MultiBioPro רוצה להודות לאנשים הבאים שגם תורמים לפרויקט: דומיניק סווינטון (דלקים ירוקים), תומאס אפלולי (דלקים ירוקים), סם Buekenhout (Capax), וסילביה Drouven (Capax).

1. צמח חומר לגדל צמחי Nicotiana glauca ב30 סירים בקוטר סנטימטר המכילים בינוני הולך וגדל מקצועי M2. לגדל צמחים בחממה, עם טמפרטורה יומית של 20-25 ° C וטמפרטורה לילית של 15 ° C. השתמש אור 16 שעות ומחזור חשכה 8 שעות כמשטר אור משלים. 2. לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למטבוליטים עיקריים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומרי צמח קציר (עלים וגבעולים של glauca נ &#39;) וחומר הקפאה באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyophilize חומרים צמחיים קפואים הקפאת ייבוש במשך שלושה ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים דגימות lyophilized ידי טחנת מיקסר עם כדורי מתכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומרים יבשים קרקע בסדר aliquot לתוך צינור צנטריפוגות 2 מיליליטר או בקבוקון זכוכית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למטבוליטים משניים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות צמח קציר וחומר הקפאה באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחן את רקמות צמח קפוא על ידי מ &#39;טחנת ixer עם הנירוסטה כדור או על ידי מכתש ועלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות aliquot בסדר קרקע ל2 צינור צנטריפוגות מיליליטר (משקל רטוב כ 20 מ&quot;ג). </li></ol></li></ol> 3. הפקת פרוטוקול המטבוליט Profiling למטבוליטים ראשוניים על ידי GC-MS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומרי קרקע aliquot יבשים צמח (10 מ&quot;ג של עלים ו20 מ&quot;ג של חומרי גזע) ב2 מיליליטר, בורג כובע, צינורות תחתית עגולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1,400 μl של מתנול 100% ומערבולת 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 60 μl של Ribitol (0.2 מ&quot;ג / מיליליטר מניות בH 2 O) כסטנדרט פנימי כמותיים ומערבולת 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פלדה אל חלד אחד (או zirconia) כדור וhomogenize חומר עם מיל מיקסר למשך 2 דקות ב 25 הרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התמהיל 10 דקות ב 11,000 X גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant לבקבוקון זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 750 μl של כלורופורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1,500 μl של H 2 O ו מערבולת התערובת ל10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 150 μl משלב עליון (שלב קוטבי) לתוך צינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות יבשים באמצעות VAC מהירות. זה הכרחי כי הדגימות מופחתות ליובש לבין 3 ל 24 שעות עד שלא נוזל שיורית הוא הווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של hydrochloride methoxyamine (20 מ&quot;ג / מיליליטר בפירידין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את התערובת שבייקרה גוש חום אופקי לשעה 2 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 70 μl N-מתיל-N - (trimethylsilyl)-trifluoroacetamide תמהיל MSTFA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את התערובת לשעה 2 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה הטיפות על העטיפה על ידי צנטריפוגה קצרה ~ 1 דקות ב11,000 X גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הנוזל לתוך צלוחיות זכוכית מתאימות לניתוח GC-MS. </li></ol> 4. החילוץ להמטבוליט Profiling למשני מטבוליטים על ידי LC-MS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 מתנול μl לדגימות קרקע הקפואות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake עם thermomixer ל15 דקות ב 70 מעלות צלזיוס (1,000 -1 שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הדגימות (5 ק&quot;מn, 20,000 XG) ושלב הנוזל הועבר לצינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyophilize השלב הנוזלי עם מאייד צנטריפוגלי (speedvac). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 cyclohexane μl ו100 מים milliQ μl לגלולה היבשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער את הדגימות למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר (מערבולת שימוש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הדגימות (5 דק &#39;, XG 20,000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 80 μl של שלב המים (שלב נמוך יותר) לבקבוקוני הזרקת LC-MS עם תחתית חרוטי לניתוח LC-MS. </li></ol> 5. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את תצורת Xcalibur, MarkerLynx, 7 Metalign או XCMS 8 ובחר את ניתוח נתונים לעיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טבלה של פסגות זוהו העניין שלך בהתאם לרמת מתחם בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הפסגות על ידי שיתוף elution של תרכובות סטנדרטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לכך יסמן פסגות זוהו באמצעות ניתוח MSN, אלגוריתמי אפיון מבניים 9,10, ספרות שלurvey והמטבוליט חיפוש באתר 11,12. </li></ol> 6. פחמימן הפקת 13 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול נ &#39;טרי שנקטפו העלים glauca (~ 200 מ&quot;ג) בממס (מתנול, אתנול, כלורופורם, הקסאן או אתר נפט (נקודת C ° 40-60 או 60-80 C ° רתיחה) (5 מיליליטר; HPLC כיתה) ל2-20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העלים ולייבש את הממסים לחלוטין על ידי אידוי סיבובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות resuspend בהקסאן (1 מיליליטר; HPLC כיתה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח GC-MS באמצעות גז כרומטוגרפיה ומקף ל5973MSD. תנאי הפעלה צריכים להיות כדלקמן; גז מוביל, הליום עם קצב זרימה של 0.9 מיליליטר דקות -1/11 psi. הזרק דגימות (μl 1) עם מזרק splitless ב280 ° C. החזק את תנור גז כרומטוגרפיה ב-C ° 70 למשך 5 דקות לפני ramping על 4 מעלות צלזיוס / דקה ל320 ° C. החזק את הטמפרטורה הסופית לעוד 10 דקות, מה שהופך את הזמן כולל של 67.5 דקות. הגדר את הממשק עם MS ב280 מעלות צלזיוס, עמ &#39;erform MS במצב סריקה מלא באמצעות 70 eV EI + ונסרק 10-800 ד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתחילה לעבד את רכיבי הכרומתוגרמה על ידי מערכת זיהוי deconvolution MS האוטומטית ו, ואלה שמזוהים באמצעות ספריית MS NIST 98. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר את זיהוי של פחמימנים רוויים ארוכי שרשרת alkane (hexacosenol, nonacosane, triacontane, octacosenol, nonacosonal, hentriacontane, dotriacontane וtritriacontane) על ידי השוואת זמני שמירה ודפוסי פיצול קלאסיים לסטנדרטים אותנטיים ידועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע פחמימנים כמותית על ידי השוואת אזורי שיא משולבים עם עקומות מינון תגובה (.07-2.5 מ&quot;ג), שנבנו מתקנים אותנטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב אמצעים וסטיית התקן של האמצעי (SEM) באמצעות תוכנת Excel. </li></ol> 7. ניתוח 14 Isoprenoids <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע homogenisation כפי שתואר בסעיף 2. לשקול ב10 מ&quot;ג של אבקה מיובשת בהקפאה הומוגני לתוך צינור צנטריפוגות.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ברצף 250 מתנול מיליליטר על האבקה, לערבב אותו, ולאחר מכן להוסיף 500 מיליליטר כלורופורם (כיתה מגיב מעבדה), ולערבב אותו על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הדגימות על קרח בחושך עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 מיליליטר חיץ טריס-HCl (100 מ&quot;מ, pH 7.5) או מים (HPLC כיתה) להשעיה ומערבבים על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התערובת על 12,000 סל&quot;ד (13,523 XG) במשך 5 דקות כדי להפריד את nonpolar משלבים מימיים. שלב כלורופורם הפולרי המכיל תמציות isoprenoid הוא בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את השלב לצינור צנטריפוגות חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת כלורופורם 500 מיליליטר נוסף לשלב המימית, ולנהל חילוץ שני על ידי מערבולת וצנטריפוגה כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תמציות כלורופורם ולהביא דוגמאות ליובש באמצעות המאייד ולאחסן ב -20 ° C עד ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 אתיל אצטט מיליליטר (HPLC כיתה) לתמצית isoprenoid המיובש לredissolve החומר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 3 מיליליטר על C18<html> עמודה באמצעות מודול הפרדת UPLC Acquity. השיפוע משמש להפרדת פיגמנטים צריך לכלול; : מתנול / H 2 0 (50:50) ו-B: אצטט אצטוניטריל / אתיל (75:25), ותנאי התחלה צריך להיות 30% (v / v) ו-B 70% (V / V) הולך 100 % B מעל 6 דקות. השתמש בקצב זרימה של 0.6 מיליליטר / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח eluate ברציפות עם מערך התמונה דיודה גלאי (PDA) 250-600 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הרכיבים על ידי שיתוף כרומטוגרפיה והשוואות רפאים בין תקנים אותנטיים, בטא קרוטן (provitamin), phytoene, ליקופן, לוטאין וזאקסנטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כימות מעקומות מינון תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר תרכובות באמצעות LC-MS; להשתמש בתנאי chromatographic דומים. איתור צריך להיעשות באמצעות יינון APCI במצב חיובי עם מכשיר Q-תוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם השינויים לקביעת טוקופרול עם חומר יבש 25 הקפאת מ&quot;ג שכבר חילוץ וסבון בKOH 6% ב50 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות. </li></ol>class = &quot;jove_title&quot;&gt; 8. RNA חילוץ לרנ&quot;א Seq פרוטוקול זה משלב מיצוי RNA Trizol עם קיט RNeasy להשיג RNA באיכות גבוהה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים של חומר צמחי קפוא 100 מ&quot;ג ב2 צינורות צנטריפוגה מיליליטר עם כדור מתכת על ידי טחנת מיקסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר Trizol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את החומר ל10 דקות ב 12,000 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant לתוך צינור תגובה חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 כלורופורם μl, להפוך את הצינור מספר פעמים, דגירה 3 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התערובת ל15 דקות ב 12,000 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את השלב העליון המימית (כ 700 μl) לתוך צינור תגובה חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כ 2.5 כרכים של אתנול (100%), להפוך את הצינור מספר פעמים, ודגירה במשך 30 דקות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את המדגם לרבות כל משקע לעמודת הספין מהערכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה עמודה במשך 15 שניות ב8,000 XG, וזורקים את fנמוך דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 700 μl הצפת RW1 לעמודת הספין ו צנטריפוגות במשך 15 שניות ב8,000 x גרם. מחק את הזרימה דרכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl הצפת הרשתית לעמודת הספין וצנטריפוגות העמודה במשך 15 שניות ב8,000 x גרם. מחק את הזרימה דרכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl הצפת הרשתית לעמודת הספין ו צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 8,000 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את טור הספין לתוך צינור תגובה חדש 1.5 מיליליטר ולהוסיף 50 מים RNase ללא μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה העמודה 1 דקות ב8,000 XG לelute RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את ה-DNA שיורית באמצעות ערכה ללא DNA Ambion על פי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את האיכות של RNA. RNA צריך להיות מספרי שלמות RNA (רין) מעל 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח את ה-RNA לרצפים של הדור הבא. </li></ol>

