עבודה זו נתמכה על ידי האגודה האמריקנית לסרטן (PF-07-103-01-CSM), המכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM61275 ו P30 CA042014), לוקמיה וחברה לימפומה, סרטן צייד ואת הקרן.

siRNA transfection והכנת תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 4-היטב LabTek coverglass II החדרים ידי הוספת 0.5mL של פיברונקטין (10μg/mL) היטב כל אשר ישמשו. דגירה במשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) מתחמי עבור transfection הפוכה על פי הוראות של היצרן. השתמש בכמויות מומלץ אחד טוב של המנה 24 באר לכל תא לשמש (100μL סה&quot;כ). מוצר פרוטוקול מקביל / עבור transfection siRNA ניתן להחליף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פיברונקטין מבארות של coverglass החדרים. הוסף 100μL של siRNA / מתחמי RNAiMAX Lipofectamine היטב כל אשר ישמשו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 20,000 היסטון H2B-mCherry-להביע תאים (ב 500μL) לכל היטב המכיל תערובת transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תאים כדי לדגור במשך ~ 24 שעות לפני החלפת תערובת transfection עם 1mL של המדיום הסלולרי הרגיל תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים דגירה נוספת 24 שעות לפני רכישת התמונה (48 שעות שלאחר transfection). </li></ol> מיקרוסקופ ההתקנה רכישת תמונה <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישנם שלושה חלקים עיקריים ההתקנה רכישת תמונה: 1) תא חממה שמתאים על הבמה מיקרוסקופ ושומרת על סביבה לחה קבועה של 37 ° C, ו - 5% CO 2: 2) מיקרוסקופ המצויד הפוכה שלב אוטומטית, אוטומטיות פלואורסצנטי brightfield תריסים, וגלגלים מסנן אוטומטי: 3) חבילת תוכנה המשלבת שולטת על הבמה, תריסים, וגלגלים הסינון. ב ההתקנה הדמיה שלנו, אנו משתמשים תא אישית מתוך אוקו החממה Lab כי ניתן להשתמש עם השנייה LabTek החדרים coverglass. השלב, תריסים, וגלגלים לסנן נשלטים על ידי תוכנת Metamorph רמז:. המעבדה אוקו הבמה העליונה מערכת החממה כולל מתאמים עבור מגוון רחב של צלחת מאכל שונים, או בגדלים coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את השנייה LabTek החדרים coverglass בחממה על ידי פתיחת המכסה של החממה מראש התחמם equilibrated, הצבת coverglass החדרים בתוך המתאם, והחזקה במקום עם פלסטלינה. השאירו את המכסה על coverglass החדרים כך בינוני תרבית תאים לא יתייבש. סגור את המכסה ואת המיקום החממה כולה על הבמה מיקרוסקופ, על מנת להבטיח כי החממה מוחזק במקומו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש Metamorph, להגדיר את הניסוי שלך על ידי בחירת &quot;Apps / רכישת רב ממדית&quot; בשורת התפריטים של התוכנה. פעולה זו תציג חלון בו ניתן לבחור את תדירות ואורך timelapse, את זמן החשיפה לכל צבע (אם עושים מספר הגדרות), מספר ומיקום עמדות הבמה, ומספר Z-הסעיפים (אם ) הרצוי. . בחר היכן לשמור את קבצי הנתונים רמז: אם אתם משתמשים בתוכנה שאינה Metamorph, פונקציות עשוי להיות מעט שונה, אך הרעיון הכללי הוא זהה. Micromanager, קוד פתוח ImageJ מבוססי תוכנה הרכישה תואמת setups חומרה ביותר, היא חלופה מעולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . למטרות פרוטוקול זה, נוכל לרכוש תמונות בשני אורכי גל (brightfield ו mCherry) כל 15 דקות במשך 8 שעות 15 עמדות בשלב רמז: אם החלטה זמן טוב יותר הוא הרצוי, אז אתה יכול לקצר את מרווח הזמן בין רכישות, אולם , עמדות הבמה פחות ניתן להשתמש, ותאי mitotic ובכך פחות יהיה זמין עבור הניתוח. חשוב כאשר שוקלים מרווחי הזמן לקחת בחשבון את הזמן הנדרש עבור ההגה מסנן כדי לעבור בין מערכות הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את זמן החשיפה האופטימלי עבור כל אורך הגל הראשון על ידי התמקדות בתחום של תאים באמצעות תאורה brightfield. בתוך התוכנה, להתאים את פונקציית פוקוס אוטומטי רק עבור ערוץ brightfield (זה יאפשר את התוכנה פוקוס אוטומטי במיקום כל שלב לפני רכישת כל אחד) רמז:. אנו משתמשים מטרה 40X יבש שלב בניגוד לתת פתרון מצוין ללא צורך שמן . מטרות נוספות ניתן להשתמש בהתאם לרזולוציה אופטית הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר הגל mCherry ולהצמיד תמונה באמצעות חשיפה 50 msec. התאם את זמן החשיפה למינימום הנדרש כדי לראות תמונה טובה. זה חיוני כדי להגביל את כמות החשיפה לאור, כדי להבטיח כדאיות התא מתמשכת. ככלל, זו יכולה להיות מושגת הטובה ביותר באמצעות מסנן צפיפות ניטרלי (כדי להפחית את שטף האור עירור) וחשיפה ארוכה יותר זמן המצלמה ולא על ידי הגדלת עוצמת הארה. חזור על הליך זה עבור כל אורכי גל נוסף לשמש רמז:. כדי