وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) في إطار منحة RC3 AI089106. وقدمت السل المقاوم للأدوية المتعددة الأحماض النووية من قبل برنامج الأمم المتحدة للطفولة برنامج / صندوق الأمم المتحدة للتنمية / البنك الدولي / منظمة الصحة العالمية الخاص للبحوث والتدريب في مجال أمراض المناطق المدارية، جنيف، سويسرا. نشكر الدكتور توم Shinnick من المراكز الامريكية لمكافحة الامراض والوقاية منها لتوجيهات بشأن الجينات والطفرات محددة لتدرج في مقايسة النموذج.

للمختبرات التي تتبع الاحتياطات العالمية PCR، فمن الناحية العملية أكثر كفاءة لتشمل العديد من ميكروأرس التضخيم وحشيات في الركيزة وغسل جميع ميكروأرس التضخيم في وقت واحد في حاوية كبيرة، كما هو موضح هنا. تنسيقات الاستهلاكية المتوفرة لأداء آخر التضخيم غسل ميكروأري الخطوات في مختومة تماما، مغلقة اختبار AMPLICON، كما ذكرت في مكان آخر 30،33. 1. الإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج وتنقية الأحماض النووية من العينة تحت ظروف السلامة الأحيائية المناسبة مع طريقة الاختيار. الشرط هو ان تكون الأحماض النووية من النقاء ما يكفي لغير المتماثلة، متعدد PCR التضخيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مساحة العمل عن طريق محو الأسطح والمعدات مع حلول إزالة التلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الكواشف التضخيم على الجليد أو كتلة الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية العقيمة 1.5 مل microfuge أنبوب لمزيج الرئيسي التضخيم، وتسمية العقيمة 0.2 مل microfuge تويكون لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن يتم إذابة الكواشف، لفترة وجيزة الدوامة وجمع محتويات في الجزء السفلي من أنبوب مع نبض تدور في الطرد المركزي صغيرة. لا دوامة طق البلمرة. نفض الغبار بلطف أنبوب لخلط وتابع مع نبض تدور في مصغرة الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزيج الرئيسي التضخيم باستخدام كميات رد فعل لكل عينة المبينة في الجدول 1. لمراعاة عدم دقة pipetting لممكن، وإعداد واحد على الأقل أكثر حجم رد الفعل من العدد الكلي للعينات التي يتم معالجتها. علما بأن مزيج الرئيسي يحتوي البلمرة طق إضافية، وفوق كل ما يتم توفيرها مع المخزن المؤقت PCR muliplex. إضافة فقط السيطرة التضخيم / تثبيط لمزيج الرئيسي بعد يتم الجمع بين جميع الكواشف الأخرى، وعاد أنابيب الأسهم كاشف للتخزين. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف </td><td> لكل عينة الحجم (ميكرولتر) </td><td> &lt;قوية&gt; النهائي [] </td></tr><tr><td> Mulitplex PCR العازلة مع HotStar طق زائد </td><td> 25 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> ألبومين المصل البقري (BSA) </td><td> 0.55 </td><td> 0.6 ملغ / مل </td></tr><tr><td> الفورماميد </td><td> 3.8 </td><td> 7.6٪ </td></tr><tr><td> البلمرة طق إضافية </td><td> 0.8 </td><td> وحدة / ميكرولتر (المجموع 4 وحدات) </td></tr><tr><td> السل المقاوم للأدوية المتعددة التمهيدي مزيج </td><td> 15.75 </td><td> - </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز خالية H 2 O </td><td> 2.1 </td><td> - </td></tr><tr><td> التضخيم / التحكم في تثبيط </td><td> 1 </td><td> 5.0 FG / ميكرولتر </td></tr><tr><td> مجموع </td><td> 49 </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1. السل المقاوم للأدوية المتعددة التضخيم ميكروأري سيد مزيج تكوينها. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة مزيج الرئيسي وجمع محتويات في الجزء السفلي من أنبوب مع نبض تدور في الطرد المركزي صغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين 49 ميكرولتر من مزيج الرئيسي و 1 ميكرولتر من M. الحمض النووي السل إلى كل من أنابيب عينة من الخطوة 1.4 أعلاه. لخارجي، لا للتحكم القالب (NTC)، استخدم 1 ميكرولتر من الماء الجزيئية الصف البيولوجيا بدلا من م. عينة من الحمض النووي السل. دوامة ونبض تدور الأنبوب (ق) عند الانتهاء. </li></ol> 2 قم بتحميل التضخيم ميكروأرس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 48 ميكرولتر من كل مزيج سيد / العينة على مركز ميكروأرس كل منها، والحرص على عدم لمس ميكروأري نفسه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع زلة غطاء على رأس طوقا ميكروأري والختم، والحرص على عدم اعتراض أي فقاعات الهواء في غرفة ميكروأري. يمكن فقاعات الهواء تؤثر سلبا على كفاءة التضخيموربما خلق التحف أو الضوضاء في الصورة ميكروأري اللاحقة. </li></ol> 3. ركوب الدراجات الحرارية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تحميل جميع ميكروأرس مع العينة، ركائز مكان على cycler الحرارية كتلة مسطحة. تأكد من أن الخيار غطاء ساخنة تشغيل &quot;إيقاف&quot;. وبالفعل تم الحصول عليها من أجهزة Akonni النظم البيولوجية يمكن تأهيله للاستخدام. خلاف ذلك، من المهم جدا للتحقق من أن كتلة cycler الحرارية المسطحة (ق) تقديم (ق) موحدة، التدفئة متناسقة عبر جميع ركائز ميكروأري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح برنامج cycler الحرارية، حدد البرنامج المناسب، أدخل &quot;50 ميكرولتر&quot; لحجم رد الفعل، والشروع في التشغيل. بروتوكول الدراجات الحرارية الموصوفة هنا تتكون من: <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ركوب الدراجات الحرارية خطوات </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 88 ° C </td><td> 5 دقائق </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 88 ° C </td><td> 30 ثانية </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 55 ° C </td><td> 1 دقيقة </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 65 ° C </td><td> 30 ثانية </td></tr><tr><td> 5 </td><td> كرر الخطوات من (2-4) لمدة 50 دورات </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 65 ° C </td><td> 3 دقيقة </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 55 ° C </td><td> 3 ساعة </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العدد الإجمالي للدورات الحرارية و 55 درجة مئوية بعد التضخيم عقد الوقت هي المتغيرات المستقلة أن المستخدم قد تعدل، حسب الحاجة أو المناسبة للتجربة محددة. لأن مزيج الرئيسي السل المقاوم للأدوية المتعددة يخلق غير المتماثلة amplicons (في الغالب الذين تقطعت بهم السبل واحد)، فإنه من المفيد عادة لتشمل دورات أكثر الحرارية عما يمكن استخدامها لالتقليدية، الأسي بروتوكول التضخيم PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند البرنامج ركوب الدراجات والتهجين الحرارية كاملة، إنهاء البرنامج، وإزالة ميكروأرس التضخيم، أغلق البرنامج، وإيقاف cycler الحرارية (ق).</li></ol> 4. غسل والجافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لغسل ما يصل الى 24 في وقت واحد ركائز، وإعداد 250 مل على الأقل 1X SSPE - 0.1٪ تريتون X-100 غسل العازلة، وحاويتين مع لا يقل عن 250 مل منزوع الأيونات أو الملة، س الصف المياه لكل منهما. في غسل العازلة يمكن أن تكون معدة مسبقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية زلة تغطية وحشية من كل التضخيم ميكروأري الغرفة باستخدام ملقط نهاية مسطحة. هذه الخطوة هي النقطة التي يوجد فيها أكبر خطر ضررا جسديا صفائف عنصر هلام. استخدام الضوابط المناسبة التلوث PCR لمنع انتشار