<ol>
	<li>Clark, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=chemistry,+biofuels,+and+biorefinery.">chemistry, biofuels, and biorefinery.</a> Annu Rev Chem Biomol Eng. 3, 183-207 (2012).</li><li>Carroll, A., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulosic+biofuels.">Cellulosic biofuels.</a> Annu Rev Plant Biol. 60, 165-182 (1146).</li><li>Vanholme, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+carbon-negative+sustainable+bio-economy.">Towards a carbon-negative sustainable bio-economy.</a> Front Plant Sci. 4, (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=United+Nations+Environment+Programme+(UNEP).">United Nations Environment Programme (UNEP).</a> Global Environment Outlook: Environment for Development. 4, (2007).</li><li>Boerjan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotechnology+and+the+domestication+of+forest+trees.">Biotechnology and the domestication of forest trees.</a> Curr Opin Biotechnol. 16 (2), 159-166 (2005).</li><li>Curt, M. D., Fern&#225;ndez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Nicotiana+glauca+R.C.+Graham+aerial+biomass+in+relation+to+irrigation+regime.">Production of Nicotiana glauca R.C. Graham aerial biomass in relation to irrigation regime.</a> Biomass. 23 (2), 103-115 (1990).</li><li>De Vos, R. C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+large-scale+plant+metabolomics+using+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Untargeted large-scale plant metabolomics using liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 2 (4), 778-791 (2007).</li><li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XCMS:+Processing+mass+spectrometry+data+for+metabolite+profiling+using+Nonlinear+peak+alignment,+matching,+and+identification.">XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using Nonlinear peak alignment, matching, and identification.</a> Anal Chem. 78 (3), 779-787 (2006).</li><li>Morreel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+fragmentation+as+an+identification+tool+in+lignomics.">Mass spectrometry-based fragmentation as an identification tool in lignomics.</a> Anal Chem. 82 (19), 8095-8105 (2010).</li><li>Morreel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+sequencing+of+lignin+oligomers.">Mass spectrometry-based sequencing of lignin oligomers.</a> Plant Physiol. 153 (4), 1464-1478 (1104).</li><li>Tohge, T., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+resources+for+mass-spectrometry-based+metabolomics:+A+user's+guide.">Web-based resources for mass-spectrometry-based metabolomics: A user's guide.</a> Phytochemistry. 70 (4), 450-456 (2009).</li><li>Tohge, T., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+genetic+diversity,+informatics+and+metabolomics+to+facilitate+annotation+of+plant+gene+function.">Combining genetic diversity, informatics and metabolomics to facilitate annotation of plant gene function.</a> Nat Protoc. 5 (6), 1210-1227 (2010).</li><li>Mortimer, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+and+rapid+extraction+of+hydrocarbons+from+Nicotiana+glauca:+a+potential+advanced+renewable+biofuel+source.">The identification and rapid extraction of hydrocarbons from Nicotiana glauca: a potential advanced renewable biofuel source.</a> Phytochem Lett. 5 (3), 455-458 (2012).</li><li>Fraser, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-performance+liquid+chromatography+with+photodiode+array+detection+to+the+metabolic+profiling+of+plant+isoprenoids.">Application of high-performance liquid chromatography with photodiode array detection to the metabolic profiling of plant isoprenoids.</a> Plant J. 24 (4), 551-558 (2000).</li><li>Lisec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatography+mass+spectrometry-based+metabolite+profiling+in+plants.">Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants.</a> Nat Protoc. 1 (1), 387-396 (2006).</li></ol>

המחקר שהוביל לתוצאות הללו קיבל מימון מתכנית המסגרת השביעית באירופה ([FP7/2007-2013]) תחת מספר הסכם מענק 311,804.