לקבוע לטווח ארוך כדאיות התא בעת החשיפה נתון עבור הניסוי שלך, תוכל לצפות בתצוגה מקדימה את המספר הכולל של תמונות בתא יכולים לשרוד מעל timelapse הרצוי על ידי התאמת המרווח זמנית timepoint מ דקות שניות (כלומר, 10 דקות. הופכת 10 שניות). אם התאים שלך לשרוד 100-200 חשיפות (אוהמספר המתאים), ואז החשיפה שלך היא בסדר. אם לא, להפחית את האור עירור שלך, זמן חשיפה, או את המספר הכולל של תמונות כדי לדמות בניסוי המלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא, בחר וסמן המספר המתאים של עמדות שלב, כך שתוכל להשיג דגימה מספקת של האוכלוסייה התא. Metamorph יתעד את עמדות יחזור לשם רכישת כל רמז:. אני בדרך כלל מנסה למצוא עמדות שבהן יש שפע של תאים לתמונה, אבל לא רבים, כך הם צפופים מדי. כמו כן, חשוב לבחור עמדות מספיק, כך יהיה לך סיכוי טוב לצפות במספר גדול של תאים מתקדמת באמצעות מיטוזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל timelapse, זמן חשיפה הגל, ואת המיקום מידע הבמה נרשמו, בחר את &quot;תצוגה מקדימה&quot; כפתור על המסך כדי לקבוע אם התוכנה היא שליטה על ציוד מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שאתה מרוצה, בחר את &quot;רוכשת את&quot; כפתור על המסך כדי להתחיל הרכישה. ואז לשבת בחיבוק ידיים ולאפשר את המחשב מיקרוסקופ לעשות את העבודה רמז:. ציית אוטומציה באמצעות סיבוב אחד לפחות מלא רכישה כדי להבטיח שהכל פועל כשורה. </li></ol> תמונה עיבוד וניתוח <ol start="16" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרכישה הסתיימה, השלב הבא הוא להעביר את נתוני התמונה לתוך טופס כי הוא יותר קל לטפל. למטרות פרוטוקול זה, אני אדגים הראשונה איך ליצור סרטים באמצעות Metamorph, אז איך ליצור תמונה montages באמצעות תוכנית ImageJ. פורמט או יהיה שימושי למטרות כימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצעד הראשון הוא לבדוק את הנתונים. כדי לעשות זאת, בחר &quot;Apps / סקירה נתונים רב מימדי&quot; בשורת התפריטים. בחר את המיקום של הקבצים שלך, ואז לבחור &quot;תצוגה&quot;. זה יאפשר לך לבדוק את ערימת התמונות מעמדת כל שלב בנפרד. בחר את המיקום הרצוי הבמה, ואז &quot;טען תמונות&quot;. תוכל לקדם את הנתונים דרך מסגרת לפי מסגרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאלו עמדות השלב בו התאים עוברים מיטוזה (כפי שנקבע על ידי ה-DNA והן מורפולוגיה תאית), אתה יכול לעשות סרטים montages באמצעות Metamorph, או עם תוכניות אחרות כגון ImageJ (זמין בחינם דרך NIH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך סרט Metamorph, בחר &quot;תהליך / שמור סרט&quot; בשורת התפריטים. תוכל לבחור את מסגרות לשימוש, מהירות, סוג הקובץ של הסרט. לאחר מכן, בחר &quot;שמור סרט&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את מונטאז, אני שומר את ערימת התמונה כקובץ STK., אשר ניתן להשתמש בתוכניות אחרות כגון ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הקובץ ב ImageJ ולקדם את מסגרות עד שתמצא תא עובר מיטוזה. . חתוך את האזור סביב התא ובחר &quot;תמונה / שכפול&quot; רמז: ודא לשכפל כל המסגרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את מונטאז, בחר &quot;תמונה / ערימות / לעשות מונטאז&quot; בשורת התפריטים. כאן אתה יכול לציין אילו מסגרות שברצונך לכלול, בגודל ובצורה של מונטאז&#39;, ואם אתה רוצה הגבולות בין המסגרות. בחר האלה והכה &quot;בסדר&quot;. .. שמור את מונטאז&#39; כקובץ tif ולעשות כל עיבוד נוסף או ImageJ או Adobe Photoshop רמז: שנה קבצים מונטאז&#39; מתבנית 16-bit המשמש Metamorph בפורמט 8 סיביות עבור עיבוד תמונה קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את זמן בשלבים שונים של מיטוזה, לקבוע t = 0 (הסימן הראשון עיבוי דנ&quot;א או עיגול התא), לספור את מספר מסגרות עד הכרומוזומים מיושרים בקו המשווה (זמן prophase / prometaphase), מסגרות עד הכרומוזומים מתחילים להפריד (זמן metaphase), מסגרות עד התאים מתחילים להשתטח (anaphase / telophase / cytokinesis). הזמן מחושב בכל שלב mitotic תלוי במרווח הזמן בין כל מסגרת. </li></ol> נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1878/1878fig1tmb.jpg" border="0" /> איור 1 מדגים את התוצאות של ניסוי טיפוסי transfection siRNA לשלוט באמצעות קו תא הלה הביע היסטון H2B-mCherry. שיטה זו של נעשה שימוש יעיל לכמת העיתוי mitotic, חושפים תפקיד בלתי צפוי עבור Nup153 nucleoporin בעיתוי של מיטוזה מאוחר 1. אנא <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1878/1878fig1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.