الأحماض النووية تضخيمها داخل بيئة العمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ركائز ميكروأري في حامل الشريحة الأنسجة، ووضع كافة الشرائح في غسل بن تحتوي على غسل العازلة. تغطية الحاويات مع غطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل ميكروأرس لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع ميكروأرس كل ثلاث مرات في اثنين من يغسل المتعاقبة منزوع الأيونات أوملي-Q المياه الصف، والهواء الجاف. </li></ol> 5. التصوير وغير المتماثلة السل المقاوم للأدوية المتعددة التمهيدي مزيج يولد amplicons CY3 المسمى. ولا يمكن تصوير ميكروأرس عنصر هلام مع أي معيار ميكروأري تصوير قادرة على CY3 التصوير. الإجراء التالي هو التصوير محددة لمزيج السل المقاوم للأدوية المتعددة الماجستير، مجال Dx2100 تصوير المحمولة، وبرامج التحليل الآلي التي تقدمها Akonni. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من توصيل كابل إيثرنت من تصوير إلى جهاز الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على تصوير. يقع مفتاح الطاقة على اللوحة الخلفية للأداة. سوف المصابيح الزرقاء على الجزء الأمامي من تصوير تضيء عندما يتم تشغيل تصوير جرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على جهاز الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على سطح المكتب الكمبيوتر، انقر نقرا مزدوجا على أيقونة البرنامج لإطلاق برنامج تحليل الصور الآلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر البرنامج لتأسيس اتصال مع كاميرا تصوير. بمجرد تأسيس الاتصال، يصبح الزر تحليل المتاحة، ورسالة &quot;اتصال ناجح&quot; سوف تظهر في الزاوية اليسرى السفلى من الشاشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج ميكروأري التضخيم المجففة مع ميكروأري تواجه بعيدا عن المستخدم، ونحو عدسة الهدف. إذا تم الموجهة ميكروأري غير صحيح فيما يتعلق عدسة الكاميرا و، ستفشل برامج التحليل الآلي لوضع شبكة على الصورة مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق باب الوصول. معاينة الصورة سوف تكون متاحة على شاشة الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد التحليل النصي السل المقاوم للأدوية المتعددة من القائمة المنسدلة وأدخل وقت التعرض المطلوب (بالمللي ثانية). وهناك نقطة انطلاق نموذجية للعنصر هلام ميكروأرس التضخيم هو 100-500 ميللي ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سيتم عرض بكسل المشبعة على معاينة الصورة باللون الأحمر. ضبط الوقت التعرض لتقليل عدد وحدات البكسل المشبعة في مواضع فردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق تحليل لاكتساب وتحليل صورة مضان. البرنامج سيضع تلقائياالسل المقاوم للأدوية المتعددة الشبكة مقايسة محددة على الصورة، واستخراج كثافة متكاملة والقيم الأساسية، وتقديم تقرير عن نتائج مقاومة المخدرات والتنميط الجيني. فإن التحليل الآلي تأخذ عادة بضع ثوان. للصور التحدي التي تحتوي على الخدوش والغبار والتحف الفلورسنت، أو الأضرار المادية إلى ميزات ميكروأري، البرنامج قد تحتاج ما يصل الى 1 دقيقة لاستكمال التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تحليل كاملة، انقر على حفظ، حدد المجلد الوجهة، اكتب اسم الملف، ثم انقر فوق موافق. يتم حفظ البيانات ميكروأري الأساسية كملف XLS. ويمكن تصديرها للخارج الخط يحلل، إذا رغبت في ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تحليل كاملة، وإزالة ميكروأري التضخيم من تصوير وانقر على جديد لبدء تحليل المقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء من جمع البيانات، وإغلاق البرامج، إيقاف تشغيل الكمبيوتر، وإيقاف تصوير. </li></ol>