הפרוטוקולים שהוצגו כאן לספק מסגרת מקיפה לניתוח עלים עץ טבק למטבוליטים ותמלילים. זה שחזה כי מאמצים המשולבים אלה צריכים לספק לנו תובנות חדשות על התהליכים שבבסיס הסינתזה והחול של פחמימנים ותרכובות הערך גבוהות הנוכחים ברקמה זו. גישות אלו ולכן צריכה לתת לנו הבנה טובה יותר לאופן שבו התרכובות נמצאים מסונתזים. בנוסף להיבטי עץ הטבק של העבודה, הוא גם נועד לשפר ביומסה צפצפה, במיוחד מיקוד lignification של קיר מבנה משני, אלא גם כדי לחקור האם אנו יכולים להשתמש בקליפה להפקת תרכובות יקרות ערך. השיטות שהוצגו במאמר זה הן שינויים קלים בשיטות סטנדרטיות לפרופיל המטבוליט. שיטות אלה הן כמובן מוגבלות לפרופילים מטבולים ידועים, וזה אפשרי שהיו יכולים להתקבל כמה פסגות חילוף חומרים חדשות עבור which ידוע אין מתחם. אנו מקווים לשים את התרכובות הללו בהקשר למטבוליטים אחרים על ידי שילוב של התנהגותם של מטבוליטים ותמלילים על הסדרה התפתחותית הזמן. אף אחת מהשיטות שהוצגו כאן הם השתנו באופן משמעותי משיטות משמשות בדרך כלל לחומרים צמחיים. ההיבט המעניין טמון בשילוב של שיטות כדי להבין את המסגרת הבסיסית לייצור בעיקר ארוך פחמימנים שרשרת ושינוי בעץ העלים טבק. אחד הצעדים הקריטיים לקבלת מידע זה הוא השילוב הבא של סוגי נתונים השונים. אנחנו מדמיינים שאת הנתונים כהערכה ראשונה יחולקו לאשכולות שונים המבוססים על ההתנהגות של מטבוליטים / תעתיקים על הפיתוח ושנתונים אלה ישמשו להסיק תמליל לעומת התנהגויות המטבוליט, וגם פוטנציאל ללהקצות מטבוליטים מסוימים למסלולים . בנוסף, ניתוחים מבוססי רשת משוכללות יותר אז הם חזו לאo לנצל קשרים סיבתיים. פרוטוקולי האנליטיות שהוצגו כאן גם יספק בסיס לניסויי שדה וניצול תעשייתי של ביומסה. כדי להשיג זאת, קונסורציום MultiBioPro מכיל כמה שותפים תעשייתיים שיש את היכולות כדי להמשיך לחקור ביומסה, במטרה לספק ביו דיזל, bioethanol ותרכובות בעלי ערך גבוה אחרות. הניצול ביומסה סוגים אלה ייבחנו על בסיס; (1) בדיקות החוסן ואיכות של המוצרים ביו מיוצרים (בדיקות תקן התעשייה טיפוסיות תבוצענה כדי לוודא שיש המוצרים שנוצרו ערך שוק טוב), (2), הערכה כלכלית, חברתית וסביבתית של הטכנולוגיות תבוצע שימוש במקורות ספרות, ראיונות וחומר שנוצר במהלך ניסויים שדה והערכות biorefinery מפעל פיילוט. פעילויות אלה יכללו עלות תועלת וניתוח מחזור החיים, הדור של תיק וbusine ושוק סביבתיאסטרטגיות ss. אנו מאמינים כי צינור זה יהיה שילוב שימושי של אקדמיה, מדע יישומים וניצול תעשייתי לביומסה עץ צפצפה וטבק נוספת למוצרים סופיים לצרכן.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51393/transcript-metabolite-profiling-for-evaluation-tobacco-tree-poplar-as">Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry</a>.
There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from: 
Juan Pedro Navarro
to:
Juan Navarro-Avi&#241;&#243;

A correction was made to: Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry.

