>Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+escape+from+EpCAM-based+detection+due+to+epithelial-to-mesenchymal+transition.">Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition.</a> BMC Cancer. 12, 178 (2012).</li><li>Eliane, J. -. P., Repollet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+serial+changes+in+circulating+human+breast+cancer+cells+in+murine+xenograft+models.">Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models.</a> Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).</li><li>Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+yield+of+circulating+tumour+cells+facilitates+molecular+characterisation+and+recognition+of+discordant+HER2+amplification+in+breast.">Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast.</a> 102 (10), 1495-1502 (2010).</li><li>Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+circulating+tumor+cells+in+large+quantities+of+contaminating+leukocytes+by+a+multiplex+real-time+PCR.">Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR.</a> Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).</li><li>Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+circulating+tumor+cells+to+tumor+response,+progression-free+survival,+and+overall+survival+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer.">Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer.</a> J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).</li><li>Allard, W. J., Matera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases.">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).</li><li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease.">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139 (5), 871-890 (2009).</li><li>Yang, J., Weinberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Epithelial-mesenchymal+transition:+at+the+crossroads+of+development+and+tumor+metastasis.">A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis.</a> Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).</li><li>Gradilone, A., Raimondi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+lacking+cytokeratin+in+breast+cancer:+the+importance+of+being+mesenchymal.">Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal.</a> J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).</li><li>K&#246;nigsberg, R., Obermayr, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+EpCAM+positive+and+negative+circulating+tumor+cells+in+metastatic+breast+cancer+patients.">Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients.</a> Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).</li><li>Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+markers+in+primary+breast+cancer+patients+with+circulating+tumor+cells.">Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells.</a> Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).</li><li>Mego, M., Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-inducing+transcription+factors+in+primary+breast+cancer:+The+effect+of+neoadjuvant+therapy.">Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy.</a> Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).</li><li>Yu, M., Bardia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+breast+tumor+cells+exhibit+dynamic+changes+in+epithelial+and+mesenchymal+composition.">Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition.</a> Science. 339 (6119), 580-584 (2013).</li><li>Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+from+patients+with+advanced+prostate+and+breast+cancer+display+both+epithelial+and+mesenchymal+markers.">Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers.</a> Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).</li></ol>

המחבר (ALA) זכה למימון שהועמד על ידי Janssen אונקולוגיה, אשר חברה האם של חברת Johnson &amp; Johnson גם בעלי Janssen אבחון LLC, אשר מייצר ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

למרות ההתפתחות של טכנולוגיות רבות CTC חדשים מאז כניסתה של CSS ב2004, טכניקה זו היא עדיין הטכנולוגיה שאושרה קליני רק על השוק היום, ולכן זה נחשב תקן הזהב הנוכחי לאיתור CTC ופקידה. כתב היד הזה הוכיח שלמרות שיש לו את CSS תקני בקרת איכות קפדניים זה יכול להיות כפוף להטית פרשנות וכי ז...