<ol>
	<li>Lemaire, J. -. F., Casenghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+diagnostics+for+tuberculosis:+fulfilling+patient+needs+first.">New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first.</a> J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, (2012).</li><li>Notomi, T., Okayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA.">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).</li><li>Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicase-dependent+isothermal+DNA+amplification.">Helicase-dependent isothermal DNA amplification.</a> EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).</li><li>Pritchard, C. G., Stefano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+detection+of+viral+nucleic+acid+at+subattomole+levels+using+Q+beta+replicase.">Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase.</a> Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).</li><li>Compton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sequence-based+amplification.">Nucleic acid sequence-based amplification.</a> Nature. 350, 91-92 (1991).</li><li>Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal,+in+vitro+amplification+of+nucleic+acids+by+a+multienzyme+reaction+modeled+after+retroviral+replication.">Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).</li><li>Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+chip+array+for+differentiation+of+mycobacterial+species+and+detection+of+drug+resistance.">Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance.</a> Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).</li><li>Troesch, A., Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+species+identification+and+rifampin+resistance+testing+with+high-density+DNA+probe+arrays.">Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).</li><li>Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+TB-biochip+oligonucleotide+microarray+system+for+rapid+detection+of+rifampin+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).</li><li>Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+defined+Mycobacterium+tuberculosis+populations+using+RNA+amplification+strategies.">Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies.</a> BMC Genomics. 9, 94 (2008).</li><li>Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+mycobacterium+species+isolates+by+DNA+microarray.">Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).</li><li>Park, H., Jang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+genotyping+of+Mycobacterium+species+from+clinical+isolates+and+specimens+by+oligonucleotide+array.">Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).</li><li>Yao, C., Zhu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+rpoB,+katG+and+inhA+gene+mutations+in+Mycobacterium+tuberculosis+clinical+isolates+from+Chongqing+as+determined+by+microarray.">Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray.</a> Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).</li><li>Sun, A. H., Fan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+rpoB+gene+mutations+in+rif-resistant+M.+tuberculosis+isolates+by+oligonucleotide+microarray.">Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray.</a> Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).</li><li>Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+drug-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+with+a+scanning-frame+oligonucleotide+microarray.">Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray.</a> Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).</li><li>Fu, L., Shinnick, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+action+of+INH+on+a+highly+INH-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strain+using+Genechips.">Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips.</a> Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).</li><li>Fu, L. M., Shinnick, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+exploration+of+the+drug+action+of+capreomycin+on+Mycobacterium+tuberculosis+using+Affymetrix+oligonucleotide+GeneChips.">Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips.</a> J. Infect. 54, 277-284 (2007).</li><li>Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray-based+pncA+genotyping+of+pyrazinamide-resistant+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).</li><li>Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+hybridisation+on+oligonucleotide+microarrays+for+analysis+of+drug-resistant+Mycobacterium+tuberculosis.">Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis.</a> Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).</li><li>Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+and+allele+specific+PCR+detection+of+point+mutations+in+Mycobacterium+tuberculosis+genes+associated+with+drug+resistance.">Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance.</a> J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).</li><li>Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+mapping+of+mutations+of+pyrazinamide-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strains+with+a+scanning-frame+oligonucleotide+microarray.">Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).</li><li>Yue, J., Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+rifampin-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strains+by+using+a+specialized+oligonucleotide+microarray.">Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).</li><li>Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+CombiChip+Mycobacteria+Drug-Resistance+detection+DNA+chip+for+identifying+mutations+associated+with+resistance+to+isoniazid+and+rifampin+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).</li><li>Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+macroarrays+for+the+identification+of+MDR+Mycobacterium+tuberculosis.">The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).</li><li>Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+the+genotype+MTBDR+line+probe+assay+for+detection+of+resistance+to+rifampin+and+isoniazid+in+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis+with+low-+and+high-level+resistance.">Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).</li><li>Padilla, E., Gonzalez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+the+new+version+of+the+INNO-LiPA+Mycobacteria+and+GenoType+Mycobacterium+assays+for+identification+of+Mycobacterium+species+from+MB/BacT+liquid+cultures+artificially+inoculated+with+mycobacterial+strains.">Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains.</a> J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).</li><li>Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diagnostic+performance+of+the+GenoType+MTBDRplus+Version+2+line+probe+assay+is+equivalent+to+that+of+the+Xpert+MTB/RIF+assay.">The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay.</a> J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).</li><li>Sekiguchi, J. -. I., Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+line+probe+assay+for+rapid+identification+of+pncA+mutations+in+pyrazinamide-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strains.">Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).</li><li>Chandler, D. P., Bryant, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+amplification+microarrays+for+infectious+disease+diagnostics.">Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics.</a> Microarrays. 1, 107-124 (2012).</li><li>Vincent, V., Rigouts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TDR+Tuberculosis+Strain+Bank:+a+resource+for+basic+science,+tool+development+and+diagnostic+services.">The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services.</a> Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).</li><li>Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-volatile+copolymer+compositions+for+fabricating+gel+element+microarrays.">Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays.</a> Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).</li><li>Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plastic,+disposable+microfluidic+flow+cell+for+coupled+on-chip+PCR+and+microarray+detection+of+infectious+agents.">A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents.</a> Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).</li><li>Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplicon+secondary+structure+prevents+target+hybridization+to+oligonucleotide+microarrays.">Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).</li><li>El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+sloppy+molecular+beacon+probes+for+identification+of+Mycobacterial+species.">Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).</li><li>Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+molecular+detection+of+tuberculosis+and+rifampin+resistance.">Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).</li></ol>

