פרוטוקול זה מציג שתי דרכים נפרדות לזיהוי NKG2DLs על פני השטח של תאי AML. הטכניקה מספקת שיטת הכתמים מהירה וידידותית למשתמש כדי לזהות את כל NKG2DLs הידועים ואולי לא ידועים. שיטה זו מאפשרת הפרדה של תאי גזע לויקמיים מתאי AML בתפזורת, מה שמאפשר לאפיין תאים אלה עוד יותר.
התחל על ידי הפשרת ביוטין ואת צינורות חלבון היתוך NKG2D בטמפרטורת החדר. סובב במהירות את אבקת NKG2D FC, ולאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטרים של PBS כדי לשחזר את האבקה ולערבב ביסודיות באמצעות מיקרופיט P-1000. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חלבון ההיתוך NKG2DL לצינור ביוטין כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר, וערבבו את התמיסה ביסודיות עם מיקרופיפט P-100.
כדי להפשיר את תאי AML, להסיר את cryovial המכיל AML ראשוני מאחסון חנקן נוזלי, ומיד למקם אותו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. מעבירים בעדינות את הצינור קדימה ואחורה במים, ומאפשרים לתוכן המצוין להפשיר עד שנותר רק גבישי קרח קטן. מעבירים מיד את התאים המופשרים לצינור הבינוני המכיל ושוטפים את הנקינה באמצעות מיליליטר אחד של בינוני.
צנטריפוגות התאים ב 300 פעמים G במשך 10 דקות ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לכדור. לשטוף את התאים עם חמישה מיליליטר של RPMI בינוני המכיל 10%FCS ולחזור על צנטריפוגה. resuspend גלולה התא עם חוצץ כתמים לריכוז הסופי של 0.5 פעמים 10 לתאים השביעיים למיליליטר.
לאחר מכן להעביר 100 microliters של השעיית התא לתרבות תא 96 היטב צלחת U-התחתון וצנטריפוגה הצלחת ב 300 פעמים G במשך 10 דקות. השליכו את הסופר-טבעי מבלי להפריע לכדור. הכן תערובת ראשית של חלבון היתוך ביוטינילציה NKG2D כך שהתאים יתמכו מחדש בנפח סופי של 50 מיקרוליטרים לבאר עם ריכוז NKG2D סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר לבאר.
מוסיפים את תערובת המאסטר המוכנה ומוסיפים מחדש את כדורי התא עם פיפטה של 200 מיקרוליטרים. דגירה וצנטריפוגות הלוח כמתואר בכתב היד של הטקסט. הכן תערובת מאסטר באמצעות Streptavidin PE, כך התאים הם resuspended בנפח סופי של 50 microliters.
מוסיפים את תערובת האב לתאים ומערבבים מחדש את הכדורים עם פיפטה רב-ערוצית של 300 מיקרוליטרים. לאחר צנטריפוגה של הצלחת והשלכת supernatant, להשתמש micropipette רב ערוצי 300 microliter כדי resuspend כדורי התא ב 200 microliters של חוצץ כתמים בתוספת 7-AAD. לאחר מכן נתח את התאים באמצעות התקן ציטומטריית זרימה.
דגימות AML שנותחו הן חיוביות עבור CD34 ו NKG2DL, אבל אוכלוסיות משנה שליליות קיימות גם, עם ארבע אוכלוסיות שונות בסך הכל. אסטרטגיית הגטינג הטיפוסית מתחילה בבחירת האוכלוסייה העיקרית של תאים באמצעות ה- FSC וה- SSC שלהם. מכפילים ותאים מתים אינם נכללים בניתוח במורד הזרם.
השערים מותאמים באמצעות פקדי FMO כדי להבטיח זיהוי נכון של תאים חיוביים. עוצמות הפלואורסצנטיות של תאים חיוביים עבור CD34 לעומת NKG2DL מודגשות כאן. תאי AML חיוביים עבור CD34 מציגים ביטוי משטח נמוך יותר של NKG2DL, המציין כי ביטוי NKG2DL משויך לחוסר גזענות.
שלוש דגימות AML עיקריות הדגימו 19.8, 49.8 ו-89.4% אירועים חיוביים עבור כתמי חלבון ההיתוך לעומת 20.4, 50.4 ו-90.6% עבור כתמי נוגדן NKG2DL. מצד שני, כתמי ליגנד יחיד הראו מגוון של אירועים חיוביים עד 92%עם האחוזים משתנים על בסיס ליגנד. כאשר מנסים שיטה זו, חשוב מאוד להיות מהיר בעת הפשרת תאי AML העיקריים, כי הם שבירים יכול למות בקלות במהלך שלב זה.
לאחר ביצוע פרוטוקול זה, ניתן לבצע מיון תאים המבוסס על אות NKG2DL כדי להמשיך לחקור את האוכלוסיות.
