פרוטוקול זה מתאר שיטות להדמיית מורפולוגיות של עמוד השדרה הדנדריטי וסידן חולף בנוירונים C.elegans. הגישה שלנו צריכה להקל על גישות גנטיות כדי לגלות דטרמיננטות של מורפוגנזה ותפקוד עמוד השדרה. הפרוטוקול שלנו כולל קוצים דנדריטיים בנוירונים GABAergic.
קוצים בסוגים אחרים של נוירונים C.elegans ניתן לחקור גם בשיטות אלה. הפרוטוקול שלנו מתאר שיטות לשיתוק C.elegans חיים. חשוב במיוחד למנוע תנועת בעלי חיים במהלך רכישת תמונה, ולבחור את תצורות הלייזר הנכונות כדי לעורר ולתעד את הפעילות העצבית.
כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה, הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של תמיסת הרדמה, וכמותם של 15 עד 20 תולעים בוגרות צעירות על רפידות 10% אגרוז. לאחר מכן יש למרוח את הכיסוי כדי לשתק את התולעים, ולאטום את קצוות הכיסוי עם תערובת חומרי איטום דבק מומסת. לרכישה ברזולוציה גבוהה, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר המצויד במיקרוסקופיה סופר-רזולוציה.
רכוש ערימות Z באמצעות גודל הצעד המומלץ על-ידי תוכנת היצרן. אסוף סדרה של מקטעים אופטיים המשתרעים על פני הנפח הכולל של תהליך הגחון הגבי D או DD. שלח את ערימות Z לעיבוד תמונה באמצעות תוכנת היצרן, ונתח תמונות עם ציון גבוה משבע.
לרכישת Nyquist, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר, ובחר את גודל הפיקסלים האופטימלי עבור אורך הגל של האור והצמצם המספרי של העדשה האובייקטיבית. לאחר מכן שלח את המחסנית לפירוק תלת-ממדי באמצעות אלגוריתם אוטומטי. לניתוח תמונה, השתמש בתוכנת עיבוד תמונה מתאימה כדי ליצור הקרנות בעוצמה מרבית של ערימות Z.
ולספור ידנית את הבליטות על דנדריט DD. לאחר מכן קבע את אורך דנדריט DD הניקוד כדי לחשב את צפיפות הקוצים לכל 10 מיקרומטר של DD דנדריט. לאחר מכן סווגו את הקוצים כרזים או כפטריות, פילופודיאליים, סתמיים או מסועפים.
באמצעות טכניקות קונבנציונליות כגון מיקרו-הזרקה, יצירת תולעים מהונדסות המבטאות את חיישן הסידן GCaMP בנוירוני DD, ו-Chrimson, רודופסין ערוץ עם תזוזה אדומה בנוירוני VA קדם-סינפטיים. לאחר מכן, מתחת למכסה מנוע למינרי, הכינו את כל צלחות הטרנס-רשתית או ה-ATR על ידי הוספת 300 מיקרוליטרים של תרבית חיידקי OP50 שגדלה בן לילה, ו-0.25 מיקרוליטרים של ATR לכל צלחת אגר בינונית לגידול נמטודות בגודל 60 מילימטרים. ואז להפיץ את התרבות עם מוט זכוכית סטרילי.
עבור לוחות בקרה, להוסיף 300 microliters של חיידקי OP50 ו 0.25 microliters של אתנול. כדי לאפשר צמיחת חיידקים, דגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות, מוגנות מפני אור הסביבה. כדי לערוך את הניסוי, הניחו חמישה זחלי שלב L4 על לוחות ATR או בקרה מזרעים OP50, ודגרו את הלוחות בחושך בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס.
לאחר שלושה ימים, השתמש במיקרוסקופ מנתח סטריאו כדי לאשר את התפתחות הפות, ובחר צאצאי שלב L4 מה- ATR ולוחות בקרה להדמיה. לאחר מכן, מקם שני מיקרוליטרים של פוליבידים של 0.05 מיקרומטר על שקופית מיקרוסקופ. ומניחים כ-10 זחלי L4 בתמיסה.
באמצעות חוט פלטינה, הוסף כדורית קטנה של דבק סופר לתמיסה. סובבו את התמיסה בעדינות כדי ליצור גדילים נימה של דבק. לאחר מכן מוסיפים שלושה מיקרוליטרים של מאגר M9.