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

مدى مضاعفة مع ميكروأري التضخيم وأملت في نهاية المطاف من كفاءة متعددة غير المتماثلة PCR، وليس ميكروأري. في تجربتنا، 10-12 أزواج التمهيدي فريدة من نوعها يمكن بسهولة المضاعفة في شكل التضخيم ميكروأري. وبالتالي تطبيق التمهيدي والتحقيق معايير التصميم التقليدية لفحوصات جديد?...

وتعتبر اكتشاف الحالات المبكر والعلاج السريع للاستراتيجيات المكافحة الأكثر فعالية للحد من المتفطرة السلية (MTB) نقل 1، وهناك الآن توافق واسع في المجتمع السل أن نقطة الرعاية (مركز عمليات) أو بالقرب من مركز عمليات اختبار لتشخيص السل في وقت واحد وهناك حاجة المقاومة للأدوية (DR). تقنيات مثل GeneXpert Cepheid وغيرها من اختبارات الحمض النووي التضخيم تقليل الوقت لتشخيص لكثير من مرضى السل، وتقديم قراءة التدريجي السريع تشير إلى المقاومة ريفامبين أو الطفرات اختيارها تمنح المقاومة لغيرها من أدوية الخط الأول أو الثاني 2. على الرغم من أن مصممة في الوقت الحقيقي واختبارات الحمض النووي متساوي التضخيم لتحديد الطفرات المقاومة للعقاقير التي تؤدي إلى مرض السل المقاوم للأدوية المتعددة، فإن الطيف من الطفرات التي غالبا ما تكون غير كافية كشف لتصميم نظام المخدرات فردية المقابلة لملف المقاومة للأدوية للمريض، والقيود الفنية المتعلقةلالبصرية عبر الحديث أو تعقيد التضخيم والإبلاغ كيمياء مايو 3-7 تحديد عدد مواضع أو الطفرات التي يتم الكشف عنها. وبالتالي، هناك حاجة تكنولوجيات الكشف بسعة مضاعفة أعلى لمعالجة الثغرات المعروفة في التشخيص POC السل المقاوم للأدوية. يمكن ميكروأرس وأيدت منظمة الصحة العالمية، هين المقايسات خط التحقيق مواجهة &quot;الجينات متعددة، والطفرات متعددة&quot; تحديا لتشخيص السل المقاوم للأدوية المتعددة 8-29. للأسف، هذه، المنصات كشف المضاعفة القائم على التهجين استخدام متعددة الخطوات، معقدة، والبروتوكولات AMPLICON المفتوح التي تتطلب التدريب الهامة والكفاءة في التقنيات الجزيئية. تم تصميم ميكروأري التضخيم 30 لمعالجة بعض هذه ميكروأري تدفق العمل والاهتمامات التشغيلية. مبادئ فلويديك تبسيط هي لتضخيم، هجن، وكشف الأهداف الحمض النووي داخل غرفة ميكروفلويديك واحد. المستخدم يدخل حمض النووي والتضخيم ماسثالثا خلط في غرفة فلويديك مع ماصة ويبدأ بروتوكول الدراجات الحرارية. للأسلوب تجهيز الدفعات المعروضة هنا، يتم غسلها بعد ذلك في حل ميكروأرس السائبة، والمجففة، وتصويرها. وتوضح هذه الدراسة وظائف لميكروأري التضخيم باستخدام اختبار السل المقاوم للأدوية المتعددة ميكروأري لrpoB (30 الطفرات)، katG (2 الطفرات)، INHA (4 طفرات)، rpsL (2 الطفرات)، embB (1 الطفرة)، IS1245، IS6110 ، والتضخيم الداخلية والسيطرة التهجين. يتم تضمين واحد على الأقل زوج متطابق من تحقيقات ميكروأري (wildtype (WT) ومتحولة واحدة النوكليوتيدات (MU)) لكل طفرة من الاهتمام. الأحماض النووية تنقيته من مقاومة M. أدوية المتعددة السل هي من سلالة السل تقرير التجارة والتنمية 31 بنك. يتم تصنيع ميكروأرس عنصر هلام على ركائز الزجاج بواسطة البلمرة أساسا كما هو موضح في مكان آخر 32، إلا أن نستخدم 4٪ و 0.05 ملي مونومر كل التحقيق في polymerizخليط أوجه. وتحيط صفائف مع طوقا 50 مل قبل استخدامها. بعد ركوب الدراجات الحرارية، والتهجين، وغسل الخطوات، يتم تصوير ميكروأرس التضخيم على محلل المحمولة Akonni. ويتم الحصول على لتصحيح الخلفية، شدة إشارة متكاملة من الخام. معرض طرابلس الصور باستخدام خوارزمية