המחברים מודים לג&#39;רמי CM Teo וס ראיין אוליבר, על תרומתם ויולנטה Kilarska לעזרה בעיבוד תמונה. אנו מודים למתקן הגרעין בביופסיה של EPFL על תמיכתם במיקרוסקופ שני פוטונים עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקים מהנציבות האירופיות למחקר (DC-ימפה, 206,653-2), מסגרת האירופית פרויקט 7 (AngioScaff), הקרן השוויצרית הלאומית למדע (31-135,756) וקרן מכוני בריאות הלאומית של ארה&quot;ב (NIH) NIH לב /, ריאות ודם מכון (NHLBI) (RO1 HL096539). בנוסף, כספים ומונר פרס רוברט (שוויצרית סרטן הליגה) אפשרו הרכישה סטראו לייקה בשימוש במחקר זה. היו הממנים שום תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד.

כל ההליכים שבוצעו על בעלי חיים היו בהתאם קפדן עם השוויצרית חוק ההגנה על בעלי החיים, לפקודה בהגנה על בעלי חיים והפקודה על ניסויים בבעלי חיים. אנו מאשרים כי הוועדה שלנו בבעלי חיים המוסדיים טיפול ושימוש (IACUC), בשם ועדת מעקב דה de l&#39;Etat דה ואוד (מספר אישור: 2687), שאושרה על המחקר הזה באופן ספציפי. 1. הרכבת חיסון גידול של האוזן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות B16-F10-GFP בתאים מלנומה בצלחת פטרי 10 סנטימטר באמצעות DMEM + 10% FBS בתקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים הם מחוברות 80-90%, לשטוף אותם עם PBS ולנתק אותם על ידי trypsinization. ספין למטה תאים ב 1,500 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend את הכדור בפתרון מיליליטר רינגר 1 ולהעביר אותו לתוך צינור 1.5 מיליליטר Eppendorf. ספין שוב ולהסיר את כל supernatant למעט שכבה דקה של מדיום שנשאר רק מעל גלולה. Resuspend התאים לגמור עם תרחיף תא עבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם תערובת של ketאמין / dorbene [medetomidine] (75mg/kg-1mg/kg) ולוודא כי בעל החיים הוא מורדם במידה מספקת על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן עדין. להגדיל את ריכוז isoflurane בצעדים של .0.1% במקרה תנועות הם נצפו (למשל נסיגה של הכפה). שמור על עכבר על משטח רקטלי תרמיסטור בשליטת חימום (37 מעלות צלזיוס) במשך כל ההליך ולהגן על העיניים שלה עם משחת עיניים מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מזרק המילטון (33 מחט G, 10 מיליליטר מזרק נפח). הסר את מכסה הקצה עם המחט ולטעון 20 μl של תרחיף תאים בחלק העליון של חדר הקצה. למשוך בחזרה את הבוכנה עד 5 מיליליטר תרחיף נטען בתוך המזרק. הסר את התרחיף העודף מתא הקצה ולסגור את מכסה הקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סרט דביק, לתקן את הקצה הפרוקסימלי של האוזן על קצה אצבע. בזווית של ° 45, הכנס באיטיות את מחט מזרק המילטון בין הדרמיס הגבי והסחוס. ברגע שנכנס, לחדור הפרוקסימלי האוזן לדיסטלי בערך 2-3 מ&quot;מ. <br /&gt; הערה: ההליך של הזרקת תאים צריך להיעשות על ידי טכנאי מיומן ומוסמך. בנוסף תהליך זה חייב להיות לבצע לאט וברצף: ראשון המחט צריכה להיות ממוקם בצורה אופקית לעור אוזן ונוסף לאט לתוך הדרמיס האוזן. פעם אחת ורק אז בסוף המחט בעור, יש ללחוץ על המתג. לחיצה של הבוכנה תיזום חיסון תאים בעור. במקרה הלא הסביר של המחט עוברת שתי שכבות של הדרמיס האוזן, שכבת הסחוס ומזין את עורו של האדם שבצע את הניסוי, את הכאב שנגרם לאצבע experimentator צריך להיחשב כסימן מדאיג ולגרום לנסיגה מיידית של המחט מעור experimentator. במקרה שבוכנה לא צריך להיות לחוץ ועור צריך להיות מעוקר עם אלכוהול. לחלופין, חפץ דומם במקום אצבע יכול לשמש כדי לייצב את האוזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק תרחיף תא 3 μl ולחזור בו את המחט מהאוזן באיטיות.בואו תאים סרטניים מהווים גידול מוצק ב7-9 ימים ובצעו את צמיחת הגידול באמצעות סטראו הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לבצע את השלבים המוקדמים של אינטראקציה של תאים סרטניים עם מטריצת רקמה, להחיל 50 μl של 100,000 תאים סרטניים תלויים בפתרון של רינגר בדרמיס החשוף ומוכתם האוזן (לאחר שלב 3.3). </li></ol> 2. ניתוח אוזניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה ימים לפני הניסוי, לגלח את ראש העכבר, להשיר שער השערות סביב הראש והאוזן (10-15 שניות) ולשטוף עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם תערובת של חמצן וisoflurane (אינדוקציה 3-4% אחזקת 1-2%) humidified ולוודא כי בעל החיים הוא מורדם במידה מספקת על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן עדין. להגדיל את ריכוז isoflurane בצעדים של .0.1% במקרה תנועות הם נצפו (למשל נסיגה של הכפה). שמור על עכבר על משטח רקטלי תרמיסטור בשליטת חימום (37 מעלות צלזיוס) במשך כל ההליך ולהגן על העיניים שלה עםמשחת עיניים מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות פלטפורמה נעשתה מתוך 8 מגלשות היסטולוגיה הזכוכית מודבקות. הפך את העכבר על גבה ומניח בעדינות את אוזן גידול נושאות על הערימה של שקופיות זכוכית. השתמש בפסים קטנים של נייר דבק כדי לקבע את הקצוות הקדמי והאחוריים של האוזן לערימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את עור הגחון של האוזן לאורך antihelix של אפרכסת העכבר באמצעות אזמל. בעזרת פינצטה המעוגלת, בעדינות לקלף את הדרמיס הגחון וסחוס מהדרמיס הגב שבו הגידול היה מחוסן. משוך את עור הגחון וסחוס עם מלקחיים מעוקלים, וחושף את הדרמיס הגבי. הערה: אם כלי העיקריים של האוזן נחתכים או זרימת הדם לא לחזור לזרימה תקינה בתוך 15 דקות, האוזן לא ניתן להשתמש בהדמיה. תמיד לשמור על עור האוזן פתח רטובים באמצעות החיץ של רינגר ולהגן על הלחות באמצעות coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה שיש כלי גידול צורת דימום מתמשך, לעצור את הדימום על ידי הוספת 100 μlתרומבין (5 U / ml) במאגר של רינגר (102 mM NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 2 מ&quot;מ CaCl 2, לקטט נתרן 28 מ&quot;מ) בחלק העליון של האוזן למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את האוזן פעמיים עם כ 5 מיליליטר של החיץ של רינגר ולהסיר נוזלים מיותרים עם מגבונים סטריליים. מייד להמשיך לשלב הבא (אל תתנו לאוזן הפתוחה יבשה בכל נקודה!). </li></ol> 3. Immunofluorescence מכתים החיץ של השימוש רינגר בתוספת סרום אדם (1:10), נוגדן polyclonal העכבר המשני לנוגדנים אנושיים (01:50), ו125 IU / מיליליטר (2.5 מ&quot;ג / מיליליטר) aprotinin (חסימת חיץ) לכל הצעדים מכתים. Aprotinin מעכב קרישת plasmin קידום להגביל דימום ראשוני שעלולות להתרחש לאחר ניתוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקפלים את החלק של האוזן עם הדרמיס הפתוח לconchae eminentia ולייבש את עור אוזן החיצוני שלא נפתח עם מגבונים סטריליים. לשתק את האוזן על הערימה של שקופיות זכוכית על ידי יישום 0.5 μl של דבק כירורגים לdorsa הקדמי והאחוריקצות ליטר. ואז, בעדינות לשטח את הדרמיס אוזן גב על משטח הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל נוגדנים ראשוניים מיקוד מולקולות מטריצה ​​תאית בריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר בנפח כולל של 100 μl חסימת חיץ לאוזן החשוף. מכסה את האוזן עם פיסת כיסוי כדי למנוע הפתרון מכתים לייבוש על קצות אוזניים. דגירה במשך 15 דקות. שטוף את האוזן פעמיים עם כ 5 מיליליטר של חיץ רינגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל נוגדנים משני מתאימים או conjugates streptavidin (fluorophores עם גל עירור גבוה כגון 594 ננומטר או 647 ננומטר הם נוחים להדמית intravital) בריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר בנפח כולל של 100 μl חסימת חיץ לאוזן החשוף. מכסה את האוזן עם פיסת כיסוי והדגירה במשך 15 דקות. שטוף את האוזן פעמיים עם כ 5 מיליליטר של חיץ רינגר. </li></ol> 4. אינטראקציה של Splenocytes הופעל נישא בדם עם תאים סרטניים באתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7 ימים לאחר inoculation של מלנומה ה-GFP-B16-F10 על העור האחורי של עכבר congenic, להרדימו ולאסוף טחול. לבודד splenocytes עם הפרעה מכאנית של הטחול דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> splenocytes תווית במשך 8 דקות על 37 מעלות צלזיוס עם כתם האדום CMTPX הציטופלסמה תא (1 מיקרומטר PBS), לשטוף 4 פעמים ב15 מיליליטר על 4 מעלות צלזיוס ומייד להזריק עם מדיום חופשי 200 סרום μl לוריד הזנב של עכבר שאוזניה היו מחוסן עם B16-F10-GFP 7 ימים קודם לכן. </li></ol> 5. ההדמיה Intravital על ידי שימוש בסטראו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה לטווח קצר (עד 2 שעות), להוסיף למאגר של ascorbate-Ringer סטרילי מוכן טרי המכיל 140 ascorbate מ&quot;מ נתרן, 10 HEPES מ&quot;מ, 4 מ&quot;מ KCl ו5 מ&quot;מ CaCl 2, ב-pH של 7.5 (סופי החיץ של ascorbate-Ringer mOsM osmolarity 320) על גבי האוזן המשותקת. מכסה את האוזן עם coverslip ולהתחיל הדמיה באמצעות סטראו הקרינה עם עדשת 2X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה לטווח ארוך(יותר משעה 2), הצב את היציאה של מחט (מחוברת למאגר המכיל המאגר של ascorbate-רינגר) תחת coverslip, על 0.5 סנטימטר מהאוזן. השתמש במשאבת peristaltic במהירות של μl / 1 דקות כל הזמן לספק החיץ של ascorbate-רינגר לתא תחת coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את עדשת 1X (מרחק עבודה 6 ס&quot;מ) לעדשה 2X (מרחק עבודה 2 סנטימטר). פתח את תוכנת הרכישה ולהגדיר את ההגדרות של סטראו הניאון. במצלמה הגדרות לבחור 12 קצת כמו עומק צבע התמונה ולהתאים את טווח המצלמה של ערכים אפור בקנה מידה בין 0% (מינימום) ל.5.1% (מקסימום) ולהגדיר תיקון גמא ל2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רווח רכישה נקבע ל -1 (מינימום), עוצמת הקרינה ל1,000 (מקסימום), הגדלה מוגדרת 280X-320X ולהתאים את זמן חשיפת הימנעות יתר או תת חשיפה (זמן חשיפה צריך להיות שניות פחות מ 1). תלוי במספר תחומים הדמיה (בדרך כלל 10-20), מרווח זמן למחזור רכישה צריך להיות מוגדר להיותtween 1 עד 2 דקות. פעמים לקצר עלולות לגרום להלבנה וphototoxicity. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר כמה שדות המכילים תאים סרטניים, כמו גם חלבונים מוכתמים ECM (כמו באיור 3). שימוש בבמה הממונעת, לרכוש תמונות של הערוצים המתאימים ניאון (כמו ה-GFP וfluorophore 647 באיור 3) לאורך זמן (למשל כל 2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניסוי, להרדים את העכבר על פי הנחיות בעלי חיים מוסדיות. במקרה זה, בסופו של הניסוי, להרדים את העכבר הרדים ידי נקע בצוואר הרחם ואחריו exsanguination (זלוף intracardiac). </li></ol> 6. ההדמיה Intravital על ידי שימוש במיקרוסקופ multiphoton <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בגריז סיליקון, לבנות חומה מעגלית של כ -2 ס&quot;מ קוטר וגובה 2-3 מ&quot;מ סביב האוזן, מתחיל בבסיס של האוזן. ודא שאין נקודות דולפים. מלא את המעגל עם החיץ של ascorbate-רינגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום עכברעל הבמה ולחבר את כרית החימום (37 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנה פתוחה רכישה ולהגדיר את ההגדרות של המיקרוסקופ multiphoton. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עד ארבעה תחומים שונים המכילים תאים סרטניים וחלבונים מוכתמים ECM (כמו באיור 3). בדוגמא, את המנגינה הזאת לייזר Ti-Saphire 850 ננומטר של ה-GFP לאותת פוטון יחיד שלאחר מכן 647 לfluorophore 647 מכתים ולדמיין collagens סיבי עם SHG. לרכוש תמונות של הערוצים המתאימים ניאון (כמו ה-GFP וfluorophore 647 באיור 3) ודור שני הרמוני לאורך זמן, למשל כל 2 דקות, עם טבילה במים HCX APO 20X עם 1.00 עדשת NA ו -2 מרחק עבודה מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניסוי, להרדים עכבר הרדים עם נקע בצוואר הרחם ואחריו exsanguination (זלוף intracardiac). </li></ol>