בשנת 2013 הערכה הוא כי 580,350 אנשים ימותו מסרטן וש1,660,290 מקרים החדשים של מחלה זו יאובחנו בארצות הברית לבדה 1. רוב מקרי המוות הללו מתרחשים לאחר התפתחות המחלה גרורתית 2. חוסר הנוכחי של טיפולים יעילים בטיפול בגרורות ובהבנה מוגבלת של המפל גרורתי הופך שלב זה של מחלה קטלני ביותר. נוכחותם של תאים סרטניים במחזור (CTCs) בתוך זרם הדם הוכח לתאם עם מחלה גרורתית 3. תאים אלה הם נדירים ביותר וזיהוי שלהם מעיד על הישרדות כוללת בשד גרורתי 4, 5 ערמונית, וסרטן מעי גס 6. בחולים אלה, הנוכחות של ≥ 5 (שד וערמונית) או ≥ CTCs 3 (מעי גס) ב7.5 מיליליטר של דם מעיד על פרוגנוזה גרועה יותר בהשוואה לאותם חולים עם פחות או ללא CTCs לזיהוי בסאםדם דואר בנפח. בנוסף, השינוי במספר CTC במהלך או לאחר התערבות טיפולית הוכח להיות שימושי כמנבא של תגובה לטיפול, לעתים קרובות מוקדם יותר מאשר טכניקות מנוצלים כיום 7-10. הערכה הוא כי בחולי סרטן גרורתי, CTCs מתרחש בתדירות של כ 1 CTC לכל 10 5 -10 7 תאי mononuclear דם ובחולים עם מחלה מקומית, תדר זה ​​יכול להיות אפילו נמוך יותר (~ 1 ב10 8). הטבע הנדיר של תאים אלה יכול לעשות את זה קשה לזהות באופן מדויק ואמין ולנתח 11 CTCs. מספר שיטות (נבדק בעבר 12-14) כבר נוצל כדי להעשיר ולזהות תאים אלה על ידי ניצול מאפיינים שמבדילים אותם מסביב מרכיבי דם. באופן כללי, ספירת CTC היא תהליך בן שני חלקים שדורש הן צעד העשרה ושלב זיהוי. באופן מסורתי, את הפעולות העשרה מסתמכות על הבדלים בחינוך גופנימאפייני iCal של CTCs (גודל תא, צפיפות, deformability) או על ביטוי סמן חלבון (כלומר מולקולת הידבקות תא אפיתל [EpCAM], cytokeratin [CK]). בעקבות העשרה, זיהוי CTC יכול להתבצע במספר הדרכים שונות, הנפוץ ביותר מהם מבחני המבוססים על חומצות גרעין ו / או גישות cytometric. כל אחת מאסטרטגיות אלה הם ייחודיים, שיש יתרונות וחסרונות ברורים, עם זאת כל שחסר להם סטנדרטיזציה; הכרח עבור כניסה להגדרה הקלינית. מערכת CellSearch (CSS) לפיכך פותחה כדי לספק שיטה סטנדרטית לזיהוי והספירה של CTCs הנדיר בדם אדם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וטכניקות המבוסס על נוגדן 4-6. פלטפורמה זו נחשבת כיום לסטנדרט בספירת CTC הזהב והיא הטכניקה היחידה שאושרה על ידי ארה&quot;ב מנהל המזון והתרופות אמריקניות (FDA) לשימוש במרפאת 15. CSS הוא שתי consistin פלטפורמת רכיבגרם של, (1) מערכת CellTracks AutoPrep (להלן ככלי ההכנה), שממכנת את הכנת דגימות דם של בני אדם, ו (2) CellTracks מנתח השני (להלן ככלי ניתוח), אשר סורק את אלה דוגמאות הבאות הכנה. כדי להבחין CTCs את זיהום לויקוציטים מכשיר ההכנה מעסיק נוגדן בתיווך, גישת הפרדה מגנטית מבוסס ferrofluid ומכתים הקרינה ההפרש. בתחילה, מערכת תוויות CTCs באמצעות נוגדנים אנטי EpCAM מצומדת לחלקיקי ברזל. המדגם הוא מודגרות אז בשדה מגנטי, וכל התאים ללא תווית הם aspirated. תאים סרטניים שנבחרו resuspended, וטופחו בכתם הקרינה ההפרש, בהיקף של נוגדני fluorescently שכותרתו ומגיב מכתים גרעיני. לבסוף, המדגם מועבר למחסנית מגנטית, הנקרא MagNest (להלן כמכשיר המגנטי), וscanned באמצעות כלי הניתוח. מכשיר הניתוח משמש לסריקת דגימות מוכנות באמצעות מסנני הקרינה שונים, זה מותאם לחלקיקי הניאון המתאימים, באמצעות עדשה אובייקטיבית 10X. CTCs מזוהים כתאים המאוגדים על ידי אנטי EpCAM, אנטי הפאן CK-phycoerythrin (PE) (CK8, 18, ו19), ואת הכתם הגרעיני 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). לעומת זאת, לויקוציטים לזהם מזוהים כתאים המאוגדים על ידי אנטי CD45-allophycocyanin (APC) וDAPI. בעקבות סריקה, תאים סרטניים פוטנציאליים המוגדר על מחשב מוצגים למשתמש. מתמונות אלה, המשתמש חייב להעסיק ניתוח איכותי באמצעות הפרמטרים המוגדרים ומכתים ההפרש שנדונו לעיל, כדי לקבוע שאירועים הם CTCs. בנוסף לאספקת שיטה סטנדרטית לספירת CTC, CSS מאפשר לאפיון מולקולרי של CTCs המבוסס על סמני חלבון של עניין. זה ג החקירהלהתבצע ברמת התא הבודד, באמצעות isothiocyanate והעמסת (FITC) ערוץ הקרינה אינו נדרש לצורך זיהוי CTC 16. למרות שפלטפורמה זו מספקת את היכולת לאפיון מולקולרי, התהליך מפורט של פיתוח פרוטוקול ואופטימיזציה אינו מוגדר היטב. שלושה סמנים זמינים מסחרי פותחו על ידי היצרן לשימוש עם CSS, ובכלל זה צמיחת אפידרמיס גורם הקולטן (EGFR), גורם קולטן אנושי צמיחת אפידרמיס 2 (HER2), וגורם גדילה דמוי אינסולין קולטן 1 (IGF-1R). ניתוח HER2, בשילוב עם CSS, נוצל על ידי מספר קבוצות כדי להמחיש את הפוטנציאל לאפיון CTC להודיע ​​קבלת החלטות קלינית ואפשרות לשנות את הנחיות טיפול קיימות. לדוגמא, Fehm et al. 17 הראו כי כשליש מחולי סרטן השד עם גידולים מסוג HER2 העיקרי היה HER2 + CTCs. בנוסף, ליו et al.18 דיווחו לאחרונה כי עד 50% מהחולים עם סרטן השד גרורתי + שלה לא היו HER2 + CTCs. הרצפטין, הקולטן HER2 מפריע נוגדן חד שבטי הפגין להועיל לחולים אשר גידולים להביע רמות מספיקות של HER2, הוא טיפול מנוצל בדרך כלל לחולים עם גידולים ראשוניים + HER2 19-21 במידה רבה. עם זאת, מחקרים אלה מראים כי הרצפטין ניתן להיות תת אופטימלי מנוצל וכי אפיון CTC עשוי לסייע בניבוי תגובה לטיפול. סופו של דבר, אפיון CTC יכול להיות הפוטנציאל לשפר את טיפול אישי. מחקר CTC הוא ייחודי בכך שהיא במידה רבה מנוצל גישת מיטה להמעבדתיים. בשיטה זו, בניגוד למחקר מעבדתי למיטה, אשר לעתים קרובות יכול לקחת שנים כדי להשפיע על טיפול בחולה, אפשרה כניסה מהירה CTCs להגדרה הקלינית. עם זאת, רופאים מהססים להשתמש בתוצאות מניתוח CTC בהחלטות Mak טיפול בחולהing בשל חוסר הבנה של הביולוגיה הבסיסית שלהם. לכן מודלים עכבר פרה מתאימים של טכניקות גרורות וניתוח CTC משלים חייבים להיות מנוצלים על מנת לחקור השאלות קשות האלה. באופן כללי, ישנם שני סוגים של מודלים פרה לשמש כדי לחקור את המפל גרורתי, (1) מודלים גרורות