دائرة ثابتة. يتم احتساب الضوضاء لكل عنصر هلام إلى ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري من الخلفيات بقعة المحلية. تعتبر الأهداف الجين عادة للكشف عن إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR) تقدر ≥ 3. من أجل تحديد وجود أو عدم وجود طفرة محددة في كل الجينات أو رامزة، ويتم احتساب نسبة التمايز من القيم SNR باسم (WT-MU) / (WT + MU). نسب التمايز &lt;0 تدل على طفرة مقاومة المخدرات في مكان الجريمة، في حين أن نسب&gt; 0 تدل على تسلسل من النوع البري.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips</td>
			<td>Akonni Biosystems</td>
			<td>Inquire</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#206143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Taq polymerase</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#201207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">RNAse-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#206143&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td>
			<td>#BP227-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#3B6917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">5X concentrated MDR-TB primer mix</td>
			<td>Akonni Biosystems</td>
			<td>Inquire</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">500 fg uL-1 amplification and inhibition control</td>
			<td>Akonni Biosystems</td>
			<td>Inquire</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">20X SSPE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td>
			<td>#BP1328-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td>
			<td>#BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Disinfecting Spray&#160;</td>
			<td>Current Technologies, Inc.</td>
			<td>#BRSPRAY128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">70% Isopropyl Alcohol</td>
			<td>Decon Labs, Inc.</td>
			<td>#8416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Equipment</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Microarray imager, with automated image and data analysis software</td>
			<td>Akonni Biosystems</td>
			<td>100-20011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Thermal cycler with flat block insert</td>
			<td>Akonni Biosystems</td>
			<td>100-10021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">High-throughput wash station and slide holder</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>HTW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dissecting forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td>
			<td>#10-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Mini Vortexer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#3365040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Mini-centrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#93000-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Airbrush Compressor Kit</td>
			<td>Central Pneumatic</td>
			<td>#95630</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstrating a multi-drug resistant mycobacterium tuberculosis amplification microarray

