אינטרטל הדמיה של לימפוציטים תוך-אפיתל במעי קטן מוריין

מיקרוסקופ תוך-ויטמינים של רירית המעי הקטנה יכול לספק תובנה לגבי הדינמיקה המרחבית של אינטראקציות תאיות בתוך האפיתל בין סוגי תאים חיסוניים שונים, או בין שני תאים אלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת רכישה של תמונות במהירות גבוהה וברזולוציה גבוהה בתוך רירית המעי בזמן אמת. הדמיה חיה של המעי יכולה לספק תובנה נוספת על האינטראקציות התאיות, או איתות תאים המעורבים בחסינות ריר, ביולוגיה אפיתל או ביולוגיה של סרטן.

זוהי שיטה מאתגרת הדורשת תרגול של הטכניקה הכירורגית, כמו גם סבלנות ומיקום אופטימלי של העכבר לרכישת תמונה. לאחר אישור חוסר תגובה קמצוץ הבוהן בעכבר מהופנט הרדמה, הבעת חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר, או EGFP, קולטן גמא-דלתא T-cell, להשתמש מזרק שחפת לאט להזריק 200 microliters של Hoechst טרי מוכן 33342 פתרון צבע לתוך סינוס ורידים רטרו-מסלולית. אחת עד שתי דקות לאחר ההזרקה, יש למרוח משחה על עיני החיה כדי למנוע מהם להתייבש.

לאחר מכן, לעשות חתך אנכי 2CM דרך העור ואת peritoneum, לאורך קו האמצע של הבטן התחתונה ולהשתמש ממטרים זוויתי כדי למשוך בזהירות את caecum מתוך חלל צפק. זהה אזור 2-3CM של המעי הדק המכיל תוכן צואה מינימלי, דואג לא לקרוע את כלי הדם mesenteric, בזהירות להחזיר את caecum ואת המעי הדק הנותר לחלל צפק, משאיר את קטע העניין החצנה. הצבת שני זוגות של מדפים משני צדי mesentery קו תחתון בין כלי הדם, בעדינות לשפשף את קצות המדפים יחד כדי ליצור חור בממברנה.

באמצעות ממטרים זוויתיים ומחט מעוגלת מחוברת לתפר של 5 ס"מ, חודרים צד אחד של הצפא דרך החור בממברנה, ובמעלה הצד השני של הציפוי הצפור, מניחים תפר אחד בחלק העליון, וצד אחר ליד תחתית החתך כדי לסגור את החתך, תוך שמירה על לולאת המעי המוחצן. כדי להגדיל את הסבירות להצלחה, לא לקשור או לקרוע את כל כלי הדם תוך הצבת תפר הבטן ולהגביל כל טיפול מחוץ למעי. לאחר מכן, לסגור את העור מתחת לולאת המעי באותו אופן, הצבת תפר אחד באמצע החתך בין התפרים הקודמים בקו התחתון הצפי.

באמצעות אלקטרוקוטריה, לעשות שורה של ניקוב לאורך הגבול antimesenteric ומיד להחיל כמה טיפות מים על פני השטח של המעי כדי למנוע נזק נוסף רקמות הנגרמות על ידי חום. כתם עם קימיפה כדי להסיר מים שיורית. השתמש מספריים ואנה לחתוך כ 1.5CM חריץ אופקי בקצה הדיסטלי של הרקמה צרבת, לאורך הקו צרוב, לכיוון הקצה הפרוקסימלי של קטע הרקמה המוחצנת.

כאשר משטח הריר נחשף, לכסות את הבטן עם קימייפ לח כדי לשמור על הרקמה hydrated. עבור דימות מיקרוסקופיה קונפוקל דיסק מסתובב, להעביר את העכבר למיקרוסקופ בכלי מכוסה. הפעל את תוכנת ההדמיה והטה את ראש המיקרוסקופ לאחור, והוסף 150 מיקרוליטרים של צבע פרעוש מיקרומולארי אחד אלקסה פלואור ותמיסת מלוחים במאגר של האנק על החלק התחתון החלק התחתון של כיסוי הזכוכית.