Erratum: Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

אוכלוסייה וצמיחה כלכלית גרמו לביקוש הולך וגובר למזון, מים ודלק. חלק גדול מציוד אלה מיוצרים, מעובד ומועבר באמצעים מבוססי מאובנים סופיים, כגון נפט. היא, לעומת זאת, ברורה שבפועל זה לא בר קיימא, והפיתוח של משאבים חלופיים יהיה אפוא להיות חשיבות רבה 1. משאבים מתחדשים רבים, בדרגות שונות, כיום מנוצלים לרעה, כוללים רוח, תנועת מים, שמש, אנרגיה גיאותרמית, ולנופף במקורות אנרגיה מבוססות. משאב בר קיימא ומידה רב בלתי מנוצל נוסף הוא ביומסה מצמחים. משאב זה גם מציע דרך יעילה וחסכונית מאוד להמרת אנרגיה מתאים הסולאריים לדלקים 2. מלבד לספק דלק ביו מבוסס, ביומסה במפעל גם מציעה הזדמנויות ייחודיות למוצרים חלופיים, כוללים פלסטיק, חומרי ניקוי וכימיקלים יקרי ערך. קיר צמח התא, אשר מורכב בעיקר של פולימרים מבוססי סוכר, Makes את העיקר העיקרי של ביומסה במפעל והרבה מאמץ בימים אלה מושקע בגיור שלה יעיל לbioethanol. ביומסה הנותרת רשאים לאחר מכן תעובד לתוך יוגז ומוצרי נפט הקשורות 3. חלק גדול מהמינים הרב שנתי הצמח, כוללים עשבים ועצים, המייצרים כמויות גדולות של ביומסה תאית בדרך כלל לגדול ביותר באזורים הממוזגים. עם זאת, כ 20% מהשטח הוא צחיח למחצה, ולכן הוא גם נוטה לבצורות 4. ברור, זה יהיה עניין גם לעבד את האדמה הצחיחה אלה עם צמחים שיעילות יכולה לתרום לייצור בר קיימא של אנרגיה וחומר. צמחים אלה צריכים להיות יעילות שימוש במים אופטימלי והתנגדות בצורת ויכלול את עץ הטבק (Nicotiana glauca) ומינים מהסוג אגבה. קונסורציום MultiBioPro שואף ליישם צינור biorefinery משולב, תוך שימוש בשני CR החשובמיני אופ, צפצפה ועץ טבק. צפצפה התפתחה כיבול דלק ביולוגי מבטיח כפי שהוא גדל במהירות, בקלות מופצות על clonally וישימה מאוד למגוון רחב של תנאי אקלים וקרקע. הוא גם מספק מגוון רחב של עץ, סיבים, עץ דלק, ומוצרי יער אחרים 5. עץ הטבק התפתחה גם כצמח מתאים למטרות דלק ביולוגיים וbiorefinery. זה בדרך כלל מייצר כמויות ניכרות של ביומסה, מכיל כמויות גבוהות של פחמימות nonstructural 6, וגם יש לו את היכולת נדירה לצבור כמויות גדולות של שמנים שניתן להפיק בקלות nonfood (כוללים שרשרת ארוכה C 29-C 31 בפחמימנים וtriterpenoids רוויים) שמתאימות לביודיזל ייצור. עץ הטבק הוא, יתר על כן, ניתנים לשיפור גנטי, יש לו יכולת נביטה גבוהה, וגדל בשמחה על קרקעות צחיחות למחצה אינו משמשות לייצור מזון. נראה אפוא כי לשתי צפצפה ועץ טבק פוטנציאל מהותי לmultipגידולי urpose, כלומר כחומר זינת ערך גבוה חדש לתעשייה ביו מבוסס אינטגרטיבית. במאמר זה אנו מתמקדים בקבוצה מגוונת של גישות להבחין פחמימנים שרשרת כמה זמן פיקדונות עץ טבק. בניסיון לזהות את המנגנון המולקולרי שבבסיס אחראי על הייצור והפרשה של פחמימנים הרוויים ארוכת שרשרת עליי טבק, אנחנו מיישמים &quot;omics&quot; המודרני מבוסס טכנולוגיות. זה כולל seq RNA של סדרה התפתחותית עלה (עשרה שלבים), ופרופיל המטבוליט מרובה גישות באמצעות LC-וGC-MS (למטבוליטים וlipidomics קוטב פולריים). נתונים אלה ישמשו לשלי לביטוי גנים שעולה בקנה אחד עם, או מקדים, את התחלתה של ביוסינתזה של המולקולות שצוינו לעיל. הגנים ומסלולים המופיעים מבטיח ממאמצים אלה ישמשו לבדיקות פונקציונליות בארבידופסיס מיני מודל וסופו של דבר יכולים להיות נוח להנדסה ביוטכנולוגית בTobעץ עכו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:579px;" width="578">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Name</td>
			<td style="width:124px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:144px;">Catalog number&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol reagent</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right" style="width:144px;">101986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TURBO Dnase</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938-90034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml and 2 ml safe-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160; 0030 120.086, 0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steel balls</td>
			<td>Geyer Berlin GmbH</td>
			<td>VA2mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mixer mill MM 300</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>YO-04182-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">5424</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcript and metabolite profiling for the evaluation of tobacco tree and poplar as feedstock for the bio-based industry

הביקוש העולמי למזון, מזון, אנרגיה ומים מציב אתגרים יוצאי דופן לדורות הבאים. ניתן לראות כי פלטפורמות חזקות לחקר משאבים מתחדשים הן הכרחיות כדי להתגבר על אתגרים אלה. במסגרת רב לאומית MultiBioPro אנו מפתחים צינורות biorefinery למקסם את השימוש של ביומסה במפעל. באופן ספציפי יותר, אנו משתמשים בצפצפה ועץ טבק (Nicotiana glauca) כיבול יעד מינים לשיפור saccharification, isoprenoid, תכולת פחמימנים שרשרת ארוכה, באיכות סיבים, ותכנים שעימן וליגנין. השיטות המשמשות לקבל פלטים אלה כוללות GC-MS, LC-MS ופלטפורמות רצף RNA. צינורות המטבוליט מבוססים היטב בכלים כדי לייצר סוגים אלה של נתונים, אבל יש גם יכולות לשמש את המגבלות שבמטבוליטים רק מאופיינים היטב. רצף העמוק יאפשר לנו לכלול את כל התמלילים הנוכחים במהלך שלבי ההתפתחות של עלה עץ הטבק, אבל hכמו להיות ממופה חזרה לרצף של tabacum Nicotiana. עם להגדיר קופצים אלה, אנו שואפים בהבנה בסיסית של תהליכים הבסיסיים ובהקמת מסגרת תעשייתית לנצל את התוצאות. בראייה ארוכת טווח יותר, אנו מאמינים כי הנתונים שנוצרו כאן יספק אמצעי לתהליך biorefinery קיימא באמצעות עץ צפצפה וטבק כחומר גלם. עד כה ברמה הבסיסית של מטבוליטים בדגימות כבר ניתח והפרוטוקולים מנוצלים מסופקים במאמר זה.