ספונטניות, המאפשרים הלימוד של כל השלבים במפל גרורתי, ו (2) מודלים גרורות ניסיוניים, המאפשרים רק ל המחקר של צעדים מאוחר יותר בתהליך גרורתי כמו extravasation והיווצרות גידולים משניים 22. מודלים גרורות ספונטניים, כרוכים בזריקות של תאי גידול למיקומים מתאימים orthotopic (למשל הזרקה של תאי סרטן ערמונית לבלוטת הערמונית לחקר סרטן הערמונית). לאחר מכן ניתנו תאי זמן כדי ליצור גידולים ראשוניים וספונטאניות לשלוח גרורות לאתרים משניים כגון עצמות, ריאות, ובלוטות לימפה. בתוךלעומת זאת, מודלים גרורות ניסוייות כרוכים בהזרקה ישירה של תאים סרטניים למחזור הדם (לדוגמא דרך וריד זנב או הזרקת intracardiac למקד תאים למקומות ספציפיים) ולכן לדלג על השלבים הראשוניים של intravasation והפצה לאיברים משניים 22. עד כה רוב ניתוח CTC בin vivo מערכות מודל שבוצע באמצעות או 23 או מותאם טכניקות מבוססות cytometry מבוסס אנושי CTC (למשל AdnaTest) 24. אמנם שימושי, אף אחת מטכניקות אלה משקף באופן נאות ספירת CTC באמצעות CSS תקן זהב. בהתבסס על האישור הקליני, הטבע סטנדרטי, ושימוש נרחב של CSS, הפיתוח של טכניקת CTC לכידה וזיהוי לin vivo דוגמנות שמנצלת הכנת מדגם מקבילה, עיבוד, וקריטריוני זיהוי יהיה יתרון כתוצאות תהיה דומות לאלה מתקבל דגימות מטופל. עם זאת, בשל הנפח requirements של מכשיר ההכנה לא ניתן לעבד כמויות קטנות של דם באמצעות פלטפורמה אוטומטית זה. . בנוסף, העבודה קודמת של אליאן ואח&#39; 25 הוכיחה כי זיהום של דגימות עם תאי האפיתל בעכבר (שגם עומדות בהגדרה CTC הסטנדרטי [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) יכול להוביל לסיווג מוטעה של תאי אפיתל קשקש עכבר כמו CTCs. כדי לטפל בבעיות אלה בטכניקה מותאמת המאפשרת הניצול של חומרים כימיים ערכת CSS CTC בשילוב עם הליך בידוד ידני פותח. התוספת של אנטיגן לויקוציטים אנושיים FITC נוגדן הנקרא (HLA) לassay מאפשרת לתאים סרטניים אנושיים כדי להבחין בין תאי אפיתל קשקש עכבר. כתב יד זה מתאר סטנדרטי, שפותח באופן מסחרי ופרוטוקול CSS מותאם לעיבוד דגימות חולים דם ומלכודות נפוצות שעשויות להיות נתקלים, כולל discrepanפריטים לא שיכול להוביל לטעויות סיווג מוטעות CTC. בנוסף, ההתאמה האישית של assay ב-CSS כדי לבחון מאפייני חלבון בהגדרת משתמש של CTCs נתפס וטכניקת CSS מותאמת דומה המאפשרת להעשרה וזיהוי של CTCs מכמויות קטנות של דם בעכברי מודל פרה של גרורות מתוארות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-FITC</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-PE</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human HLA-AlexaFluor488</td>
			<td style="width:175px;">BioLegend</td>
			<td style="width:161px;">311415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-mouse CD45-APC</td>
			<td style="width:175px;">eBioscience</td>
			<td style="width:161px;">17-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Bond Primary Antibody Diluent</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:161px;">AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:267px;">CellSave Preservative Tubes</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">952820 (20 pack)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 79100005 (100 pack)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900018RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900017RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Instrument Buffer</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7901003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Streck Cell Preservative (aka CytoChex)</td>
			<td style="width:175px;">Streck</td>
			<td>213350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1 ml syringe</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">10 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1000&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1000&#181;l pipette tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">12 x 75mm flow tubes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">200&#181;l gel loading tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">200&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">22 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">5 3/4&#34; disposible pasteur pipet</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">5 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Automated pipettor</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Capillary Blood Collection Tube (EDTA)</td>
			<td style="width:175px;">BD Microtainer</td>
			<td style="width:161px;">365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch Analyzer II</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9555</td>
			<td rowspan="2" style="width:188px;">Includes magnests and verification cartirdges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">CellSearch AutoPrep System</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9541</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MagCellect Magnet&#160;</td>
			<td style="width:175px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:161px;">MAG997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Small Latex Bulb</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Vortex</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptation of semiautomated circulating tumor cell (ctc) assays for clinical and preclinical research applications