تبسيط سير العمل ميكروأري هو خطوة أولى ضرورية لخلق السل المقاوم للأدوية المتعددة التشخيص القائم على ميكروأري التي يمكن استخدامها بشكل روتيني في البيئات ذات الموارد أقل. وميكروأري التضخيم PCR التضخيم غير المتماثلة يجمع، واختيار حجم الهدف، ووضع العلامات المستهدفة، وميكروأري التهجين ضمن حل واحد وإلى غرفة ميكروفلويديك واحد. ويتجلى أسلوب تجهيز الدفعات مع مزيج الرئيسي غير المتماثلة 9-بلكس ومنخفض الكثافة عنصر هلام ميكروأري التنميط الجيني للأدوية المتعددة والسل المتفطرة مقاومة (السل المقاوم للأدوية المتعددة). بروتوكول الموصوفة هنا يمكن أن تكتمل في 6 ساعة وتوفير التنميط الجيني الصحيح مع ما لا يقل عن المعادل 1،000 خلية من خلايا الحمض النووي الجيني. دمج على رقاقة خطوات غسل غير مجدية، الأمر الذي سيؤدي في طريقة AMPLICON مغلقة تماما والنظام. مدى مضاعفة مع ميكروأري التضخيم مقيدة في نهاية المطاف من قبل عدد من أزواج التمهيدي التي يمكن دمجها في رئيسية واحدة مالتاسع ومازال تحقيق حساسية المرجوة ومقاييس الأداء والنوعية، بدلا من عدد من التحقيقات التي يجمد على صفيف. وبالمثل، فإن مجموع الوقت التحليل يمكن اختصارها أو تطول تبعا لاستخدام محدد المقصود، سؤال البحث، وحدود المطلوب من الكشف. ومع ذلك، فإن النهج العام يبسط إلى حد كبير سير العمل ميكروأري للمستخدم النهائي عن طريق تقليل عدد الخطوات مكثفة وتستغرق وقتا طويلا يدويا التجهيز، ويوفر طريقا البيوكيميائية وميكروفلويديك مبسطة لترجمة التشخيص القائم على ميكروأري في الممارسة السريرية الروتينية.

يمكن تحليل الصور النوعية توفر نظرة ثاقبة مصادر الضوضاء التجريبية أو تقلب التي تتحدى لتحديد الجداول في البيانات التي تولدها الآلي برمجيات تحليل الصور. وبالتالي، يمكن أن يكون مفيدا لبصريا التأكد من أن 1) جميع عناصر هلام سليمة وغير التالفة، 2) الخلفية العالمية غير خالية...

Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray at JoVE.com

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

وميكروأري التضخيم PCR التضخيم غير المتماثلة يجمع وميكروأري التهجين في غرفة واحدة، والذي يبسط إلى حد كبير سير العمل ميكروأري للمستخدم النهائي. تبسيط سير العمل ميكروأري هو خطوة أولى ضرورية لخلق التشخيص القائم على ميكروأري التي يمكن استخدامها بشكل روتيني في البيئات ذات الموارد أقل.

مما يدل على متعدد المخدرات مقاومة<em&gt; السل المتفطرة</em&gt; التضخيم ميكروأري

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

demonstrating-multi-drug-resistant-mycobacterium-tuberculosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

12.5K Views.  Akonni Biosystems, Inc..  وميكروأري التضخيم PCR التضخيم غير المتماثلة يجمع وميكروأري التهجين في غرفة واحدة، والذي يبسط إلى حد كبير سير العمل ميكروأري للمستخدم النهائي. تبسيط سير العمل ميكروأري هو خطوة أولى ضرورية لخلق التشخيص القائم على ميكروأري التي يمكن استخدامه...

