עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) בAI089106 RC3 המענק. חומצות גרעין MDR-TB סופקו על ידי תכנית הפיתוח של הקרן / האו&quot;ם / בנק העולמי / ארגון הבריאות העולמית מיוחדת תכנית הילדים של האו&quot;ם למחקר והדרכה במחלות טרופיות (TDR), ג&#39;נבה, שוויץ. אנו מודים לד&quot;ר טום Shinnick של המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן להדרכה בגנים ומוטציות הספציפיים שתיכלל בassay אב הטיפוס.

למעבדות שפעלו באמצעי זהירות PCR אוניברסלי, זה מבצעי יעיל יותר כדי לכלול כמה microarrays הגברה ואטמים לכל מצע ולשטוף את כל microarrays ההגברה בו זמנית במכל בתפזורת, כפי שמתואר כאן. פורמטים מתכלים זמינים לביצוע שלבי כביסה microarray לאחר הגברה ב, מבחן amplicon סגור אטום לחלוטין, כפי שדווחו במקומות אחרים 30,33. 1. התקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ ולטהר חומצות גרעין מהדגימה בתנאי בטיחות ביולוגיות מתאימים עם שיטה של ​​בחירה. הדרישה היא שחומצות גרעין תהיה של טוהר מספיק להגברה סימטרית, זמנית ה-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את סביבת עבודה על ידי ניגוב משטחים וציוד עם פתרונות decontaminating. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח ריאגנטים הגברה על קרח או בלוק קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית צינור microfuge 1.5 מיליליטר סטרילי לתערובת ההורים ההגברה, ולתייג microfuge 0.2 מיליליטר סטרילי tuלהיות עבור כל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ריאגנטים מופשרים, בקצרה מערבולת ולאסוף תוכן לחלק התחתון של הצינור עם דופק ספין במיני צנטריפוגות. לא מערבולת פולימראז תקי. בעדינות קפיצית הצינור לערבב ופעל עם דופק ספין במיני צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת אב הגברה שימוש בכמויות התגובה לכל מדגם מוצגות בטבלה 1. כדי להסביר את אי דיוקים pipetting אפשריים, להכין נפח תגובה אחת לפחות יותר מאשר המספר הכולל של דגימות בטיפול. שים לב שתערובת ההורים מכילה פולימראז תקי נוסף, מעל ומעבר למה שמסופק עם חיץ PCR muliplex. הוסף רק את שליטת הגברה / עיכוב לתערובת האמן אחרי כל ריאגנטים האחרים משולבים, והצינורות מגיב המניה חזרו לאחסון. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> נפח לכל מדגם (μl) </td><td> &lt;strong&gt; סופי [] </td></tr><tr><td> Mulitplex PCR הצפת עם HotStar תקי פלוס </td><td> 25 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> אלבומין בסרום שור (BSA) </td><td> 0.55 </td><td> 0.6 מ&quot;ג / מיליליטר </td></tr><tr><td> פוראמיד </td><td> 3.8 </td><td> .7.6% </td></tr><tr><td> פולימראז תקי נוסף </td><td> 0.8 </td><td> יחידות / μl (סה&quot;כ 4 יחידות) </td></tr><tr><td> תמהיל פריימר MDR-TB </td><td> 15.75 </td><td> - </td></tr><tr><td> H-RNase ללא 2 O </td><td> 2.1 </td><td> - </td></tr><tr><td> הגברה / עיכוב בקרה </td><td> 1 </td><td> 5.0 FG / μl </td></tr><tr><td> סך הכל </td><td> 49 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלת 1. הרכב MDR-TB microarray ההגברה מיקס מאסטר. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת תערובת ההורים ולאסוף תוכן לחלק התחתון של הצינור עם דופק ספין במיני צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 49 μl של תערובת הורים ו1 μl של מ &#39; ה-DNA שחפת לכל אחד מצינורות המדגם משלב 1.4, לעיל. לחיצוני, אין שליטת תבנית (NTC), השתמש 1 μl מים כיתה ביולוגיה מולקולרית במקום של מ &#39; דגימת DNA שחפת. ורטקס ודופק ספין הצינור (ות) בסיום. </li></ol> 2. טען Microarrays ההגברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 48 μl של כל ערבוב / מדגם הורים על מרכז microarrays המיוחסים להם, נזהרה שלא לגעת בmicroarray עצמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום להחליק על גבי עטיפה של אטם microarray וחותם, נזהרות שלא מלכודת כל בועות אוויר בתא microarray. בועות האוויר עלולות להשפיע לרעה על יעילות הגברהועלול ליצור חפצים או רעש בתמונה microarray שלאחר מכן. </li></ol> 3. רכיבה על אופניים תרמיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל microarrays נטען עם מדגם, מצעי מקום בCycler התרמי הבלוק השטוח. ודא כי אפשרות המכסה המחוממת מופעלת &quot;כבויה&quot;. ציוד המתקבל מAkonni Biosystems כבר יהיה prequalified לשימוש. אחרת, זה מאוד חשוב לוודא כי את Cycler הבלוק השטוח התרמית (ים) מספקת אחידה (ים), חימום עקבי בכל מצעי microarray. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת Cycler התרמית, בחר את התכנית המתאימה, הזן &quot;μl 50&quot; לעוצמת התגובה, וליזום במנוסה. פרוטוקול הרכיבה התרמית שתואר כאן מורכב: <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> צעדים רכיבה על אופניים תרמיים </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 88 ° C </td><td> 5 דקות </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 88 ° C </td><td> 30 שניות </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 55 ° C </td><td> 1 דקות </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 65 מעלות צלזיוס </td><td> 30 שניות </td></tr><tr><td> 5 </td><td> חזור על שלבים (2-4) ל50 מחזורים </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 65 מעלות צלזיוס </td><td> 3 דקות </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 55 ° C </td><td> 3 שעות </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המספר הכולל של מחזורים תרמיים ו55 C ° זמן המתנה לאחר הגברה הוא משתנה בלתי תלוי שהמשתמש רשאי לשנות, במידת צורך או מתאים לניסוי הספציפי. בגלל תערובת ההורים MDR-TB יוצרת amplicons סימטרית (בעיקר חד גדילים), זה בדרך כלל מועיל לכלול מחזורים תרמיים יותר אחר עלולים להיות מנוצל לפרוטוקול קונבנציונלי, מעריכי PCR הגברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תכנית רכיבה על אופניים וכלת התרמית היא מלאה, בסופו של התכנית, להסיר את microarrays ההגברה, לסגור את התוכנה, ולכבות את Cycler התרמית (ים).</li></ol> 4. שטפי ויבשים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטיפת עד 24 מצעים בו זמנית, להכין לפחות 250 מיליליטר 1x SSPE - 0.1% חיץ לשטוף X-100 טריטון, ושתי מכולות עם לפחות 250 מיליליטר deionized או מים כיתה מילי-Q כל אחד. לשטוף החיץ יכול להיות מוכן מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר להחליק את המכסה ואטם מתא microarray הגברה באמצעות מלקחיים שטוח סוף בזהירות. שלב זה הוא הנקודה שבה יש את הסיכון הגדול ביותר של מערכי יסוד ג&#39;ל מזיקים מבחינה