רוב מקרי מוות הקשורים לסרטן מתרחשים לאחר התפתחות המחלה גרורתית. שלב מחלה הקטלני ביותר זה קשור לנוכחות של תאים סרטניים במחזור (CTCs). תאים נדירים אלה כבר הוכיחו להיות בעל משמעות קלינית בשד גרורתי, סרטן ערמונית, סרטן מעי גס. תקן הזהב הנוכחי בזיהוי CTC קליני וספירה הוא במערכת ה-FDA פינה CellSearch (CSS). כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול הסטנדרטי מנוצל על ידי פלטפורמה זו, כמו גם בשני פרוטוקולים נוספים מותאמים המתארים את התהליך מפורט של סמן אופטימיזציה של משתמש מוגדר לאפיון חלבונים של CTCs מטופל ופרוטוקול דומה ללכידת CTC בכמויות נמוכות מאוד של דם, באמצעות תקן ריאגנטים CSS, ללימוד בעכברי מודל פרה vivo של גרורות. בנוסף, הבדלים באיכות CTC בין דם תורם בריא זינקו עם תאים מתרבית רקמה לעומת SAMP דם חולהles מודגשים. לבסוף, כמה פריטים בדרך כלל סותרים שיכול להוביל לטעויות סיווג מוטעות CTC מפורטים. יחדיו, פרוטוקולים אלה יספקו משאב שימושי עבור משתמשים בפלטפורמה זו מתעניינת במחקר פרה קליני הנוגע לגרורות וCTCs.