<ol>
	<li>Martinez-Corral, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+lymphatic+vessels+in+development,+wound+healing,+inflammation,+and+tumor+metastasis.">In vivo imaging of lymphatic vessels in development, wound healing, inflammation, and tumor metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci. , (2012).</li><li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells.">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143, 134-144 (2010).</li><li>Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+lymphocyte+trafficking.">In vivo imaging of lymphocyte trafficking.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).</li><li>Kilarski, W., Petersson, L., Fuchs, P., Zielinski, M., Gerwins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+neovascularization+assay+for+screening+regulators+of+angiogenesis+and+assessing+their+effects+on+pre-existing+vessels.">An in vivo neovascularization assay for screening regulators of angiogenesis and assessing their effects on pre-existing vessels.</a> Angiogenesis. 15, 643-655 (2012).</li><li>Kilarski, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Immunofluorescence+for+Visualizing+the+Microcirculatory+and+Immune+Microenvironments+in+the+Mouse+Ear+Dermis.">Intravital Immunofluorescence for Visualizing the Microcirculatory and Immune Microenvironments in the Mouse Ear Dermis.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Steinbauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-transfected+tumor+cells+are+useful+in+examining+early+metastasis+in+vivo,+but+immune+reaction+precludes+long-term+tumor+development+studies+in+immunocompetent+mice.">GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).</li><li>Ohashi, T., Kiehart, D. P., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+elasticity+of+the+fibronectin+matrix+in+living+cell+culture+visualized+by+fibronectin-green+fluorescent+protein.">Dynamics and elasticity of the fibronectin matrix in living cell culture visualized by fibronectin-green fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2153-2158 (1999).</li><li>Egeblad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis. Models Mech. 1, 155-167 (2008).</li><li>Tal, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC+mobilization+from+the+skin+requires+docking+to+immobilized+CCL21+on+lymphatic+endothelium+and+intralymphatic+crawling.">DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling.</a> J. Exp. Med. 208, 2141-2153 (2011).</li><li>Roos, A., Trouw, L. A., Ioan-Facsinay, A., Daha, M. R., Verbeek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Life Sciences. , 1-14 (2005).</li><li>Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+regulation+of+blood+vessel+growth+during+tissue+vascularization.">Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization.</a> Nat Med. 15, 657-664 (2009).</li><li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+GFP,+CFP+and+collagen+in+tumors+in+vivo+using+multiphoton+microscopy.">Simultaneous imaging of GFP, CFP and collagen in tumors in vivo using multiphoton microscopy.</a> BMC Biotechnol. 5 (1), 14 (2005).</li><li>Wyckoff, J. B., Jones, J. G., Condeelis, J. S., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+step+in+metastasis:+In+vivo+analysis+of+intravasation+at+the+primary+tumor.">A critical step in metastasis: In vivo analysis of intravasation at the primary tumor.</a> Cancer Res. 60, 2504-2511 (2000).</li><li>Pinner, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+amoeboid+cancer+cell+motility+in+vivo.">Imaging amoeboid cancer cell motility in vivo.</a> J. Microsc. 231, 441-445 (2008).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453, 51-55 (2008).</li><li>Padera, T. P., Stoll, B. R., So, P. T., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+and+high-speed+intravital+multiphoton+laser+scanning+microscopy+of+microvasculature,+lymphatics,+and+leukocyte-endothelial+interactions.">Conventional and high-speed intravital multiphoton laser scanning microscopy of microvasculature, lymphatics, and leukocyte-endothelial interactions.</a> Mol. Imaging. 1, 9-15 (2002).</li><li>Giampieri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+and+reversible+TGFbeta+signalling+switches+breast+cancer+cells+from+cohesive+to+single+cell+motility.">Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).</li><li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+dendritic+cell+guidance+by+haptotactic+chemokine+gradients.">Interstitial dendritic cell guidance by haptotactic chemokine gradients.</a> Science. 339, 328-332 (2013).</li><li>Midwood, K. S., Orend, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tenascin-C+in+tissue+injury+and+tumorigenesis.">The role of tenascin-C in tissue injury and tumorigenesis.</a> Journal of cell communication and signaling. 3, 287-310 (2009).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 340-341 (2006).</li><li>Sund, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stroma+derived+biomarkers+in+cancer.">Tumor stroma derived biomarkers in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 28, 177-183 (2009).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 4, 839-849 (2004).</li><li>Brown, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation.">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nat. Med. 9, 796-800 (2003).</li><li>Rice, J. J., Gerwins, P., Kilarski, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Angiogenesis:+Perspectives+from+Antiangiogenic+Tumor+Therapies.">Mechanisms of Angiogenesis: Perspectives from Antiangiogenic Tumor Therapies.</a> Current Angiogenesis. 1, 139-147 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+in+two-photon+excitation+microscopy.">Photobleaching in two-photon excitation microscopy.</a> Biophysical journal. 78, 2159-2162 (2000).</li><li>Jakobsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+in+trans+potentiates+VEGFR-mediated+angiogenesis.">Heparan sulfate in trans potentiates VEGFR-mediated angiogenesis.</a> Dev Cell. 10, 625-634 (2006).</li><li>Kilarski, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+regeneration+kinetics+of+lymphatic-specific+photodynamic+therapy+in+the+mouse+dermis.">Optimization and regeneration kinetics of lymphatic-specific photodynamic therapy in the mouse dermis.</a> Angiogenesis. , (2013).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