פיזית. השתמש בבקרת זיהום PCR המתאימה כדי למנוע את ההתפשטות של חומצות גרעין מוגברות בתוך סביבת העבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מצעי microarray בהחזיק שקופיות היסטולוגיה, ולמקם את כל השקופיות לפח לשטוף המכיל חיץ לשטוף. כסה את המכל עם מכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף microarrays ל10 דקות בטמפרטורת חדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את microarrays פעמים בכל שלוש בשתי כביסות רצופות של deionized אומים מילי-Q כיתה, ואוויר יבש. </li></ol> 5. הדמיה תמהיל פריימר MDR-TB סימטרי יוצר amplicons כותרת Cy3. ניתן הדמיה microarrays אלמנט ג&#39;ל עם כל תרמי microarray סטנדרטי מסוגל Cy3 הדמיה. הליך ההדמיה הבאה הוא ספציפי לתמהיל MDR-TB מאסטר, תרמי נייד שדה Dx2100, ותוכנה לניתוח אוטומטי הניתן על ידי Akonni. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שכבל Ethernet מהתרמי מחובר למחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תרמי. מתג ההפעלה ממוקם בלוח האחורי של המכשיר. נוריות כחולים בחזית תרמי תאיר כאשר תרמי הוא מופעל על. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשולחן העבודה של המחשב, לחץ לחיצה כפולה על סמל התוכנה כדי להפעיל את תוכנת ניתוח תמונה האוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה לתוכנה כדי ליצור חיבור עם המצלמה תרמי. ברגע שנוצר החיבור, הכפתור Analyze הופך להיות זמין, והודעה &quot;חיבור מוצלח&quot; יופיע בפינה השמאלית התחתונה של המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את microarray ההגברה המיובש עם microarray מול מן המשתמש, וכיוון העדשה האובייקטיבית. אם microarray מכוון בצורה לא נכונה ביחס לעדשה והמצלמה, תוכנה לניתוח האוטומטי תיכשל למקם רשת על תמונת הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את דלת הגישה. תצוגה מקדימה של תמונה תהיה זמינה על מסך המחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את תסריט ניתוח MDR-TB מהתפריט הנפתח והזן את הזמן רצוי חשיפה (באלפיות שני). נקודת התחלה טיפוסית עבור microarrays ההגברה אלמנט ג&#39;ל היא 100-500 אלפיות שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיקסלים רוויים יוצגו בתצוגה מקדימה באדום. התאם את זמן החשיפה כדי למזער את מספר הפיקסלים רוויים במקומות מסוימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על נתח לרכוש ולנתח את תמונת הקרינה. התוכנה באופן אוטומטי למקםרשת assay הספציפי MDR-TB על גבי התמונה, לחלץ עוצמה משולבת וערכי רקע, ולדווח על תוצאות עמידות לתרופות וגנוטיפ. הניתוח האוטומטי ייקח בדרך כלל כמה שניות. עבור תמונות מאתגרות המכילות סריטות, אבק, לכלוכי ניאון, או נזק פיזי לתכונות microarray, ייתכן שהתוכנה צריכה עד 1 דקות כדי להשלים את הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהניתוח הסתיים, לחץ על שמור, בחר את תיקיית יעד, הסוג בשם קובץ, ולחץ על אישור. נתוני microarray הבסיסיים נשמרים כקובץ xls. וניתן לייצא לoff-line מנתח, אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהניתוח הושלם, להסיר את microarray ההגברה מתרמי, ולחץ על New כדי ליזום את הניתוח הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום איסוף הנתונים, סגור את התוכנה, לכבות את המחשב, ולכבות את תרמי. </li></ol>