לאחר מכן יש למרוח את הכיסוי ולאטום את קצוותיו כפי שהוכח קודם לכן. כדי לתעד ארעי סידן מעוררים בעמוד השדרה הדנדריטי, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב, והתאם את שלב המיקרוסקופ כדי למקם את עמודי השדרה של DD במישור המוקד. לאחר מכן הגדר רכישת קיטועי זמן כדי להאיר את הדגימה עם קו לייזר של 488 ננומטר בכל מסגרת לזיהוי פלואורסצנציה של GCaMP, וקו לייזר של 561 ננומטר במרווחים מחזוריים לעירור ארגמן.
להדמיית סידן in vivo, יש להשתמש ב-2D-deconvolution וביישור תמונה כדי לתקן סטיות קלות מתנועת התולעת במהלך הרכישה. לאחר מכן הגדר את עמוד השדרה הדנדריטי DD כאזור העניין או החזר ההשקעה. שכפלו את ההחזר על ההשקעה ועברו לאזור שכן בתוך התולעת כדי לאסוף את אות הרקע.
לאחר מכן, באמצעות תוכנה מתאימה, ייצא את עוצמות ה- GFP ל- Excel עבור כל נקודת זמן, והפחת פלואורסצנציה של רקע מ- ROI פלואורסצנטי של עמוד השדרה. קבע את השינוי בפלואורסצנציה על ידי הפחתת הפלואורסצנציה של GFP במסגרת מיד לפני עירור 561 ננומטר או באפס מכל נקודת זמן לאחר עירור או דלתא F.ואז חלק ב- F אפס כדי לקבוע דלתא F מעל F אפס. וגרף את העקבות המנורמלים.
ראשית, קבע אם הנתונים מופצים באופן תקין באמצעות מבחן שפירו-וילק. עבור נתונים שאינם מופצים בדרך כלל, השתמש ב- ANOVA לא פרמטרי עם תיקון לאחר הוק לבדיקות מרובות. לחלופין, עבור מדידות המציגות התפלגות נורמלית או גאוסית, בצע בדיקת ANOVA פרמטרית זוגית עבור כל מדידה של פלואורסצנציה של GCaMP לפני ואחרי כל פולס של 561 ננומטר.
ונכון להשוואות מרובות בכל אחת משתי הקבוצות. תיוג של קוצים דנדריטיים DD עם שלושה סמנים עצמאיים, mCherry ציטוזולי, MYR:mRuby ו-LifeAct:GFP הניב צפיפות ממוצעת של 3.4 קוצים דנדריטיים DD לכל 10 מיקרון של דנדריט DD במבוגרים צעירים מסוג בר. הסמן GFP:Utrophin לא נכלל בניתוח זה מכיוון שהוא הניב צפיפות עמוד שדרה נמוכה משמעותית, אולי בגלל אינטראקציות של אוטרופין עם שלד האקטין שמניע את מורפוגנזה של עמוד השדרה.
גישת הדמיית התאים החיים אישרה כי המורפולוגיה הדקה בצורת פטריה של עמודי השדרה DD שולטת במבוגר בהשוואה לצורות עמוד שדרה חלופיות כמו פילופודיאל, סטוץ ומסועף. הפעלה של עמוד שדרה דנדריטי DD הוערכה על ידי איתות כולינרגי קדם-סינפטי בתולעים מהונדסות המבטאות GCaMP בנוירוני DD, וקרימזון בנוירוני VA קדם-סינפטיים. התפרצויות חולפות של אות GCaMP זוהו בעמוד השדרה DD מיד לאחר הפעלה אופטוגנטית של Chrimson בנוירוני VA קדם-סינפטיים.
ניסוי בקרה בהיעדר ATR אישר כי המדד לאות GCaMP תלוי בהפעלה האופטוגנטית של כרימזון שהיא תלוית ATR בלבד. כדי לדמיין קוצים DD, עדיף לדמיין בעלי חיים שוכבים על צדם כגון הקוצים הבולטים נמצאים בזוויות ישרות לנתיב האור. בשיטה זו, מדענים יכולים גם להשתמש במניפולציות פרמקולוגיות כדי להבין את המנגנונים המניעים ארעי סידן בעמוד השדרה DD.