משמעות כאן אנו מציגים גישת מיקרוסקופיה intravital רומן המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ודינמית של רכיבי המיקרו רקמות שונים, כוללים סיבי כמו גם חלבוני מטריקס כמו רשת. לשיטה זו מספר יתרונות על פני שיטות הדמיה intravital הנוכחיות: (i) דימות פלואורסצנטי Intravital נעשתה שימוש במחקרים בזרימת דם, למשל, לעקוב אחר דליפה מומסת מהדם או לlymphatics, אבל לא כבר בשילוב עם immunostaining. (Ii) השימוש בעכברים מהונדסים גנטי כתב מאפשר לסוגי תאים מסוימים להיות צילמו, אבל דורש הזמינות שלהם (או מאמץ משמעותי כדי ליצור חדש) ומגביל את מספר האינטראקציה סוגי תאים שניתן ללמוד. (Iii) מטריצה ​​תאית ניתן הדמיה in vivo באמצעות דור שני הרמוני, אך טכניקה זו יכולה רק לזהות collagens הסיבי, והשאירה מספר רב של מרכיבים תאיים חשוביםכגון קרומי מרתף, fibronectins, tenascins, גורמי גדילה, כמוקינים וglycosaminoglycans רקמות מחוץ להישג יד למחקר הנוכחי. השיטה שלנו מתגברת על מגבלות אלה, ומאפשרת טכניקות הדמיה סטנדרטיות להיות משולבות ועוד יותר בשילוב עם immunostainings לסוגי תאים אחרים, מבני רקמות, פיקדונות של סולפט הפרין מחייבים גורמי גדילה (למשל VEGF 26) וכמוקינים (CCL21 5,18 ואיור. 2D ), או חלבוני מטריצת חוץ תאיים תוך מעקב דם ו / או תזרים הלימפה בו זמנית. מגבלות ההדמיה epifluorescence של IF intravital מוגבלת לדשי עור דקים, נשללו בהיפודרמיס העבה (רקמת שומן). למרות שאנו מצאנו כי הדרמיס אוזן הגבי הוא אופטימלי לחשיפה כירורגית מזיקה יחסית של עור האוזן, epifluorescence עם intravital אם טכניקה אינה מוגבלת לדרמיס אוזן ועלול להיות מיושם לדוגמההעור החשוף של אצבעות הרגליים או העור האחורי של עכבר שזה עתה נולד. צביעה מהירה נוגדן (15 דקות) בimmunofluorescence אם אינה תלויה בדיפוזיה פסיבית אך דורשת ניקוז לימפטי פונקציונלי וזרימת נוזל ביניים, ולכן אין כתמים ניתן להבחין אם כלי הלימפה הוא occluded 27. בקנה אחד עם זה, כלי הלימפה כתם דם בכלי דם דולף ואז חזק יותר (כלי נפצעו, arterioles) 5. ההפרדה הגבי ודשי עור אוזן הגחון היא הליך כירורגי קל אבל זה גורם לפגיעה בכמה נימים ומוות של תאים לתאי רקמות שונים. זו עלולה להיות בעיה כאשר אחד צריכה לחקור רקמות שלמות לחלוטין, למשל מסתכל על ההשפעה המתונה של תרופות על הישרדות תא. גם היישום של חומר נוגד חמצון, המשמש להגנה על העור מפני phototoxicity וphotobleaching אינו כולל את השימוש בטכניקת immunofluorescence intravital ללמוד למשל סטרס חמצוני רקמה או Biolog תחמוצת חנקןy. לבסוף, מסנוור של מקרופאגים תושב רקמות עם מתחמים חיסוניים יכול להפעיל את התאים וההשפעה למשל המחקר של תגובה חיסונית רקמות והפעלת תאים דנדריטים אלה. שינויים ופתרון בעיות על מנת ללמוד סטרס חמצוני רקמה או ביולוגיה תחמוצת חנקן, ascorbate יש להחליף עם תקשורת רקמות אחרת תואמת שאינו מפריעה לתפוקה הניסיונית. כמו כן, יש להימנע מקולטני Fc חסימה על תאים חיסוניים עורי אם המטרה של המחקר היא הפונקציה וההפעלה של התגובה החיסונית הרקמות והפעלת תאים דנדריטים והגירה. ניתן לעשות זאת עם השימוש בנוגדנים משני עם בר Fc ביקע (F (ab) 2 שברי נוגדנים) או השימוש בנוגדן biotinylated וstreptavidin ניאון כמו ריאגנטים זיהוי. יישומים עתידיים אנו מציגים פנים חדשים וייחודייםחיוני אם טכניקה לרכיבים שאינם סיבי דימוי של מטריצה ​​תאית בגידולי עור להשתלה בשילוב עם סיבי זוהה-SHG וcollagens התבגר באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים. אחד היתרונות של שימוש רב פוטון (או confocal) מיקרוסקופית על פני ההדמיה epifluorescence הוא אפשרות לערום-z ותוצאה המרחבית שיתוף לוקליזציה של אירועים המתרחשים בתוך מטריצה ​​תאית, למשל intravasation גידול לתוך הלימפה או כלי דם, אשר במקרה של מיקרוסקופיה epifluorescence סטנדרטית ניתן להסיק רק משינויים מורפולוגיים של התאים הפולשים. טכניקה זו יש פוטנציאל הרבה יותר רחב. לדוגמא, יש לנו להשתמש intravital IF כדי לחקור את המנגנון של חסימת הלימפה על ידי טיפול פוטודינמי הלימפה ספציפית 27. יישומים אפשריים נוספים של שיטה זו כוללים, אך אינם מוגבלים לחקירה של חסינות עור בזמן דלקת, מנגנון של דחיית שתל או בשיטות של דם והלימפה<html> צמיחת כלי ATIC במהלך tumorigenesis. שלבים קריטיים בהליך הצעד החשוב ביותר שיש לו השלכות קריטיות לקיום סביבת רקמה פיזיולוגית הוא הפרדה כירורגית של עור הגחון וסחוס מהדרמיס הגבי. חיתוך או הגורם לחסימת העורק או וריד הגדול תוביל לדימום יתר וחוסר חמצן ברקמות מקומי, אשר ישפיע על תגובה תאית לטיפולים ותא תנועה 8. משתקות האוזן עם דבק כירורגים צריכים להיעשות בזהירות כשפיכת הדבק על לחשוף רקמה יגרום לפגיעה בלתי הפיכה לרקמה על ידי חסימה של כלי דם. הטמפרטורה של העכבר חייבת להיות מבוקרת ושמרה על 37 ° C. בנוסף, חמצן humidified צריך לשמש להרדמת isoflurane, כך שהעיניים וריאות להישאר humidified כראוי במהלך הניסוי. כמו כן, נתרן ascorbate חייב להיות מוכן טרי וה-pH שלה בדקה לפני השימוש. ntent &quot;&gt; לסיכום, immunofluorescence intravital זה מגשר בזמן אמת, מדידות מקומיות של פונקציה פיזיולוגית עם הדמיה מולקולרית של אירועים תאיים מורכבים בעור העכבר. יתר על כן, בשיטה זו יש פוטנציאל גדול כפי שהוא יכול להיות מיושם בקלות לדוגמה: מחקר שלאחר התפתחותיים מנגנונים של דם והלימפה אנגיוגנזה או לדמיין את השלבים המוקדמים של זיהום בעור על ידי סוכני פתוגניים שונים. בזכות הגמישות שלה ואת פוטנציאל תפוקה גבוהה, טכניקת intravital זה יכול לתרום באופן משמעותי לתחומים רבים של ביולוגיה.