תקן CTC ספירת Assay הרגישות והסגוליות של CSS תועדה היטב בספרות. עם זאת, כדי לאמת את התאוששות CTC שווה ערך, זינק (תאי סרטן ערמונית אנושית 1,000 LNCaP) ודגימות דם של בני אדם unspiked מתורמים מתנדבים בריאים עובדו על CSS באמצעות פרוטוקול CSSCTC הסטנדרטי. כצפ?...

Watch this Scientific Journal Video about Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications at JoVE.com

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

תאי גידול במחזור (CTCs) הם פרוגנוסטיים במספר סוגי הסרטן גרורתי. כתב יד זה מתאר את מערכת הזהב סטנדרטית CellSearch (CSS) פלטפורמת ספירת CTC ומדגיש שגיאות סיווג מוטעות נפוצות. בנוסף, שני פרוטוקולים מותאמים מתוארים לאפיון סמן מוגדר על ידי משתמש של ספירת CTCs וCTC בעכברי מודל פרה של גרורות שימוש בטכנולוגיה זו.

עיבוד של semiautomated מחזור תא גידול מבחני (CTC) ליישומים קליניים ומחקר הקליני

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

adaptation-semiautomated-circulating-tumor-cell-ctc-assays-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

15.8K Views.  London Health Sciences Centre.  תאי גידול במחזור (CTCs) הם פרוגנוסטיים במספר סוגי הסרטן גרורתי. כתב יד זה מתאר את מערכת הזהב סטנדרטית CellSearch (CSS) פלטפורמת ספירת CTC ומדגיש שגיאות סיווג מוטעות נפוצות. בנוסף, שני פרוטוקולים מותאמים מתוארים לאפיון סמן מוגדר על ידי משתמש של ספירת CTC...