<ol>
	<li>Lemaire, J. -. F., Casenghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+diagnostics+for+tuberculosis:+fulfilling+patient+needs+first.">New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first.</a> J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, (2012).</li><li>Notomi, T., Okayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA.">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).</li><li>Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicase-dependent+isothermal+DNA+amplification.">Helicase-dependent isothermal DNA amplification.</a> EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).</li><li>Pritchard, C. G., Stefano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+detection+of+viral+nucleic+acid+at+subattomole+levels+using+Q+beta+replicase.">Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase.</a> Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).</li><li>Compton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sequence-based+amplification.">Nucleic acid sequence-based amplification.</a> Nature. 350, 91-92 (1991).</li><li>Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal,+in+vitro+amplification+of+nucleic+acids+by+a+multienzyme+reaction+modeled+after+retroviral+replication.">Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).</li><li>Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+chip+array+for+differentiation+of+mycobacterial+species+and+detection+of+drug+resistance.">Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance.</a> Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).</li><li>Troesch, A., Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+species+identification+and+rifampin+resistance+testing+with+high-density+DNA+probe+arrays.">Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).</li><li>Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+TB-biochip+oligonucleotide+microarray+system+for+rapid+detection+of+rifampin+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).</li><li>Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+defined+Mycobacterium+tuberculosis+populations+using+RNA+amplification+strategies.">Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies.</a> BMC Genomics. 9, 94 (2008).</li><li>Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+mycobacterium+species+isolates+by+DNA+microarray.">Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).</li><li>Park, H., Jang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+genotyping+of+Mycobacterium+species+from+clinical+isolates+and+specimens+by+oligonucleotide+array.">Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).</li><li>Yao, C., Zhu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+rpoB,+katG+and+inhA+gene+mutations+in+Mycobacterium+tuberculosis+clinical+isolates+from+Chongqing+as+determined+by+microarray.">Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray.</a> Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).</li><li>Sun, A. H., Fan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+rpoB+gene+mutations+in+rif-resistant+M.+tuberculosis+isolates+by+oligonucleotide+microarray.">Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray.</a> Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).</li><li>Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+drug-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+with+a+scanning-frame+oligonucleotide+microarray.">Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray.</a> Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).</li><li>Fu, L., Shinnick, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+action+of+INH+on+a+highly+INH-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strain+using+Genechips.">Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips.</a> Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).</li><li>Fu, L. M., Shinnick, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+exploration+of+the+drug+action+of+capreomycin+on+Mycobacterium+tuberculosis+using+Affymetrix+oligonucleotide+GeneChips.">Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips.</a> J. Infect. 54, 277-284 (2007).</li><li>Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray-based+pncA+genotyping+of+pyrazinamide-resistant+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).</li><li>Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+hybridisation+on+oligonucleotide+microarrays+for+analysis+of+drug-resistant+Mycobacterium+tuberculosis.">Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis.</a> Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).</li><li>Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+and+allele+specific+PCR+detection+of+point+mutations+in+Mycobacterium+tuberculosis+genes+associated+with+drug+resistance.">Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance.</a> J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).</li><li>Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+mapping+of+mutations+of+pyrazinamide-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strains+with+a+scanning-frame+oligonucleotide+microarray.">Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).</li><li>Yue, J., Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+rifampin-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strains+by+using+a+specialized+oligonucleotide+microarray.">Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).</li><li>Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+CombiChip+Mycobacteria+Drug-Resistance+detection+DNA+chip+for+identifying+mutations+associated+with+resistance+to+isoniazid+and+rifampin+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).</li><li>Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+macroarrays+for+the+identification+of+MDR+Mycobacterium+tuberculosis.">The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).</li><li>Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+the+genotype+MTBDR+line+probe+assay+for+detection+of+resistance+to+rifampin+and+isoniazid+in+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis+with+low-+and+high-level+resistance.">Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).</li><li>Padilla, E., Gonzalez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+the+new+version+of+the+INNO-LiPA+Mycobacteria+and+GenoType+Mycobacterium+assays+for+identification+of+Mycobacterium+species+from+MB/BacT+liquid+cultures+artificially+inoculated+with+mycobacterial+strains.">Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains.</a> J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).</li><li>Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diagnostic+performance+of+the+GenoType+MTBDRplus+Version+2+line+probe+assay+is+equivalent+to+that+of+the+Xpert+MTB/RIF+assay.">The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay.</a> J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).</li><li>Sekiguchi, J. -. I., Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+line+probe+assay+for+rapid+identification+of+pncA+mutations+in+pyrazinamide-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strains.">Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).</li><li>Chandler, D. P., Bryant, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+amplification+microarrays+for+infectious+disease+diagnostics.">Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics.</a> Microarrays. 1, 107-124 (2012).</li><li>Vincent, V., Rigouts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TDR+Tuberculosis+Strain+Bank:+a+resource+for+basic+science,+tool+development+and+diagnostic+services.">The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services.</a> Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).</li><li>Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-volatile+copolymer+compositions+for+fabricating+gel+element+microarrays.">Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays.</a> Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).</li><li>Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plastic,+disposable+microfluidic+flow+cell+for+coupled+on-chip+PCR+and+microarray+detection+of+infectious+agents.">A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents.</a> Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).</li><li>Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplicon+secondary+structure+prevents+target+hybridization+to+oligonucleotide+microarrays.">Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).</li><li>El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+sloppy+molecular+beacon+probes+for+identification+of+Mycobacterial+species.">Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).</li><li>Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+molecular+detection+of+tuberculosis+and+rifampin+resistance.">Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