ההדמיה intravital של תהליכי שיפוץ דלקתי, גרורתי ומטריקס כבר שטח חשוב של מחקר והניעה את היצירה של מודלים רבים מהונדסים כתב עכבר שמבטאים חלבוני ניאון 1,2. בשל אותות ניאון מחוץ לפוקוס, אשר להפחית את איכות תמונה ואת גבולות חדירת האור דרך הרקמה, רקמה עבה הדמיה אפשרית רק עם confocal או סריקה רב פוטון מיקרוסקופית 3. השימוש מהיר יותר, מיקרוסקופיה epifluorescence פחות יקרה והמורכבת היא אפשרית רק עם רקמות כמעט דו ממדים כגון קרום עוף Chorio-allantoic 4 או הדרמיס אוזן עכבר 5. רוב מערכות ההדמיה לנצל את עכברים הטרנסגניים לבטא חלבוני ניאון שונים באופן ספציפי לסוג תא. למרות שהחלבונים אלה מציעים phototoxicity החלש, הם לגרום תגובה חיסונית 6. יתר על כן, קשה לעבור בין תת תא הספציפי או לסמןבסיס ir או מדינות הופעלו כשינוי כזה דורש הכנת מודל גנטי חדש. בנוסף, כביטוי חלבון פלואורסצנטי בדרך כלל מוגבל לתא תאיים, זה בדרך כלל לא ניתן למבנים תאיים תמונה כמו חלבוני קרום במרתף או בפיקדונות chemokine רקמת 7. במקום זאת, תיוג עקיף עם נוגדנים כנגד אנטיגנים תאיים מציע גמישות עבור כמעט כל מרכיב תאים מסוג מסוים או מטריצה ​​8,9. עם זאת, החסרון העיקרי של גישת תיוג זה קשור לimmunotoxicity בתיווכו של מתחמים חיסוניים אנטיגן נוגדן שיכול לגרום לרעילות השלמה מערכת תלויה תא וphagocytosis של תאים ומבנים תאיים 10. המטריצה ​​תאית של microenvironment הגידול, אלא גם של רקמה נורמלית במהלך דלקת או ריפוי פצע, עוברת שיפוץ משמעותי. התקשות סטרומה של microenvironment הגידול יכולה פרומוצמיחת te גידול ופלישה בשל מנגנוני איתות שנגרם עקב מתח ושיפוץ סיבה של דם וכלי הלימפה 11. עם זאת, הדמיה חיה של חלבוני מטריצה ​​מוגבלת לcollagens סיבי שיכול להיות מזוהה על ידי דור השני הרמוני באמצעות מיקרוסקופ רב פוטון. לאחרונה יש לנו שפורסם בשיטת הדמיה intravital רומן שימזער את הסיכון לפגיעה בצילום וחיסוני רעילה לתאים צילמו ומבני רקמה 5. בהשוואה לשיטות הדמיה שהוקמו בו בסיבוב של ההדמיה intravital רציפה אחת הוא בטווח של 30 דקות עד 2 שעות 12-17, immunofluorescence intravital הטכניקה (IF) אפשר 12 שעות (לטווח ארוך 8) הדמיה. חשוב לציין כי בפעם ההדמיה מוגבלת ל12 שעות בשל מגבלות שנקבעו בפרוטוקול של בעלי החיים שלנו, אבל אין נגד סימנים טכניים שלא יכול להיות ממושך זה אם פרמטרים קריטיים לבריאותו של בעל החיים, כמו לחץ דם ולבהשיעור נשלטים על 8. בנוסף, על ידי השימוש בסטראו הקרינה אוטומטית היינו יכול לאסוף תמונות מתחומים רבים במהלך ניסוי אחד ונצפיתי תהליכים חיסוניים ושיפוץ נדירים שהתרחשו בהקשר הפיזיולוגי של העור נתמך על ידי דם תפקודי וכלי הלימפה. בגלל עדשת stereomicroscopic יש 2 סנטימטר, מרחק גדול יחסית, עבודה וזאת בניגוד לאופטיקה המיקרוסקופית שני הפוטונים אינו דורשת אידוי טבילה במים, הדמיה לטווח ארוך בוצעה רק בסטראו הקרינה. Intravital אם מותר התיוג וזיהוי חיסוניים של כל רכיב מטריצה ​​תאי של העור הרגיל. העיצוב של טכניקה זו מבוסס על הקונספט החדשני של שימוש immunostaining לתאי חיים ואלמנטי מטריצת רקמת הדרמיס על עכבר שנחשף בניתוח מבלי לגרום להשפעות מזיקות immunotoxic 5. ההליך הכירורגי עצמו הוא בטוח לדרמיס<html> כלי דם כפי שהוא מסתמך רק על ההפרדה בין שתי שכבות עור באוזן, כי הם באופן עצמאי מעוצבבים, האכיל באופן אוטונומי על ידי דם ורוקן על ידי תפוצה הלימפה נפרדת. ההתקנה הניסיונית שלנו מאפשרת הדמיה של מגוון רחב של אירועי פתיו פיסיולוגיות חשובים על פני 12 שעות לפחות, ובכלל זה סחר בויקוציטים בין כלי דם והלימפה ותהליכי ריפוי פצע. בפרסום המקורי, בהשוואה הטכניקה שלנו לתקני מדינה-of-the-art בתחומים שונים של ההדמיה intravital. כתוצאה מכך, אנו נצפו extravasation כלי דם ואירועי intravasation הלימפה על ידי סוגים שונים של לויקוציטים, כולל ההדמיה הייחודית של תאים חיסוניים נכנסים איסוף במקום צפוי כלי הלימפה ראשוני 15. כמו כן, המשלימים את התצפיות שנעשו על ידי קבוצות אחרות 9,18, מצאנו כי בCCL21 vivo הוא מסוגל ליצור פיקדונות חזקים, רציפים על איסוף אבל רק לעתים רחוקות על lymphatics הראשונית. = &quot;Jove_content&quot; ילדה&gt; כאן אנו מתארים intravital שונה אם טכניקה שיכולה להיות משולב עם שני פוטונים במיקרוסקופ כדי לזהות רשת של collagens סיבי באמצעות דור הרמוני שני (SHG). אנו מראים כי שיטה זו יכולה לשמש גם לפלישת תאי סרטן ההדמיה בהקשר של microenvironment הגידול הדינמי, הכולל מולקולות מטריצה ​​כגון C tenascin, כי הם נחקרו במידה רבה על ידי טכניקות הדמיה הנוכחיות 19. מצאנו כי המטריצה ​​סיבי של הגידול, מזוהה עם הדור השני ההרמוני, תופסת מיקומים שונים של הגידול microenvironment יותר המטריצה ​​שהופקדה זה עתה מורכב מtenascin C. יתר על כן, אנו מתארים דוגמאות לשיפוץ כלי שיט הנגרמים על ידי התכווצות מטריצה ​​מקומית, ארוכים הדמיה טווח (12 שעות) של אינטראקציות תא T עם תאים סרטניים ונדידת תאים סרטניים יחד קולגן IV של הקרום במרתף. יכולים להיות צילמו אירועים כאלה בזמן ההקלטה בו זמנית פרמטרים פיסיולוגיים מקומיים כגון PE כלי דםrmeability וניקוז לימפטי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="966">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Mice Strain</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">BALB/C mice (8-12 weeks )</td>
			<td style="width:159px;">Charles River&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Orleans,France</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">C57/Bl6 Mice (8-12 weeks )</td>
			<td style="width:159px;">Harlan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Carshalton UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Cell Line&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Anesthesia Maintenance&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Isofluorane&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Minrad Inc.&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2222</td>
			<td>Minrad Inc., Buffalo, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Humidified delivery system&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Rothhacher GmBH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Berne, Switzerland&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">DC Temperature Control System&#160;</td>
			<td style="width:159px;">FHC Inc&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bowdoin, MA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage .</td>
			<td style="width:159px;">M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">&#160;1&#215; lens (linear system magnification from 7.5&#215; to 160&#215;)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">2&#215; lens (linear system magnification from 15.6&#215; to 320&#215;)</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Multiphoton Microscopy&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCX APO 20x/1.2 oil immersion&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chameleon Ultra Laser&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Reagents&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">Ringer&#39;s buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate)</td>
			<td>B. Braun Medical AG</td>
			<td align="right">445968</td>
			<td>Sempach, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Aprotinin&#160;</td>
			<td>Elastin</td>
			<td>AP92</td>
			<td>Owensville, MO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Thrombin&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7326-1KU&#160;</td>
			<td>Taufkirchen, Germany&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium ascorbate</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>11140-50G&#160;</td>
			<td>Taufkirchen, Germany&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Mouse Serum raised against human IgG&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Abcam&#160;</td>
			<td>ab34834&#160;</td>
			<td>Cambridge, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Collagen IV&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB6581</td>
			<td>Cambridge, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Perlacan&#160;</td>
			<td style="width:159px;">RnD&#160;</td>
			<td>ab79465&#160;</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Tenascin C&#160;</td>
			<td style="width:159px;">RnD&#160;</td>
			<td>AF3358</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Podoplanin</td>
			<td style="width:159px;">RnD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">AF3244</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">LYVE-1&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Reliatech&#160;</td>
			<td>103-PA50&#160;</td>
			<td>Wolfenb&#252;ttel, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">CCL21</td>
			<td style="width:159px;">RnD</td>
			<td style="width:119px;">AF457</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Streptavidin Pacific Blue&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>S11222</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Streptavidin Alexa 647&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>S21374</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Streptavidin Alexa 488&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S11223</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Donkey Anti Goat 594&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>A21113</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Donkey Anti Rabbit 594&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>A21207</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">CMTPX CellTracker</td>
			<td style="width:159px;">Lifetechnologies</td>
			<td style="width:119px;">C34552</td>
			<td>Carlsbad, California</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Histocryl (surgical glue)</td>
			<td style="width:159px;">Braun Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">1050060</td>
			<td>Tuttlingen, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Cell Culture Reagents&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>E15-843&#160;</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">PBS&#160;</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term intravital immunofluorescence imaging of tissue matrix components with epifluorescence and two-photon microscopy

