עבודה זו מומנה על ידי H64.09.016 מספר מענק vidi מארגון הולנד למחקר מדעי (NWO) לCPF. ע.מ. מודה לד&quot;ר סילבינה א Fratantoni להערות הביקורתיים שלה ותיקונים בכתב היד הסופית. GMRDL / EMMM נתמך על ידי ההולנדים הטכנולוגיה הקרן STW (12151 פרויקט ו11350), שהוא חלק מההסתדרות הלאומית, ואשר ממומן בחלקו על ידי המשרד לענייני כלכלה. אנו מודים קיטס קתרין ופיטר Drent של ניקון מכשירי Europe BV לקבלת סיוע ותמיכה. HX נתמכה על ידי האקדמיה ההולנדית המלכותית לאמנויות ולמדעים (מענק 11CDP10) וWT נתמכה על ידי מענק בארגון ההולנדי למחקר מדעי (מענק 820.02.006).

<ol>
	<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+formation+and+stabilization.">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).</li><li>Dailey, M. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+dendritic+structure+in+developing+hippocampal+slices.">The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices.</a> J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).</li><li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines.">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).</li><li>Jaworski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+regulate+dendritic+spine+morphology+and+synaptic+plasticity.">Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity.</a> Neuron. 61, 85-100 (2009).</li><li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitr&#228;ge+zur+Theorie+des+Mikroskops+und+der+mikroskopischen+Wahrnehmung.">Beitr&#228;ge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung.</a> Archiv f&#252;r mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 .</li><li>Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I5M:+3D+widefield+light+microscopy+with+better+than+100+nm+axial+resolution.">I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution.</a> J Microsc. 195, 10-16 (1999).</li><li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laterally+modulated+excitation+microscopy:+improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating.">Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. , 185-196 (1999).</li><li>Karadagli&#402;&#225;, D., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+formation+in+structured+illumination+wide-field+fluorescence+microscopy.">Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy.</a> Micron. 39, 808-818 (2008).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320, 1332-1336 (2008).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+structured-illumination+microscopy:+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution.">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).</li><li>Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+dendritic+spines+by+STED+microscopy.">Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).</li><li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination.">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat Methods. 6, 339-342 (2009).</li><li>James, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligned+microcontact+printing+of+micrometer-scale+poly-L-lysine+structures+for+controlled+growth+of+cultured+neurons+on+planar+microelectrode+arrays.">Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).</li><li>Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+detailed,+cell-specific+neuroanatomy+of+dendritic+spines+using+microinjection+and+confocal+microscopy.">High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy.</a> Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).</li><li>Fitzsimons, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+the+glucocorticoid+receptor+alters+functional+integration+of+newborn+neurons+in+the+adult+hippocampus+and+impairs+fear-motivated+behavior.">Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior.</a> Mol Psychiatry. , (2012).</li><li>van Hooijdonk, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+transgene+delivery+to+the+hippocampus+reveals+sub-field+specific+differences+in+expression.">Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression.</a> BMC Neurosci. , (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal,+a+new+serum-free+medium+combination.">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).</li><li>Izeddin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+dynamic+imaging+of+dendritic+spines+using+a+low-affinity+photoconvertible+actin+probe.">Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

במאמר זה פרוטוקול עבודה לקוצים הדנדריטים תמונה מתא העצב בהיפוקמפוס עיקרי חולדה בתרבית במבחנה באמצעות ה-SIM הוא תאר. שיטת תרבות נוירון היפוקמפוס העיקרית היא עיבוד של השיטה המקורית שתוארה על ידי Kaech והבנקאי 18. ההבדלים העיקריים הם השימוש במדיום Neurobasal/B27 תרבות, ...