פרופיל HPLC באיור 1 מראה תוצאת נציג ניתוח isoprenoid של נ &#39; תמציות עלים glauca. איזופרנואידים של C40 ומעלה התגלו באמצעות מערך התמונה דיודה גלאי (מחשב כף יד). הפסגות היו מפורשות המבוססות על שיתוף כרומטוגרפיה והשוואה רפאים בין תקנים אותנטיים, בטא קרוטן (provitamin), phytoene, ליקופן, לוטאין וזאקסנטין. שני chromatograms MS באיור 2 מראה את התוצאה של ניתוח המטבוליט עיקרי מנ חומרים עלה glauca וגזע, בהתאמה. ספקטרום MS של שיא המקביל לסרין (מסומן על ידי חץ) ניתן גם לדוגמא ירושלים. איור 3 מציג את Bioanalyzer המשמש לקביעת האיכות של RNA ופלט נציג מהמכשיר. שתי הפסגות העיקריות בהכרומתוגרמה המתאימה 18 S ו25 RNA ריבוזומלי S, המציין RNA שלם במדגם. פסגות נוספות של צלעות מקוטעותosomal RNA היה מופיע במקרה של RNA באופן חלקי או בכבדות המושפל. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51393/51393fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51393/51393fig1.jpg" /> איור 1. פרופיל HPLC מראה isoprenoids הווה בתמציות עלה מנ glauca. רוב isoprenoids של C40 ומעלה אינם ניתן לניתוח GC-MS. לפיכך, אנו משמשים הפרדות HPLC עם זיהוי מערך דיודת אור. הכרומתוגרמה טיפוסית נרשמה ב450 ננומטר מוצגת. פיגמנטים קרוטנואידים אופייניים לרקמות פוטוסינתזה עם ראשן לוטאין. גם בהווה הוא זאקסנטין, אשר נמצא ברקמת עלה רק לעתים נדירות, אלא אם כן הניחה תחת לחץ אור גבוה. הרמות של זאקסנטין להפוך אותו למקור טוב של מתחם בעלי ערך גבוה זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51192/51192fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג v גדול</a>ersion של נתון זה. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51393/51393fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51393/51393fig2.jpg" /> איור 2. הכרומתוגרמה MS וספקטרום של נ &#39; תמציות רקמת glauca. הכרומתוגרמה סה&quot;כ יון MS (TIC) של עלים וגזע תמציות נמדדות על ידי GC-MS מוצגת (70-600 מ &#39;/ z). ניתוח GC-MS בוצע כפי שתואר קודם לכן ב15. פסגות זוהו היו מפורשת בשימוש בספריית תגי ספקטרלי ההמוני. ספקטרום MS של סרין (2TMS) מוצג כדוגמא. הכרומתוגרמה MS: ציר X וציר Y מצביעים על זמן שמירה (דקות) ועוצמה (שפע) של האות, ספקטרום MS: ציר X וציר Y מציינים את יחס M / Z והעוצמה (שפע) של האות, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51393/51393fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה גדולה יותר</a>תמונה. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51393/51393fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51393/51393fig3.jpg" /> איור 3. מדידת Bioanalyzer של RNA מוכן לseq RNA של נ &#39; חומרים עלה glauca. כדי להשיג RNA הטהור מאוד נחוץ לseq RNA אנו חילוץ RNA באמצעות מגיב Trizol ולאחר מכן מטוהרים RNA באמצעות העמודות מקיט RNeasy מיני (Qiagen, Hilden, גרמניה). אנחנו נקבע את איכות RNA באמצעות Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, גרמניה) המופיע משמאל. דוגמא של פלט Bioanalyzer ניתנת בצד הימין. שתי הפסגות העיקריות במדגם מייצגות 18 S ו25 RNA ריבוזומלי S. המדגם שלנו הראה מספר RNA יושרה (רין) של 9.2, שהוא הרבה מעל הערך הנדרש של 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51393/51393fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ</a>דואר לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Watch this Scientific Journal Video about Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry at JoVE.com

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

ביומסה במפעל מציע משאב מתחדש למספר רב של מוצרים, כוללים דלק, מזון, מזון ומגוון רחב של חומרים. במאמר זה אנו לחקור את המאפיינים של עץ טבק (Nicotiana glauca) ומקורות מתאימים כמו צפצפה לצינור biorefinery.

תמליל והמטבוליט Profiling להערכת של טבק ועץ צפצפה כחומר גלם לתעשייה המבוססת על ביו

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

transcript-metabolite-profiling-for-evaluation-tobacco-tree-poplar-as

Research

JoVE Journal

Environment

15.0K Views.  Max Planck Institute for Molecular Plant Physiology.  ביומסה במפעל מציע משאב מתחדש למספר רב של מוצרים, כוללים דלק, מזון, מזון ומגוון רחב של חומרים. במאמר זה אנו לחקור את המאפיינים של עץ טבק (Nicotiana glauca) ומקורות מתאימים כמו צפצפה לצינור biorefinery. 