מלבד היותו פיגום פיזי כדי לשמור על מורפולוגיה רקמות, המטריצה ​​תאית (ECM) מעורבת באופן פעיל בויסות תפקוד תא ורקמות במהלך התפתחות והומאוסטזיס איברים. היא עושה זאת על ידי מתנהג דרך מסלולי איתות ביוכימי, ביומכנית, וbiophysical, כגון באמצעות שחרורו של שברי חלבון ECM ביו, המסדיר את המתח ברקמות, ומספקים מסלולים לנדידת תאים. המטריצה ​​תאית של microenvironment הגידול עוברת שיפוץ משמעותי, המתאפיין בשפלה, בתצהיר וארגון של חלבוני מטריצה ​​סיבי ולא סיבי. התקשות סטרומה של הגידול microenvironment יכולה לקדם את צמיחת גידול ופלישה, ולגרום לשיפוץ של כלי דם והלימפה. ההדמיה חיה של חלבוני מטריצה, עם זאת, לנקודה זו מוגבלת לcollagens סיבי שיכול להיות מזוהה על ידי דור השני הרמוני באמצעות מיקרוסקופ רב פוטון, ומשאירה את רוב רכיבי מטריצת largely בלתי נראה. כאן אנו מתארים נהלים לחיסון גידול בעור אוזן הגב הדק, immunolabeling של חלבוני מטריצת חוץ תאיים והדמיה intravital של הרקמה נחשפה בעכברים חיים באמצעות epifluorescence ושני פוטונים במיקרוסקופ. שיטת ההדמיה intravital שלנו מאפשרת זיהוי הישיר של שני סיבי וחלבונים מטריצה ​​שאינה סיבי בהקשר של גידול עורי הולך וגדל. אנחנו מראים דוגמאות לשיפוץ כלי שיט הנגרמים על ידי התכווצות מטריצה ​​מקומית. מצאנו גם כי מטריצה ​​סיבי של הגידול זוהה עם הדור ההרמוני השני היא מובחנת מרחבית מרכיבי מטריצה ​​שהופקדו זה עתה כגון ג tenascin אנחנו גם הראו הדמיה לטווח ארוך (12 שעות) של אינטראקציה תא T עם תאים סרטניים ותאים סרטניים הגירה לאורך קולגן IV של קרום במרתף. יחדיו, שיטה זו מאפשרת באופן ייחודי לזיהוי בו זמני של תאים סרטניים, microenvironment הפיזי שלהם ואת התגובה החיסונית רקמות אנדוגני לאורך זמן, מה שעשוי provתובנות חשובות IDE למנגנונים שבבסיס התקדמות גידול והצלחה או עמידות לטיפול אולטימטיבית.