<ol>
	<li>Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleoporin+Nup153+has+separable+roles+in+both+early+mitotic+progression+and+the+resolution+of+mitosis.">The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).</li><li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+checkpoints+in+the+regulation+of+mitotic+progression.">Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression.</a> Dev Cell. 7, 45-60 (2004).</li><li>Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+structural+dynamics+of+chromosomes+in+living+cells+by+fluorescence+microscopy.">Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy.</a> Methods. 41, 158-167 (2007).</li><li>Prosser, S. L., Fry, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+the+centrosome+cycle+in+mammalian+cells.">Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).</li><li>Malureanu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BubR1+N+terminus+acts+as+a+soluble+inhibitor+of+cyclin+B+degradation+by+APC/C(Cdc20)+in+interphase.">BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase.</a> Dev Cell. 16, 118-131 (2009).</li><li>Anderson, D. J., Hetzer, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reshaping+of+the+endoplasmic+reticulum+limits+the+rate+for+nuclear+envelope+formation.">Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation.</a> J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).</li><li>Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+envelope+breakdown+proceeds+by+microtubule-induced+tearing+of+the+lamina.">Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina.</a> Cell. 108, 83-96 (2002).</li><li>Marcus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+spindle+behavior+using+confocal+microscopy.">Visualization of spindle behavior using confocal microscopy.</a> Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).</li><li>Steigemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint+protects+against+tetraploidization.">Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization.</a> Cell. 136, 473-484 (2009).</li><li>Draviam, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomic+screen+identifies+a+role+for+TAO1+kinase+in+spindle-checkpoint+signalling.">A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling.</a> Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).</li><li>Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+by+time-lapse+imaging+of+live+human+cells.">High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells.</a> Nat Methods. 3, 385-390 (2006).</li><li>Stegmeier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase+initiation+is+regulated+by+antagonistic+ubiquitination+and+deubiquitination+activities.">Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities.</a> Nature. 446, 876-881 (2007).</li></ol>