עם microarray הגברה היקף הריבוב מוכתב סופו של דבר על ידי היעילות של PCR אסימטרי זמנית, לא microarray. מניסיוננו, 10-12 זוגות פריימר ייחודיים ניתן multiplexed בקלות בפורמט microarray הגברה. קריטריוני פריימר ועיצוב חללית קונבנציונליים ולכן חלים על מבחני חדשים, חוץ מזה שצריך גם להביא בחשבון את ?...

מקרה גילוי מוקדם וטיפול מהיר נחשבים שליטת האסטרטגיות היעילות ביותר להפחית חפת Mycobacterium הילוכים (MTB) 1, ועכשיו יש הסכמה רחבה בקהילת שחפת שנקודת הטיפול (POC) או בסמוך לבדיקת POC לאבחון שחפת בו זמנית ויש צורך בעמידות לתרופות (DR). טכנולוגיות כגון GeneXpert של קפאידים ובדיקות הגברה אחרות חומצות גרעין לצמצם את הזמן לאבחון לחולי שחפת רבות, ולספק קריאה מתוך מהירה מצביע על עמידות לריפאמפין או מוטציות שנבחרו מקנות עמידות לתרופות הראשונות או שנייה אחרות קו 2. למרות בדיקות הגברה בזמן אמת וחומצות גרעין בידוד תרמיות נועדו לזהות את מוטציות עמידות לתרופה שתוביל לMDR-TB, הספקטרום של מוטציות הם מזהים הוא לעתים קרובות מספיק כדי לעצב משטר תרופה אישי המתאים לפרופיל העמידות לתרופות של החולה, ואילוצים טכניים הקשורותכדי לדבר לחצות אופטי או את המורכבות של תהליכים כימיים הגברה ודיווח מאי 3-7 להגביל את מספר הלוקוסים או מוטציות שאותרו. לכן, טכנולוגיות זיהוי עם יכולת ריבוב גבוהה יותר נדרשות כדי לטפל בפערים ידועים באבחון POC MDR-TB. Microarrays ומבחני הבדיקה השורה אישרו-WHO Hain יכולים לתת מענה &quot;גן מרובה, מוטציות רבות&quot; האתגר של אבחון MDR-TB 8-29. למרבה הצער,, פלטפורמות גילוי אלה המבוססים על הכלאת ריבוב משתמשות רב שלבי, מסובכים, ופרוטוקולים הפתוח amplicon הדורשים הכשרה משמעותית ומיומנות בטכניקות מולקולריות. Microarray ההגברה 30 נועד לטפל בכמה microarray זרימת העבודה אלה ודאגות תפעוליות. עקרונות fluidic פישוט הם כדי להגביר, להכליא, ולזהות מטרות חומצות גרעין בתוך תא microfluidic אחת. המשתמש מציג mas החומצה והגברת הגרעיןter לערבב לתוך תא fluidic עם טפטפת ומתחיל פרוטוקול הרכיבה התרמי. לשיטת העיבוד אצווה שמוצגת כאן, microarrays נשטפים לאחר מכן בפתרון בתפזורת, מיובש, וצלם. מחקר זה מדגים את הפונקציונליות של microarray הגברה באמצעות בדיקת MDR-TB microarray לrpoB (30 מוטציות), katG (2 מוטציות), Inha (4 מוטציות), rpsL (2 מוטציות), embB (מוטציה 1), IS1245, IS6110 , והגברה פנימית ושליטה הכלאה. זוג תואם לפחות אחד מבדיקות microarray (wildtype (WT) ומוטציה של נוקלאוטיד יחיד (MU)) כלול בכל אחד מוטציה של עניין. חומצות גרעין מזוקקים ממ &#39;עמיד סמים רב שחפת הן מזני שחפת TDR הבנק ביום 31. microarrays אלמנט ג&#39;ל מיוצרים על מצעי זכוכית על ידי copolymerization בעצם כפי שתואר במקומות אחרים 32, פרט לכך שאנו משתמשים מונומר 4% ו0.05 מ&quot;מ כל אחד בדיקה בpolymerizתערובת ation. מערכים מוקפים באטם 50 מיליליטר לפני השימוש. לאחר שלבי רכיבה התרמית, הכלאה, ולשטוף, microarrays ההגברה הם צילמו על מנתח נייד Akonni. , עוצמות אות משולבות מתוקן רקע מתקבלות הגלם. תמונות tif באמצעות אלגוריתם מעגל קבוע. רעש עבור כל רכיב ג&#39;ל מחושב כשלוש פעמים סטיית התקן של רקעי נקודה המקומיים. מטרות גן נחשבות בדרך כלל לגילוי עבור יחס אות לרעש (SNR) ערכי ≥ 3. על מנת לקבוע את קיומו או היעדריו של מוטציה ספציפית בכל גן או קודון, יחס מבחין מחושב מערכי יחס האות לרעש כ( WT-MU) / (WT + MU). יחסי מבחין &lt;0 מעידים על מוטציה סמים התנגדות במוקד, ואילו יחסים&gt; 0 מעידים על רצף wild-type.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips</td>
			<td>Akonni Biosystems</td>
			<td>Inquire</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#206143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Taq polymerase</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#201207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">RNAse-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#206143&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td>
			<td>#BP227-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#3B6917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">5X concentrated MDR-TB primer mix</td>
			<td>Akonni Biosystems</td>
			<td>Inquire</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">500 fg uL-1 amplification and inhibition control</td>
			<td>Akonni Biosystems</td>
			<td>Inquire</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">20X SSPE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td>
			<td>#BP1328-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td>
			<td>#BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Disinfecting Spray&#160;</td>
			<td>Current Technologies, Inc.</td>
			<td>#BRSPRAY128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">70% Isopropyl Alcohol</td>
			<td>Decon Labs, Inc.</td>
			<td>#8416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Equipment</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Microarray imager, with automated image and data analysis software</td>
			<td>Akonni Biosystems</td>
			<td>100-20011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Thermal cycler with flat block insert</td>
			<td>Akonni Biosystems</td>
			<td>100-10021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">High-throughput wash station and slide holder</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>HTW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dissecting forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td>
			<td>#10-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Mini Vortexer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#3365040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Mini-centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#93000-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Airbrush Compressor Kit</td>
			<td>Central Pneumatic</td>
			<td>#95630</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstrating a multi-drug resistant mycobacterium tuberculosis amplification microarray