עד כה, immunostaining ברקמת חיה אינו משמש בדרך כלל עקב היווצרות של קומפלקסים חיסוניים שמוביל לרקע גבוה מכתים וimmunotoxicity 20. זה היה להתגבר על ידי מראש חסימה קולטני Fcγ על מקרופאגים רקמות, ובכך &quot;מסנוור&quot; את התאים האלה לimmunostaining החזק העקיף שלאחר מכן. כתיוג היה תאי, הלבנת phototoxicity וfluorophore יכולה להיות נשלטה על ידי טבילה של הרקמה בנוגדי חמצון טבעי שנאגרו, חומצה אסקורבית מליחות (איור 1). מאז התיאור הראשוני שלנו של שיטה זו 5, שיפרנו את הטכניקה נגד הלבנת ואנטי phototoxic שלנו כך שphotobleaching יכול כעת לא רק להיות מעוכב אך לחלוטין מנע (איור 1). הדבר נעשה על ידי הטבעת האוזן בנפח גדול של נוגדי חמצון (100 μl) בתוך התא שבו האוזן היא משותק. שים לב שזמן הדמיה מתמדת 300 שניות מתאימה ל10 שעות של הדמיה, כאשר תמונות הןאסף עבור 500 אלפיות שניים בכל דקה אחת (הגדרות הדמיה ממוצע). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51388/51388fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51388/51388fig1.jpg" /> איור 1. Photobleaching וphototoxicity נעצר על ידי החלפת כלוריד עם ascorbate במאגר של רינגר והטבעת האוזן נחשפה ב100 μl נפח של פתרון זה. () רקמות היו מוכתמות ראשון עם נוגדן biotinylated נגד IV קולגן, המרכיב של הקרום במרתף. הצביעה מאוחר יותר זוהתה עם streptavidin-647 (אדום), ולאחר מכן כל הזמן צילמה ל300 שניות בשני חיץ רינגר הרגיל (פנל עליון) או ascorbate-רינגר (פנל התחתון) של. שים לב שזמן הדמיה מתמיד 300 שניות מתאימה ל10 שעות של הדמיה, כאשר תמונות נאספות ל500 אלפית שניים בכל דקה אחת (הגדרות הדמיה הרגילות). 25% המבריקים של piערכי עוצמת XEL הם בצבע ירוק. כימות (B) של ריקבון immunofluorescence (50% בלעומת רינגר 0% בascorbate-רינגר). ערכים היו מנורמלים לקרינה הראשונית. תמונות שנאספו עם סטראו immunofluorescence. סרגל קנה מידה ב, 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> חוקר את יחסי הגומלין בין תאים גרורתי של גידול וstroma גידול הוא חיוני כדי להבין את התהליך של נדידת תאי גידול וחסין גידול. סיבה לכך הוא stroma הגידולים הקשורים מלחין עד 90% ממסת הגידול ופעיל מווסת את צמיחת גידול והתפשטות גרורה 21. עם זאת, תובנה מכניסטית לתוך כיצד נדידת התאים סרטניים כונני מטריצה ​​לכיוון או הלימפה או כלי דם חסר 22. זה נובע בחלקו מהעובדה שim intravitalהזדקנות של חלבוני מטריצה ​​מוגבלת להדמיה של סיבים התבגרו של collagens סיבי באמצעות דור שני הרמוני במיקרוסקופ שני פוטונים 23. לכן, התאמנו את השיטה שלנו להדמיה של רקמות microenvironment כולל כלי דם והלימפה, pericytes, עצבים, שרירים ותאי שומן לכלול הדמיה הישירה של רכיבי מטריקס. ניתן להבחין בין מבנים רבים המבוססים על המורפולוגיה שלהם לאחר immunostaining עבור רכיבי קרום במרתף כגון קולגן IV או perlecan (איור 2 א), לעומת זאת, מכתים ישיר לסמנים פני תא מסוימים, למשל Lyve1 (איור 2B ו-C) וpodoplanin (איור . 2C), בהמשך מאפשר הבחנה lymphatics הראשונית, נימים (Lyve1 +) מאספני הלימפה (Lyve1 -). מכתים את CCL21 הנכנס מטריצה ​​בעור גילה פיקדונות הכמוקין על קרום המרתף של IDE אספני הלימפהntified עם הצביעה לperlecan, proteoglycan סולפט heparan (איור 2 ד). <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51388/51388fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51388/51388fig2.jpg" /> איור 2. דוגמאות לצביעה חיות באוזני עכבר רגילות. (א) מכתים לperlecan, מרכיב קרום במרתף, מתאר את כל כלי הדם והלימפה, עצבים, סיבי השריר ותאי שומן. (ב) מכתים Lyve1 מסמן את רשת נימי הלימפה הראשונית. (C) Co-מכתים עבור Lyve1 וpodoplanin, סמן הפאן הלימפה, מתאר רשתות של lymphatics הראשונית ואיסוף. ניתן הדמיה הדרמיס האוזן הגבי באמצעות מיקרוסקופ קלאסי epifluorescence (ללא חתך אופטי) כהדרמיס האוזן יש מספר נמוך של תאי שומן שאחרת היה לכסות תחום ההדמיה. נירוסטת CCL21 (ד &#39;)<html> נינג (ירוק) על קרום במרתף הלימפה מוכתם עבור perlecan (אדום). תמונות שנאספו עם סטראו immunofluorescence. סולם ברים בA ו-B, 1 מ&quot;מ; ב-C, 100 מיקרומטר ו50 מיקרומטר בD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> והכי חשוב, חלבונים מבניים, כי בדרך כלל לא יכול להיות מזוהה על ידי SHG, שיטת זיהוי מטריצה ​​הקלאסית 23, ניתן דמיינו. לדוגמא, מצאנו כי C tenascin (איור 3), חלבון מטריצה ​​שבא לידי ביטוי במהלך היווצרות גידול, ריפוי ודלקת 19 פצע מופקד במקומות שונים של stroma גידול מ collagens סיבי (איור 3 ב). ההטרוגניות מטריצה ​​זו עשויה להשפיע על חלוקת תאים סרטניים וגרור (איור 3 ג). <html> t &quot;עבור: לשמור-together.within-page =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51388/51388fig3.jpg" /> איור 3. הדרמיס האוזן הגבי ניתן הדמיה בשידור חי באמצעות מיקרוסקופ רב פוטון. שדה יחיד של B16-F10 גידול. stroma גידול היה שכותרתו עם נוגדן C tenascin ומכתים זוהה עם אנטי עזים-594 נוגדנים חמורים. Immunofluorescence של C tenascin (אדום) רשת מוצגת ובcollagens סיבי מזוהה עם דור השני הרמוני (SGH) בB. שתי רשתות אלה גבי עם תאים סרטניים (ציאן) ב-C (ממוזג). מטריקס גידול החדשה בסימן C tenascin אינה חופף עם collagens סיבי מזוהה עם SHG (ירוק). התמונה עם 44, ארבע פעמים בממוצע Z-חלקים עם Z-צעד 1.0 מיקרומטר נרכשה במצב עומק צבע 16 קצת. תמונות שנאספו עם מיקרוסקופ שני פוטונים. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר.ref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. בעקבות immunolabeling של רכיבי מטריצת גידול שונים (לדוגמא C tenascin וקולגן IV) של מטריצת גידול שיכולנו זיהה מוגבל ואירועים פתאומיים של שיפוץ כיוונית מטריצת גידול (וידאו 1). כוחות המתפתחים בתוך microenvironment גידול עלולים לגרום להתרחבות או התכווצות של מטריצת גידול ובשיפוץ תוצאה והתארכות של כלי הדם של הגידול בהיקף דומה כפי שהראינו בעבר במקרה של ריפוי פצעים 11,24. וידאו 1. הרחבת מטריצת גידול שכותרתו עם קולגן IV (אדום) ו-C tenascin (ציאן) להאריך כלי דם (חץ) ופסיבי translocate שלושה תאים סרטניים (ירוק). התכווצות מקומית של כלי teascin C עשיר בגידול מטריצת translocate דם (structur האדום בכיוון אופקיה) על ידי כ 100 מיקרומטר במהלך 12 שעות של הדמיה. תמונות שנאספו עם סטראו immunofluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video1_New.avi" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בוידאו.</a> באמצעות מיקרוסקופ רב פוטון עם תיוג fluorophore הוא בעייתי כמו שטף פוטונים המשמש בניסויים אלה להלבין במהירות צבעי ניאון שאינם מוגנים מפני התחמצנות 25. כאן אנו מראים כי אנו יכולים לבצע מיקרוסקופיה זמן לשגות שני פוטונים תוך הדמיה בו זמנית מטריצת C tenascin immunolabeled עם photobleaching המינימלי של fluorophores אפילו במיקרוסקופ שני פוטונים צפיפות פוטון גבוהה (וידאו 2). וידאו 2. Photobleaching רמה נמוכה של immunofluorescence tenascin C (אדום) במהלך שני פוטונים במיקרוסקופ. תאי B16-F10-GFP גידול (ציאן) היו צילמו באוזן הגב הפתוח 9 ימים לאחר החיסון. אות הניאון הייתה מוגנת על ידי יישום של ascorbate-החיץ של רינגר על רקמת הדמיה. דור שני הרמוני (ירוק) אינו חופף עם מטריצה ​​חדשה מיוצגת על ידי tenascin תמונת עומק צבע 16 קצת ג עם 11, ארבע פעמים בממוצע Z-חלקים עם Z-צעד 1.9 מיקרומטר נרכש במשך 15 דקות. תמונות נאספו כל דקה 1 5 שניות ב6 Z-מטוסים שנאספו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video2.avi" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בוידאו.</a> אנחנו גם צילמו אינטראקציות חיסוניים תאים עם תאים סרטניים גרורתי. splenocytes כותרת CMTPX מעכבר גידול נושאות extravasated מכלי הדם הקשורים לגידול 8 שעות לאחר עירוי IV, פלש מטריצת הגידול ופעיל תיקשר עם תאים סרטניים על ידי יצירת קשר סלולרי לטווח ארוך (וידאו 2). מבני IV קולגן שכותרת Fluorophore-647 היו עמידים לphotobleaching במהלך 12 שעות של הדמיה. וידאו 3. אינטראקציה של splenocytes כותרת CMTPX מגידול (B16-F10)-bחריש עכבר עם תאים בודדים של גידול (GFP-B16-F10). Splenocytes היה iv עירוי לאחר צביעת רקמות לIV קולגן. קולגן IV-ירוק (647), splenocytes אדום (CMTPX), ציאן B16-F10 (GFP). תמונות שנאספו עם סטראו immunofluorescence. שעות משך וידאו 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video3-corrected.mov" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בוידאו.</a> תאי גידול מבודדים טרי היו מעולף על הדרמיס האוזן החשוף מראש מוכתם עבור IV קולגן. אנחנו יכולים לצפות כי לאחר הקפדה על הרקמות כמה קבוצות של תאים החלו הגירה קולקטיבית לאורך קרום במרתף של כלי דם ותאי שומן. וידאו 4. תאים סרטניים נודדים לאורך קרומי מרתף. עור אוזן רגיל מוכתם עבור קולגן IV (647, אדום) היה מצופה בתאי B16-F10-GFP טרי passaged וצלמה במשך 5 שעות. תאים סרטניים מסוימים שדבקו רקמות החלו הגירה קולקטיבית יחדקרום במרתף של כלי דם ותאי שומן. תמונות שנאספו עם סטראו immunofluorescence. משך וידאו:. 5 שעות <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video4.avi" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בוידאו.</a> כמו כן, בגלל הדרמיס האוזן הוא כמעט דו ממדים, היינו יכול בקלות לאסוף כמויות גדולות של נתונים באמצעות stereomicroscopy הקרינה מהירה, במקום איטי יותר ויקר יותר confocal או מיקרוסקופיה multiphoton. עם זאת, אפשר גם להשתמש בכל אחת מהשיטות מיקרוסקופיה הסריקה ציינו עם intravital שלנו, אם הכנות (3 איור, 1 וידאו).