Video: Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

Technique for Studying Arthropod and Microbial Communities within Tree Tissues

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms. Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear young, feed, or hide from natural enemies or harsh environmental conditions outside of the tree. Organisms that persist within the phloem habitat are difficult to observe given their location under bark. We provide a technique to preserve intact phloem and prepare it for experimentation with invertebrates and microorganisms. The apparatus is called a &#8216;phloem sandwich&#8217; and allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms. This technique has resulted in a better understanding of the feeding behaviors, life-history traits, reproduction, development, and interactions of organisms within tree phloem. The strengths of this technique include the use of inexpensive materials, variability in sandwich size, flexibility to re-open the sandwich or introduce multiple organisms through drilled holes, and the preservation and maintenance of phloem integrity. The phloem sandwich is an excellent educational tool for scientific discovery in both K-12 science courses and university research laboratories.

We provide a technique to preserve intact tree phloem and prepare it for observation. We create an apparatus called a phloem sandwich that allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms that inhabit phloem tissues.

טכניקת לימוד של פרוקים-רגליים וקהילות חיידקים בתוך רקמות עץ

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms.  Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear ...

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

ביטוי של רקומביננטי Cellulase Cel5A מ<em&gt; Reesei Trichoderma</em&gt; בצמחים טבק

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Evaluation of Integrated Anaerobic Digestion and Hydrothermal Carbonization for Bioenergy Production

Lignocellulosic biomass is one of the most abundant yet underutilized renewable energy resources. Both anaerobic digestion (AD) and hydrothermal carbonization (HTC) are promising technologies for bioenergy production from biomass in terms of biogas and HTC biochar, respectively. In this study, the combination of AD and HTC is proposed to increase overall bioenergy production. Wheat straw was anaerobically digested in a novel upflow anaerobic solid state reactor (UASS) in both mesophilic (37 &#176;C) and thermophilic (55 &#176;C) conditions. Wet digested from thermophilic AD was hydrothermally carbonized at 230 &#176;C for 6 hr for HTC biochar production. At thermophilic temperature, the UASS system yields an average of 165 LCH4/kgVS&#160;(VS: volatile solids) and 121 L CH4/kgVS&#160;at mesophilic AD over the continuous operation of 200 days. Meanwhile, 43.4 g of HTC biochar with 29.6 MJ/kgdry_biochar was obtained from HTC of 1 kg digestate (dry basis) from mesophilic AD. The combination of AD and HTC, in this particular set of experiment yield 13.2 MJ of energy per 1 kg of dry wheat straw, which is at least 20% higher than HTC alone and 60.2% higher than AD only.

A novel Upflow Anaerobic Solid State (UASS) reactor was used for biogas production from fibrous feedstock. Digestate from UASS reactor was hydrothermally carbonized into HTC biochar in a pressurized batch reactor. The integration of the two bioenergy concepts was applied in this study to increase overall bioenergy production.

הערכה משולבת אנאירובי העיכול והידרותרמיים פחום ליואנרגיה הפקה

Lignocellulosic biomass is one of the most abundant yet underutilized renewable energy resources. Both anaerobic digestion (AD) and hydrothermal ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of scientific publications address microplastic pollution of the sea surface. The protocol below describes the methodology for sampling, sample preparation, separation and chemical identification of microplastic particles. A manta net fixed on an &#187;A frame&#171; attached to the side of the vessel was used for sampling. Microplastic particles caught in the cod end of the net were separated from samples by visual identification and use of stereomicroscopes. Particles were analyzed for their size using an image analysis program and for their chemical structure using ATR-FTIR and micro FTIR spectroscopy. The described protocol is in line with recommendations for microplastics monitoring published by the Marine Strategy Framework Directive (MSFD) Technical Subgroup on Marine Litter. This written protocol with video guide will support the work of researchers that deal with microplastics monitoring all over the world.

The protocol below describes the methodology for: microplastics sampling on the sea surface, separation of microplastic and chemical identification of particles. This protocol is in line with the recommendations for microplastics monitoring published by the MSFD Technical Subgroup on Marine Litter.

פרוטוקול עבור דגימת חלקיקים על פני הים וניתוח לדוגמא

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment during manufacturing and transport. Because of their environmental persistence, they are widely distributed in the oceans and on beaches all over the world. They can act as a vector of potentially toxic organic compounds (e.g., polychlorinated biphenyls) and might consequently negatively affect marine organisms. Their possible impacts along the food chain are not yet well understood. In order to assess the hazards associated with the occurrence of plastic pellets in the marine environment, it is necessary to develop methodologies that allow for rapid determination of associated organic contaminant levels. The present protocol describes the different steps required for sampling resin pellets, analyzing adsorbed organochlorine pesticides (OCPs) and identifying the plastic type. The focus is on the extraction of OCPs from plastic pellets by means of a pressurized fluid extractor (PFE) and on the polymer chemical analysis applying Fourier Transform-InfraRed (FT-IR) spectroscopy. The developed methodology focuses on 11 OCPs and related compounds, including dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) and its two main metabolites, lindane and two production isomers, as well as the two biologically active isomers of technical endosulfan. This protocol constitutes a simple and rapid alternative to existing methodology for evaluating the concentration of organic contaminants adsorbed on plastic pieces.