עם ההתקדמות בטכנולוגיית הדמיה חלבון פלואורסצנטי, הדמיה לחיות הפכה פעולה שגרתית של ניתוח הסלולר 2. מגוון של GFP (וגירסאות צבע אחר 3), מתויג חלבונים זמינים באופן נרחב או קל יחסית לבנות והוא יכול לשמש כדי לעקוב אחר מספר סימני ההיכר חלוקת התא, כולל ה-DNA / כרומוזום הדינמיקה 4, 5, 6 centrosome שכפול, cyclin B הדינמיקה 7, המעטפה פירוק והרכבה מחדש גרעיני 8, 9, ציר mitotic היווצרות 10, בשלבים שונים של cytokinesis 11. חלבונים Tagged ניתן להשתמש לבד או בשילוב כאשר ספקטרום עירור / פליטה של ​​תגי פלורסנט תואמים, המאפשר תיאום בין אירועים ספציפיים להיות מוערך. אם ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר ו / או הזמני הוא / הם הרצויה, מיקרוסקופיה confocal אם סריקה סריקת לייזר, דיסק ספינינג, או תהודה ניתן להשתמש, ואת רשימת אפשרויות במיקרוסקופ משוכלל עם רזולוציה הולך וגובר ממשיך לגדול. הדמיה חיה של מיטוזה בתאי יונקים יש גם מותאם לשימוש תפוקה גבוהה RNAi מסכי מולקולה קטנה 12-14. וכך, בעוד הניסויים הראשוניים של אחד באמצעות טכניקה זו עשויה להיות פשוטה יחסית, האפשרויות לבנייה על אסטרטגיה זו נרחב.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13778-075</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>12-565-337</td>
<td>Additional chamber sizes are available</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F1141</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stage-top cell incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OKO Lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can use any appropriate chamber</td>
</tr>
<tr>
<td>Automated inverted fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can use any appropriate microscope</td>
</tr>
<tr>
<td>Software package</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Metamorph</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can use any appropriate software</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

time-lapse imaging of mitosis after sirna transfection

שינויים בארגון הסלולר דינמיקה כרומוזום המתרחשים במהלך מיטוזה מתואמים באופן הדוק על מנת להבטיח ירושה מדויקת של תוכן גנומי הסלולר. אירועים Hallmark של מיטוזה, כגון תנועת כרומוזום, ניתן לעקוב בקלות על בסיס תאים בודדים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של שורות תאים יונקים להביע ספציפי GFP-tagged חלבונים. בשילוב עם דלדול RNAi מבוסס, זה יכול להיות שיטה חזקה איכון את הבמה (ים) של מיטוזה בו פגמים להתרחש לאחר רמות של חלבון מסוים כבר הוריד. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה בסיסית להערכת ההשפעה של depleting חלבון mitotic פוטנציאל הרגולציה על העיתוי של מיטוזה. תאים הם transfected עם siRNA, הניח בתא הבמה העליון הדגירה, הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטיות. אנו מתארים כיצד להשתמש בתוכנה כדי להגדיר ניסוי זמן לשגות, איך לעבד את התמונה sequences לעשות או עדיין תמונה montages או סרטים, וכיצד לכמת ולנתח את העיתוי של שלבים mitotic באמצעות תא שורת להביע mCherry- מתויג H2B היסטון. לבסוף, אנו דנים שיקולים חשובים לעיצוב ניסוי זמן לשגות. אסטרטגיה זו הוא משלים גישות אחרות מציע את היתרונות של 1) רגישות לשינויים קינטיקה שעשויים להיות לא נצפתה כאשר מסתכלים תאים כאוכלוסייה ו 2) ניתוח של מיטוזה ללא צורך לסנכרן את מחזור התא באמצעות טיפולים תרופתיים. מידע חזותי מניסויים הדמיה כזו לא רק מאפשרת המשנה שלבי מיטוזה להיות מוערך, אבל גם יכול לספק תובנה צפוי כי לא יהיה ברור מניתוח מחזור התא על ידי FACS.

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection at JoVE.com

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי לתמונה ולכמת את העיתוי mitotic של חיים יונקים התרבות תאים ורקמות לאחר transfection siRNA.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

time-lapse-imaging-of-mitosis-after-sirna-transfection

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Views.  University of Utah. כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי לתמונה ולכמת את העיתוי mitotic של חיים יונקים התרבות תאים ורקמות לאחר transfection siRNA.

Video: Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

ניטור אקטין פירוק עם מיקרוסקופיה זמן לשגות

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים לזמן-מיקרוסקופ תאורה מובנה לפקיעה

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, שיטה להרכבה ממושכת על זחל לטווח ארוך הדמיה לזמן קצר

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...