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy at JoVE.com

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

המטריצה ​​תאית עוברת שיפוץ משמעותי בריפוי פצעים, דלקות והיווצרות גידול. אנו מציגים גישה מיקרוסקופית immunofluorescence intravital רומן כדי להמחיש את הדינמיקה של סיבי, כמו גם רכיבי מטריצת רשת כמו עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה באמצעות epifluorescence או שני פוטונים במיקרוסקופ.

לטווח ארוך Intravital Immunofluorescence הדמיה של רקמות מטריקס רכיבים עם Epifluorescence ומיקרוסקופי שני פוטונים

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

long-term-intravital-immunofluorescence-imaging-tissue-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.9K Views.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne.  המטריצה ​​תאית עוברת שיפוץ משמעותי בריפוי פצעים, דלקות והיווצרות גידול. אנו מציגים גישה מיקרוסקופית immunofluorescence intravital רומן כדי להמחיש את הדינמיקה של סיבי, כמו גם רכיבי מטריצת רשת כמו עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה באמצעות epifluorescence או שני ?...

Video: Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

צ&#39;יפ Multi-האיבר - פלטפורמת Microfluidic לCoculture Multi-רקמה לטווח ארוך

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

התקן הדמיה חיה לטווח ארוך עבור משופרת מניפולציה ניסויית של הזחלים דג זברה

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

טכניקת תפירת טנורהאפי חדשנית עם שתל קולגן מהונדס רקמה לתיקון פגמים גדולים בגיד

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

רקמת הלבלב הנגזר מטריקס Bioink עבור הדפסת 3D Cell לאדן רקמות הלבלב בנייה

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

In vivo הדמיה של רקמות ביולוגיות עם פלואורסצנטיות דו-פוטונית משולבת ומיקרוסקופיה פיזור ראמאן מגורה

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Highly-Multiplexed Tissue Imaging with Raman Dyes

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. Hence, highly multiplexed imaging technologies have been increasingly appreciated. Here, we describe an emerging platform of highly-multiplexed vibrational imaging of specific proteins with comparable sensitivity to standard immunofluorescence via electronic pre-resonance stimulated Raman scattering (epr-SRS) imaging of rainbow-like Raman dyes. This method circumvents the limit of spectrally-resolvable channels in conventional immunofluorescence and provides a one-shot optical approach to interrogate multiple markers in tissues with subcellular resolution. It is generally compatible with standard tissue preparations, including paraformaldehyde-fixed tissues, frozen tissues, and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) human tissues. We envisage this platform will provide a more comprehensive picture of protein interactions of biological specimens, particularly for thick intact tissues. This protocol provides the workflow from antibody preparation to tissue sample staining, to SRS microscope assembly, to epr-SRS tissue imaging.

Electronic pre-resonance stimulated Raman scattering (epr-SRS) imaging of rainbow-like Raman dyes is a new platform for highly multiplexed epitope-based protein imaging. Here, we present a practical guide including antibody preparation, tissue sample staining, SRS microscope assembly, and epr-SRS tissue imaging.

הדמיית רקמות מרובבת מאוד עם צבעי ראמאן

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. ...