Microplastics act as vector of potentially toxic organic contaminants with unpredictable effects. This protocol describes an alternative methodology for assessing the levels of organochlorine pesticides adsorbed on plastic pellets and identifying the polymer chemical structure. The focus is on pressurized fluid extraction and attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy.

הפקת חומרי הדברה אורגנוכלורינים מפלסטיק וגלגול סוג פלסטיק

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, and the majority of extant heteropterans retain this trophic strategy. Some heteropterans have transitioned to feeding on vertebrate blood (such as the kissing bugs, Triatominae; and bed bugs, Cimicidae) while others have reverted to feeding on plants (most Pentatomomorpha). However, with the exception of saliva used by kissing bugs to facilitate blood-feeding, little is known about heteropteran venoms compared to the venoms of spiders, scorpions and snakes.
One obstacle to the characterization of heteropteran venom toxins is the structure and function of the venom/labial glands, which are both morphologically complex and perform multiple biological roles (defense, prey capture, and extra-oral digestion). In this article, we describe three methods we have successfully used to collect heteropteran venoms. First, we present electrostimulation as a convenient way to collect venom that is often lethal when injected into prey animals, and which obviates contamination by glandular tissue. Second, we show that gentle harassment of animals is sufficient to produce venom extrusion from the proboscis and/or venom spitting in some groups of heteropterans. Third, we describe methods to harvest venom toxins by dissection of anaesthetized animals to obtain the venom glands. This method is complementary to other methods, as it may allow harvesting of toxins from taxa in which electrostimulation and harassment are ineffective. These protocols will enable researchers to harvest toxins from heteropteran insects for structure-function characterization and possible applications in medicine and agriculture.

Although many insects in the suborder Heteroptera (Insecta: Hemiptera) are venomous, their venom composition and the functions of their venom toxins are mostly unknown. This protocol describes methods to harvest heteropteran venoms for further characterization, using electrostimulation, harassment, and gland dissection.

קציר ארס מרעלים חרקים טורפים וחרקים אחרים Heteropteran

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on collecting various sized particulate matter (PM) retained on leaf surfaces. We further characterized the retention efficiency of leaves to various sized PM, which will help to assess the abilities of urban trees to remove PM from ambient air quantitatively. 
Taking three broadleaf tree species (Ginkgo biloba, Sophora japonica, and Salix babylonica) and two needleleaf tree species (Pinus tabuliformis and Sabina chinensis) as the research objects, leaf samples were collected 4 days (short PM retention period) and 14 days (long PM retention period) after the latest rainfall. PM retained on the leaf surfaces was collected by means of WC, BC, and UC in sequence. Then, retention efficiencies of leaves (AEleaf) to three types of the various sized PM, including easily removable PM (ERP), difficult-to-remove PM (DRP), and totally removable PM (TRP), were calculated. Only around 23%-45% of the total PM retained on leaves could be cleaned off and collected by WC. When the leaves were cleaned through WC+BC, the underestimation of the PM retention capacity of different tree species was in the range of 29%-46% for various sized PM. Almost all PM retained on leaves could be removed if UC was supplemented to WC+BC. 
In conclusion, if the UC was complemented after the conventional cleaning methods, more PM on leaf surfaces could be eluted and collected. The procedure developed in this study can be used for assessing the PM removal abilities of different tree species.

The ultrasonic cleaning method was applied to elute the particulate matter (PM) retained on leaf surfaces after PM was eluted by the conventional cleaning methods (water cleaning only or water cleaning plus brush cleaning). The methodology can help to improve the estimation accuracy for PM retention capacity of leaves.

הערכת היכולות הסרת חלקיקים של העץ עלים

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

וזמינותו תפוקה גבוהה עבור חיזוי של רעילות כימית על ידי אוטומטית פרופילים פנוטיפי של Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

The symplastic tracer 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) has been widely applied in living plants to demonstrate the intercellular connection, phloem transport and vascular patterning. This protocol shows bottom-to-top carboxyfluorescein (CF) movement in the Arabidopsis by using the root-cutting and the hypocotyl-pinching procedure respectively. These two different procedures result in different efficiencies of CF movement: about 91% appearance of CF in the shoots with the hypocotyl-pinching procedure, whereas only about 70% appearance of CF with the root-cutting procedure. The simple change of loading sites, resulting in significant changes in the mobile efficiency of this symplastic dye, suggests CF movement might be subject to the symplastic regulation, most probably by the root-hypocotyl junction.

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

The goal of this protocol is to show how to load the CFDA into different sites of the bottom parts of Arabidopsis. We then present the resulting distribution pattern of CF in the shoots.

שירי תנועה של CFDA מעקב טעון ברקמות הכיור התחתון של Arabidopsis

The symplastic tracer 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) has been widely applied in living plants to demonstrate the intercellular connection, ...