מקם את העכבר כך משטח הריר שנפתח ישירות יוצר קשר עם כיסוי. מניחים את העכבר ואת המנה על שלב ההדמיה באינקובטור מחומם מראש. הגדר את עוצמת העירור ואת זמן החשיפה עבור כל לייזר ללא יותר מ- 10-15 מילי-וואט ו- 120-150 אלפיות השניה, בהתאמה, והתאם את ממוצע המסגרת ל- 2.

הפעל את הפונקציה 'רווח הכפלת אלקטרונים' כדי להפחית את רעשי הרקע ובחר בכיול המטרה 63X כדי להבטיח מדידה נכונה של גודל הפיקסל. באמצעות לייזר 405 ננומטר ואת מטרת האוויר 20X, לדמיין באופן ידני את הגרעינים כדי לאתר שדה של villi כי חסר תנועה מורגשת או להיסחף, הימנעות אזורים של תנועה חפץ עקב נשימה, תנועה פריסטואלית או פעימות לב. באמצעות סריקת X-Y, להקליט את X-Y קונדינט של שדה העניין ולעבור המטרה טבילה גליצרול 63X.

לרכוש תמונה חיה בערוץ 405 ננומטר עד 1 דקה כדי לאשר כי villi בשדה שנבחר יציבים, תוך התאמת המוקד כדי למצוא את המישור האורתוגונלי ממש מתחת קצה villus. לאחר מכן לרכוש z-ערימות, החל ממש מתחת אפיתל קצה villus, על 15-20 מיקרומטר עד villus עד שקשה לפתור את הגרעינים, באמצעות 1.5 מיקרומטר צעדים. 3-5 דקות לאחר תחילת הרכישה, לאשר את יציבות התמונה ואת תנועתיות תא Intraepithelial גמא-דלתא, ולהמשיך לרכוש תמונות במשך 30-60 דקות עבור כל שדה של villi.

לימפוציטים Intraepithelial גמא-דלתא להפגין התנהגות מעקב דינמית, שבו הם מסיירים האפיתל על ידי הגירה לאורך קרום המרתף לתוך החלל הבין תאיים לצדד במצב המחקר. בתמונות מייצגות אלה, המסלולים הצבעוניים מציינים את נתיבי הנדידה של לימפוציטים פנימיים בודדים של גמא-דלתא במהלך 30 דקות. למרות התדירות של לימפוציטים Intraepithelial בחלל הבין תאי הבין תאי גדל בעכברים שטופלו נוגדן בטא קולטן אנטי אינטרלוקין-2, יותר מ 30% אלה לימפוציטים Intraepithelial גמא-דלתא הפגינו התנהגות בלתי פעילה.

פנוטיפ זה התפתל אושרה על ידי הפחתה משמעותית הן במהירות המיידית והן ביחס הכליאה של לימפוציטים Intraepithelial גמא-דלתא, בעקבות המצור אינטרלוקין-2-קולטן, יחסית פקדים. יתר על כן, לימפוציטים Intraepithelial גמא-דלתא סרק היו זמן רב יותר לשכון, היו לעתים קרובות יותר מקומי בתוך החלל הבין תאיים הבין-תאיים, לעומת מוטיל גאמא-דלתא לימפוציטים תוך-תאיים. זה יכול להיות קשה לזהות שדות של villi כי חוסר תנועה מוגזמת עקב תנועה פריסטואלית.

מיקום מחדש של העכבר עשוי לסייע באיתור שדה יציב יותר. ניתוח נוסף של נתוני המעקב אחר תאים עשוי לסייע בזיהוי התנהגות תנועתיות ספציפית, או לספק מדדים נוספים למדידת אינטראקציות תאיות. הדמיה תוך-בלתי נמנעת וניתוח של תנועתיות IEL הפכו לקריאה סטנדרטית של פונקציית IEL, ומספקים תובנה כיצד איתות חיסוני המולד מווסת את פונקציית גאמא-דלתא IEL.