עמוד השדרה הדנדריטים היא בליטה קטנה של קרום תא העצב. מבנה אופייני זו מתמחה לקבל בדרך כלל קלט מסינפסה אחת ומייצג את שטח המגע הפיזי בין שני תאי עצב. רוב הקוצים הדנדריטים תפקודי בוגרים מורכבים מקצה כדורי, ראש כינה, וצוואר דק שמחבר את הראש לפיר הדנדריטים. עם זאת, עמוד השדרה אינה סטטיים ופעיל להעביר ולשנות את המורפולוגיה שלהם ברציפות גם במוח הבוגר 2. בתוך פרק 2 בשבוע של זמן, תרבויות נוירון בהיפוקמפוס עכברוש העיקרי נובעות מזמן שלאחר לידה עוברי או בתחילת סוף לפתח סוכות הדנדריטים מורכבות עם בליטות קרום רבות שתתפתחנה מfilipodia המוקדם למבנים דמויי עמוד השדרה-3. בהתבסס על התנהגות דינמית זו ומאפיינים אחרים, קוצים הדנדריטים הם חשבו לספק מצע אנטומיים לאחסון זיכרון ו4,5 שידור סינפטי. בהינתן הדואר תפקיד קריטי שגודל עמוד השדרה הדנדריטים וצורה שבתפקוד הסינפטי, חשוב למדוד את הממדים שלהם בצורה מדויקת. עמוד השדרה משתנה מסביב 200 ל -2,000 ננומטר באורך וניתן לזהות בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לייזר הסריקה confocal. עם זאת, ממדי עמוד השדרה אחרים מאשר אורך הם בדרך כלל מתחת לרזולוציה של המערכות אופטיות הקונבנציונלית, הקבוע באופן תיאורטי על ידי עקיפה סביב 200 ננומטרים 6. כוחות פתרון אלה אינם מספיקים להדמית פרטים מעודנים יותר, כגון הרוחב של צוואר עמוד השדרה וראשים. עבודה רבה הוקדשה לפתור את הבעיה הזו ושיטות מיקרוסקופיה רבות חדשות יחסית ברזולוציה הסופר סיפקו התקדמות משמעותית. בפרט, זה אפשרי כדי להשיג רזולוציה מעבר לגבול הקלאסי, בלי לזנוח את כל אור פליטה באמצעות מיקרוסקופיה תאורה מובנה רוחבי (SIM) בשדה רחב, מיקרוסקופ שאינו confocal 7-10. שימוש בטכניקה זו בשילוב עם אי - Lineaשיטות מיקרוסקופיה r, זה אפשרי תיאורטית לשפר את הרזולוציה לרוחב של מיקרוסקופ האופטי על ידי גורם בלתי מוגבל 11. עם זאת, ברוב מקרי ניסיוני, ה-SIM מאפשר לעלות את מגבלת הרזולוציה בפקטור של שתי 1. טכניקות מיקרוסקופיה אופטית אחרות רזולוציה סופר כגון מיקרוסקופיה דלדול פליטה מאולצת (STED) 12 ומיקרוסקופיה לוקליזציה צילום הפעלה (PALM) 12 הוחלו על הדמיה של קוצים הדנדריטים. שיטות המבוססת על לוקליזציה כגון PALM דורשות מספר גדול מאוד של תמונות גולמיות כדי להשיג רזולוציה סופר ולכן הם מוגבלים במהירות. מצד השני, STED יכולה להשיג מהירות גבוהה הדמיה, אם כי בספירת פוטון נמוכה יחסית ושדות קטנים של תצוגה, אשר לא יכול להיות במקרה של 13 ה-SIM. במאמר זה המטרה היא לספק פרוטוקול עבודה לקוצים הדנדריטים תמונה מתא העצב בהיפוקמפוס עיקרי חולדה בתרבית במבחנה </em&gt; באמצעות ה-SIM. הפרוטוקול מורכב משני שלבים מובחנים: אחד ראשוני בהיקף של ההקמה, פיתוח, transfection ואימונוהיסטוכימיה של תרבויות נוירון עכברוש עיקריות בהיפוקמפוס ושלב מאוחר המוקדש לדגום הדמיה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope with illumination</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow cell culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature dry-oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator (5% CO2, 37 &#176;C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon structured illumination microscope setup consisting of:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIM Illuminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Stage Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCL Nano-Drive piezo controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIM Microscope Enclosure temperature control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor EM-CCD Camera iXon DU897</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC with Microsoft Windows 7 Home Edition</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon&#8217;s NiS Elements 6.14 SIM software package</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon type A immersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy

קוצים הדנדריטים הם בליטות המתעוררות מדנדריט של נוירון ולייצג את מטרות postsynaptic העיקריות של תשומות מעוררות במוח. התקדמות טכנולוגית זיהו את המבנים האלה כמרכיבים מרכזיים בקישוריות נוירון ופלסטיות הסינפטית. ניתוח כמותי של מורפולוגיה עמוד השדרה באמצעות מיקרוסקופ אור נותר בעיה מהותית בשל מגבלות טכניות הקשורות לגבול השבירה הפנימי של האור. קוצים הדנדריטים יכולים להיות מזוהים בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לייזר הסריקה confocal. עם זאת, מדידת שינויים עדינים בצורה ובגודל של עמוד השדרה קשה בגלל ממדי עמוד השדרה אחרים מאשר אורך הם בדרך כלל קטנים יותר מרזולוציה אופטית קונבנציונלית שנקבעה על ידי גבול הרזולוציה התיאורטי של מיקרוסקופ אור של 200 ננומטר. טכניקות ברזולוציה כמה שפותחו לאחרונה סופר כבר בעבר מבנים הסלולר תמונה קטנים יותר מננומטר 200, כולל קוצים הדנדריטים. Tטכניקות hese מתבססות על פעילות שדה הרחוק קלאסית ולכן מאפשרות השימוש בשיטות הכנת מדגם קיימות ולתמונה מעבר לפני השטח של דגימה. שתואר כאן הוא פרוטוקול עבודה ליישם מיקרוסקופיה ברזולוציה מובנה סופר תאורה (SIM) להדמיה של קוצים הדנדריטים בתרבויות נוירון היפוקמפוס עיקריות. יישומים אפשריים של ה-SIM חפיפה עם אלו של מיקרוסקופיה confocal. עם זאת, שתי הטכניקות להציג תחולה שונה. SIM מציע רזולוציה רוחב אפקטיבית גבוה יותר, ואילו מיקרוסקופיה confocal, בשל השימוש בחריר פיזי, משיגה שיפור רזולוציה על חשבון הסרת מחוץ לפוקוס אור. בפרוטוקול זה, הנוירונים עיקריים הם תרבותיים על coverslips זכוכית באמצעות פרוטוקול סטנדרטי, transfected עם פלסמידים-DNA המקודדים חלבוני ניאון וצלמו באמצעות ה-SIM. כל הפרוטוקול המתואר במסמך זה לוקח כ 2 שבועות, בגלל קוצים הדנדריטים הם צילמו אחרי 16-17 ימים במבחנה, כאשרהתפתחות דנדריטים היא אופטימלית. לאחר השלמת הפרוטוקול, ניתן לשחזר קוצים הדנדריטים ב3D מסדרה של ערימות תמונת ה-SIM באמצעות תוכנה מיוחדת.

שתואר כאן הוא פרוטוקול עבודה סטנדרטי להדמית קוצים הדנדריטים מתא העצב בהיפוקמפוס עכברוש עיקרי במבחנה באמצעות ה-SIM. זרימת העבודה הפרוטוקול והצעדים המכריעים שלה מוצגות באיור 1. בסך הכל, הפרוטוקול לוקח כ 2 שבועות של עבודה ניסויית מופרדים בשלב ראשון של הכנת ?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy at JoVE.com

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבודה לקוצים הדנדריטים תמונה מתא העצב בהיפוקמפוס במבחנה באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית (SIM). מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר באמצעות ה-SIM מספקת רזולוציית תמונה באופן משמעותי מעבר לגבול השתברות האור בכל שלושת הממדים מרחביים, המאפשרת ההדמיה של קוצים הדנדריטים בודדים עם פירוט משופר.