Video: Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

עיבוד של רקמת גידול במוח העיקרית למבחנים בתאי גזע וזרימת מיון

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

בF-MRI 19 vivo למעקב סלולרי

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

רומן<em&gt; In vivo</em&gt; טכניקה וין העברה<em&gt; במבחנה</emמבחני תא בהתבסס&gt; לחקר אובדן עצם בפרעות השלד והשרירים

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

Ex Vivo טיפול תגובה של גידולים ראשוניים ו / או הקשורים גרורות לפרה קלינית וקליני של Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

בידוד וריבוי תאים סרטניים במחזור מסרטן מודל עכבר

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Proton Therapy Delivery and Its Clinical Application in Select Solid Tumor Malignancies

Radiation therapy is a frequently used modality for the treatment of solid cancers. Although the mechanisms of cell kill are similar for all forms of radiation, the in vivo properties of photon and proton beams differ greatly and maybe exploited to optimize clinical outcomes. In particular, proton particles lose energy in a predictable manner as they pass through the body. This property is used clinically to control the depth at which the proton beam is terminated, and to limit radiation dose beyond the target region. This strategy can allow for substantial reductions in radiation dose to normal tissues located just beyond a tumor target. However, the degradation of proton energy in the body remains highly sensitive to tissue density. As a consequence, any changes in tissue density during the course of treatment may significantly alter proton dosimetry. Such changes may occur through alterations in body weight, respiration, or bowel filling/gas, and may result in unfavorable dose deposition. In this manuscript, we provide a detailed method for the delivery of proton therapy using both passive scatter and pencil beam scanning techniques for prostate cancer. Although the described procedure directly pertains to prostate cancer patients, the method may be adapted and applied for the treatment of virtually all solid tumors. Our aim is to equip readers with a better understanding of proton therapy delivery and outcomes in order to facilitate the appropriate integration of this modality during cancer therapy.

The fundamentals of radiation planning and delivery for proton therapy using prostate cancer as a model are presented. The application of these principles to other selected disease sites highlights how proton radiotherapy may enhance clinical outcomes for cancer patients.

פרוטון טיפול משלוח ויישומו קלינית של מחלות ממאירות גידולים מוצקים בחר

Radiation therapy is a frequently used modality for the treatment of solid cancers. Although the mechanisms of cell kill are similar for all forms of ...

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity is disturbed in gastrointestinal, cardiovascular and metabolic diseases, which may result in easier access of biologically active compounds, such as gut bacterial metabolites, to the bloodstream. Thus, the permeability of the GBB may be a marker of both intestinal and extraintestinal diseases. Furthermore, the increased penetration of bacterial metabolites may affect the functioning of the entire organism.
Commonly used methods for studying the GBB permeability are performed ex vivo. The accuracy of those methods is limited, because the functioning of the GBB depends on intestinal blood flow. On the other hand, commonly used in vivo methods may be biased by liver and kidney performance, as those methods are based on evaluation of urine or/and peripheral blood concentrations of exogenous markers. Here, we present a direct measurement of GBB permeability in rats using an in vivo method based on portal blood sampling, which preserves intestinal blood flow and is virtually not affected by the liver and kidney function. 
Polyurethane catheters are inserted into the portal vein and inferior vena cava just above the hepatic veins confluence. Blood is sampled at baseline and after administration of a selected marker into a desired part of the gastrointestinal tract. Here, we present several applications of the method including (1) evaluation of the colon permeability to TMA, a gut bacterial metabolite, (2) evaluation of liver clearance of TMA, and (3) evaluation of a gut-portal blood-liver-peripheral blood pathway of gut bacteria-derived short-chain fatty acids. Furthermore, the protocol may also be used for tracking intestinal absorption and liver metabolism of drugs or for measurements of portal blood pressure.

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The access of nutrients, microbiota metabolites and medicines to the circulation is controlled by the gut-blood barrier (GBB). We describe a direct method for measuring the GBB permeability in vivo, which, in contrast to commonly used indirect methods, is virtually not affected by liver and kidney functions.

שיטת In Vivo להערכת את מחסום הדם-הבטן ואת חילוף החומרים בכבד של מוצרים Microbiota

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

מודל תרביות רקמה לשעבר Vivo עבור סיבוכים Fibrovascular Proliferative רטינופתיה סוכרתית

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...