פישוט זרימת העבודה microarray הוא צעד ראשון הכרחי ליצירת אבחון מבוסס microarray MDR-TB שיכול לשמש באופן שיגרתי בסביבות נמוכים יותר משאבים. Microarray הגברה משלב הגברה סימטרית PCR, בחירת גודל היעד, תיוג היעד, וכלת microarray בתוך פתרון אחד ולתוך תא microfluidic אחת. שיטת עיבוד אצווה באה לידי ביטוי עם שילוב 9-Plex סימטרי אב וmicroarray אלמנט ג&#39;ל בצפיפות נמוכה לgenotyping חפת סמים רב Mycobacterium עמיד (MDR-TB). הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להשלים ב6 שעות ולספק גנוטיפ נכון עם לפחות 1,000 שווה תא של הדנ&quot;א הגנומי. שילוב על גבי שבב צעדים לשטוף אינו ריאלי, אשר יגרמו לשיטת amplicon סגורה לגמרי ומערכת. עם microarray הגברה ההיקף של ריבוב מוגבל סופו של דבר במספר זוגות פריימר שניתן לשלב מ &#39;אדון יחידix ועדיין להשיג רגישות רצויה ומדדי ביצועים ספציפיים, במקום מספר הבדיקות שהם משותקים במערך. כמו כן, בסך הכל בפעם הניתוח יכול להתקצר או התארכה בהתאם לשימוש הספציפי המיועד, שאלת מחקר, ומגבלות רצויות של זיהוי. עם זאת, הגישה הכללית מייעלת באופן משמעותי את זרימת עבודה microarray למשתמש הקצה על ידי צמצום מספר שלבי עיבוד ידני אינטנסיביים וזמן רב, ומספקת נתיב ביוכימי וmicrofluidic פשוט עבור תרגום אבחון מבוסס microarray לתוך פרקטיקה קלינית שגרתית.

ניתוח תמונה איכותי יכול לספק תובנות לגבי מקורות רעש ניסיוני או השתנות שמאתגרים לזהות בטבלאות נתונים שנוצרו על ידי תוכנת ניתוח תמונה אוטומטית. לכן, זה יכול להיות שימושי כדי לבדוק חזותי ש1) כל אלמנטי ג&#39;ל הם שלמות וללא ניזק, 2) הרקע הגלובלי הוא חופשי מחפצי ניאון שעשוי לה...

Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray at JoVE.com

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Microarray הגברה משלב הכלאת הגברה וmicroarray PCR אסימטרי לתוך תא בודד, אשר מייעל באופן משמעותי את זרימת עבודה microarray למשתמש הקצה. פישוט זרימת העבודה microarray הוא צעד ראשון הכרחי ליצירת אבחון מבוסס microarray שניתן להשתמש באופן שיגרתי בסביבות נמוכים יותר משאבים.