Video: Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). Antimicrobial susceptibility testing (AST) of Mtb has traditionally been performed by the agar method of proportion or by 
macrobroth testing on an instrument such as the BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) or BacT/ALERT (bioM&eacute;rieux, Hazelwood, MO). The agar proportion method, while considered the &#x201C;gold&#x201D; standard of AST, is labor intensive and requires calculation of resistance by performing colony counts on drug-containing agar as compared to drug-free agar. If there is &ge;1% growth on the drug-containing medium as compared to drug-free medium, the organism is considered resistant to that drug. The macrobroth methods require instrumentation and test break point ("critical") drug concentrations for the first line drugs (isoniazid, ethambutol, rifampin, and pyrazinamide). The method described here is commercially available in a 96 well microtiter plate format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] and contains increasing concentrations of 12 antimicrobials used for treatment of tuberculosis including both first (isoniazid, rifampin, ethambutol) and second line drugs (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic acid, rifabutin, and streptomycin). Pyrazinamide, a first line drug, is not included in the microtiter plate due to its need for acidic test conditions. Advantages of the microtiter system include both ease of set up and faster turn around time (14 days) compared with traditional agar proportion (21 days). In addition, the plate can be set up from inoculum prepared using either broth or solid medium. Since the microtiter plate format is new and since Mtb presents unique safety challenges in the laboratory, this protocol will describe how to safely setup, incubate and read the microtiter plate.

Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis is challenging but critical for patient care. This microtiter plate format offers testing of 12 antimycobacterial drugs and provides minimum inhibitory concentration (MIC) values, which will aid in appropriate treatment.

اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات مجمع المتفطرة السل للأدوية الخط الأول والثاني عن طريق التخفيف في شكل حساء بلايت Microtiter

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

تحضير العينة من<em&gt; المتفطرة السلية</em&gt; خلاصات لدراسات النووية المغناطيسي الرنين Metabolomic

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

نمو المتفطرة السلية الأغشية الحيوية

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein has two distinct isoforms, the non-infectious host-encoded protein (PrPC) and the infectious protein (PrPSc), an abnormally-folded isoform of PrPC 8.
One of the challenges of working with prion agents is the long incubation period prior to the development of clinical signs following host inoculation13. This traditionally mandated long and expensive animal bioassay studies. Furthermore, the biochemical and biophysical properties of PrPSc are poorly characterized due to their unusual conformation and aggregation states.
PrPSc can seed the conversion of PrPC to PrPSc in vitro14. PMCA is an in vitro technique that takes advantage of this ability using sonication and incubation cycles to produce large amounts of PrPSc, at an accelerated rate, from a system containing excess amounts of PrPC and minute amounts of the PrPSc seed19. This technique has proven to effectively recapitulate the species and strain specificity of PrPSc conversion from PrPC, to emulate prion strain interference, and to amplify very low levels of PrPSc from infected tissues, fluids, and environmental samples6,7,16,23 .
This paper details the PMCA protocol, including recommendations for minimizing contamination, generating consistent results, and quantifying those results. We also discuss several PMCA applications, including generation and characterization of infectious prion strains, prion strain interference, and the detection of prions in the environment.

Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an in vitro assay for the study of prion conversion and strain and species barriers. It can also be used as a prion detection assay.

تضخيم بروتين دوري Misfolding من البريونات

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

نموذج تجريبي لدراسة الملاريا والسل عدوى مرافقة على انتقال الطبيعية السل المتفطرة و المتصورة berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

مقاربة الرواية تسليخ مجهري ليتعافى<em&gt; السل المتفطرة</em&gt; نصوص محددة من الفورمالين الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الرئة أورام حبيبية

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

نموذج الأنسجة 3D الرئة الإنسان للدراسات وظيفية على<em&gt; المتفطرة السلية</em&gt; العدوى

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

نظام لفعالية والسمسة فحص مثبطات استهداف بين الخلايا<em&gt; المتفطرة السلية</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

وإنتاجية عالية الفحص المدعم لتقييم فعالية الدواء ضد بلعم Passaged<em&gt; المتفطرة السلية</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

تحليل 18"فدج التصوير" PET/CT كأداة لدراسة بكتريا السل العدوى والعلاج في الإنسان عدم الرئيسات

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...