הדמיה קוצים הדנדריטים של העכברוש הראשי נוירונים בהיפוקמפוס באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

imaging-dendritic-spines-rat-primary-hippocampal-neurons-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.7K Views.  University of Amsterdam.  מאמר זה מתאר פרוטוקול עבודה לקוצים הדנדריטים תמונה מתא העצב בהיפוקמפוס במבחנה באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית (SIM). מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר באמצעות ה-SIM מספקת רזולוציית תמונה באופן משמעותי מעבר לגבול השתברות האור בכל שלושת הממדים ...

Video: Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) של החלבונים המתויגים הקרינה הקוצים הדנדריטים של נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

הקלטת דיי מתח רגישה מהאקסונים, הדנדריטים וקוצים הדנדריטים של נוירונים בודדים בפרוסות מוח

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

סידן פוספט Transfection של ראשוני נוירונים בהיפוקמפוס

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

תמונות בשידור חי של GLUT4 חלבון בבני אדם העכבר נוירונים היפותלמי העיקרי באמצעות מיקרוסקופ Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

הדור של נוירוספירות מ מעורב היפוקמאל ראשוני ונוירונים בקליפת המוח מבודדים מ E14-E16 ספראג העובר עכברוש

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity

Computational modeling of diffusion and reaction of chemical species in a three-dimensional (3D) geometry is a fundamental method to understand the mechanisms of synaptic plasticity in dendritic spines. In this protocol, the detailed 3D structure of the dendrites and dendritic spines is modeled with meshes on the software Blender with CellBlender. The synaptic and extrasynaptic regions are defined on the mesh. Next, the synaptic receptor and synaptic anchor molecules are defined with their diffusion constants. Finally, the chemical reactions between synaptic receptors and synaptic anchors are included and the computational model is solved numerically with the software MCell. This method describes the spatiotemporal path of every single molecule in a 3D geometrical structure. Thus, it is very useful to study the trafficking of synaptic receptors in and out of the dendritic spines during the occurrence of synaptic plasticity. A limitation of this method is that the high number of molecules slows the speed of the simulations. Modeling of dendritic spines with this method allows the study of homosynaptic potentiation and depression within single spines and heterosynaptic plasticity between neighbor dendritic spines.

The protocol develops a three-dimensional (3D) model of a dendritic segment with dendritic spines for modeling synaptic plasticity. The constructed mesh can be used for computational modeling of AMPA receptor trafficking in the long-term synaptic plasticity using the software program Blender with CellBlender and MCell.

מידול תלת-מיוד של קוצים דנדריטיים עם פלסטיות סינפטית

Computational modeling of diffusion and reaction of chemical species in a three-dimensional (3D) geometry is a fundamental method to understand the ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic spines have been described for DD GABAergic neurons as the input sites from presynaptic cholinergic neurons in the motor circuit of Caenorhabditis elegans. This synaptic circuit can now serve as a powerful new in vivo model of spine morphogenesis and function that exploits the facile genetics and ready accessibility of C. elegans to live-cell imaging. 
This protocol describes experimental strategies for assessing DD spine structure and function. In this approach, a super-resolution imaging strategy is used to visualize the intricate shapes of actin-rich dendritic spines. To evaluate the DD spine function, the light-activated opsin, Chrimson, stimulates the presynaptic cholinergic neurons, and the calcium indicator, GCaMP, reports the evoked calcium transients in postsynaptic DD spines. Together, these methods comprise powerful approaches for identifying genetic determinants of dendritic spines in C. elegans that could also direct spine morphogenesis and function in the brain.

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are important cellular features of the nervous system. Here live imaging methods are described for assessing the structure and function of dendritic spines in C. elegans.&#160;These approaches support the development of mutant screens for genes that define dendritic spine shape or function.

הדמיה של קוצים דנדריטיים בקאנורהבדיטיס אלגנס

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה טורית של פרצוף בלוק (SBEM) לחקר קוצים דנדריטים

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...