הוכחת סמים רבים עמידים<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; Microarray ההגברה

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

demonstrating-multi-drug-resistant-mycobacterium-tuberculosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

12.5K Views.  Akonni Biosystems, Inc..  Microarray הגברה משלב הכלאת הגברה וmicroarray PCR אסימטרי לתוך תא בודד, אשר מייעל באופן משמעותי את זרימת עבודה microarray למשתמש הקצה. פישוט זרימת העבודה microarray הוא צעד ראשון הכרחי ליצירת אבחון מבוסס microarray שניתן להשתמש באופן שיגרתי בסביבות נמוכים יותר משאב...

Video: Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). Antimicrobial susceptibility testing (AST) of Mtb has traditionally been performed by the agar method of proportion or by 
macrobroth testing on an instrument such as the BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) or BacT/ALERT (bioM&eacute;rieux, Hazelwood, MO). The agar proportion method, while considered the &#x201C;gold&#x201D; standard of AST, is labor intensive and requires calculation of resistance by performing colony counts on drug-containing agar as compared to drug-free agar. If there is &ge;1% growth on the drug-containing medium as compared to drug-free medium, the organism is considered resistant to that drug. The macrobroth methods require instrumentation and test break point ("critical") drug concentrations for the first line drugs (isoniazid, ethambutol, rifampin, and pyrazinamide). The method described here is commercially available in a 96 well microtiter plate format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] and contains increasing concentrations of 12 antimicrobials used for treatment of tuberculosis including both first (isoniazid, rifampin, ethambutol) and second line drugs (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic acid, rifabutin, and streptomycin). Pyrazinamide, a first line drug, is not included in the microtiter plate due to its need for acidic test conditions. Advantages of the microtiter system include both ease of set up and faster turn around time (14 days) compared with traditional agar proportion (21 days). In addition, the plate can be set up from inoculum prepared using either broth or solid medium. Since the microtiter plate format is new and since Mtb presents unique safety challenges in the laboratory, this protocol will describe how to safely setup, incubate and read the microtiter plate.

Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis is challenging but critical for patient care. This microtiter plate format offers testing of 12 antimycobacterial drugs and provides minimum inhibitory concentration (MIC) values, which will aid in appropriate treatment.

רגישות בדיקת Antimicrobial של קומפלקס שחפת Mycobacterium עבור תרופות הקו הראשון והשני על ידי דילול מרק בפורמט פלייט microtiter

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

לדוגמא הכנה של<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; תמציות ללימודי metabolomic תהודה מגנטיים גרעיניים

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein has two distinct isoforms, the non-infectious host-encoded protein (PrPC) and the infectious protein (PrPSc), an abnormally-folded isoform of PrPC 8.
One of the challenges of working with prion agents is the long incubation period prior to the development of clinical signs following host inoculation13. This traditionally mandated long and expensive animal bioassay studies. Furthermore, the biochemical and biophysical properties of PrPSc are poorly characterized due to their unusual conformation and aggregation states.
PrPSc can seed the conversion of PrPC to PrPSc in vitro14. PMCA is an in vitro technique that takes advantage of this ability using sonication and incubation cycles to produce large amounts of PrPSc, at an accelerated rate, from a system containing excess amounts of PrPC and minute amounts of the PrPSc seed19. This technique has proven to effectively recapitulate the species and strain specificity of PrPSc conversion from PrPC, to emulate prion strain interference, and to amplify very low levels of PrPSc from infected tissues, fluids, and environmental samples6,7,16,23 .
This paper details the PMCA protocol, including recommendations for minimizing contamination, generating consistent results, and quantifying those results. We also discuss several PMCA applications, including generation and characterization of infectious prion strains, prion strain interference, and the detection of prions in the environment.

Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an in vitro assay for the study of prion conversion and strain and species barriers. It can also be used as a prion detection assay.

הגברה מחזורית misfolding חלבון של פריונים

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

מודל ניסיוני לחקר המלריה שחפת-coinfection על הילוכים טבעיים של חפת Mycobacterium ו Berghei Plasmodium</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

גישה החדשנית Microdissection לשחזור<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; תמלילים ספציפיים מפרפין קבוע פורמלין משובץ ריאות גרנולומות

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

דגם רקמות 3D ריאות אדם ללימודים פונקציונליים ב<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; זיהום

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

ניתוח של 18FDG PET/CT הדמיה ככלי לימודי שחפת Mycobacterium זיהום וטיפול פרימטים לא אנושית

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...