MultiBioPro möchte den folgenden Personen, die auch zu dem Projekt beitragen bedanken: Dominic Swinton (Grün Fuels), Thomas Lowery (Grün Fuels), Sam Buekenhout (Capax) und Sylvia Drouven (Capax).

1. Pflanzenmaterial Nicotiana glauca wachsen Pflanzen in 30 cm Durchmesser Töpfe mit M2 professional wachsende Medium. Wachsen Pflanzen im Gewächshaus, mit einer Tagestemperatur von 20-25 ° C und Nachttemperatur von 15 ° C. Verwenden Sie eine 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit-Zyklus als zusätzliche Lichtregime. 2. Probenvorbereitung <ol><li> Für die Haupt-Metabolite: <ol><li> Ernte Pflanzenmaterial (Blätter und Stängel von N. glauca) und gefrier Material sofort. </li><li> Lyophilisieren gefrorene Pflanzenmaterial durch Gefriertrocknung für drei Tage. </li><li> Grind gefriergetrockneten Proben durch Schwingmühle mit Metallkugeln. </li><li> Aliquot fein geschliffen trockenen Materialien in ein 2 ml Zentrifugenröhrchen oder Glasfläschchen. </li></ol></li><li> Für Sekundärmetaboliten: <ol><li> Ernte Pflanzengewebe und gefrier Material sofort. </li><li> Grind gefrorene Pflanzengewebe durch mixer Mühle mit Edelstahlkugel oder durch Mörser und Stößel. </li><li> Aliquot fein geschliffen Gewebe in 2 ml-Zentrifugenröhrchen (ca. 20 mg Feuchtgewicht). </li></ol></li></ol> 3. Extraction Protokoll für die Metabolite Profiling für primäre Metaboliten durch GC-MS <ol><li> Aliquot Boden trocken Pflanzenmaterial (10 mg und 20 mg Blatt der Stamm Materialien) in 2 ml, Schraubverschluss, Rundbodenröhrchen. </li><li> In 1400 ul von 100% Methanol und Vortex für 10 Sekunden. </li><li> In 60 ul Ribitol (0,2 mg / ml Stamm in H 2 O) als interner Standard und quantitative Vortex für 10 Sekunden. </li><li> In einem Edelstahl (oder Zirkonoxid) Ball und homogenisieren Material mit einer Schwingmühle für 2 min bei 25 Hz. </li><li> Zentrifugieren Sie die Mischung für 10 min bei 11.000 x g. </li><li> Den Überstand in ein Glasfläschchen. </li><li> In 750 ul Chloroform. </li><li> In 1500 ul H 2 O und verwirbeln die Mischung für 10 Sekunden. </li><li> Überweisung von 150 ul derOberphase (polare Phase) in ein frisches 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Trockenproben mit einer Geschwindigkeit vac. Es ist zwingend notwendig, dass die Proben zur Trockene einge zwischen 3 und 24 Stunden reduziert wird, bis keine Restflüssigkeit vorhanden ist. </li><li> 40 &amp;mgr; l Methoxyaminhydrochlorid (20 mg / ml in Pyridin). </li><li> Schütteln der Mischung in einer horizontalen Heizblock Schüttler für 2 h bei 37 ° C. </li><li> Add 70 ul N-Methyl-N - (trimethylsilyl)-trifluoracetamid MSTFA Mischung. </li><li> Schütteln Sie die Mischung für 2 Stunden bei 37 ° C </li><li> Spin down die Tropfen auf dem Cover durch eine kurze Zentrifugation ~ 1 min bei 11.000 x g. </li><li> Die Flüssigkeit in Glasfläschchen für GC-MS-Analyse. </li></ol> 4. Extraktion für Metabolite Profiling für Sekundärmetabolite durch LC-MS <ol><li> In 500 ul Methanol zu den gefrorenen Bodenproben. </li><li> Shake mit einem Thermomixer für 15 min bei 70 ° C (1.000 s -1). </li><li> Zentrifugieren Sie die Proben (5 kmn, 20.000 × g) und das in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführt flüssigen Phase. </li><li> Lyophilisieren der flüssigen Phase mit einer zentrifugalen Verdampfer (SpeedVac). </li><li> 100 l Cyclohexan und 100 ul Milli-Q-Wasser auf die trockene Pellets. </li><li> Schütteln der Proben für 5 min bei Raumtemperatur (Verwendung Vortex). </li><li> Zentrifugieren der Proben (5 min, 20.000 xg). </li><li> Übertragen Sie 80 ul der Wasserphase (untere Phase) LC-MS-Injektionsflaschen mit konischen Boden für die LC-MS-Analyse. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Konfigurieren Xcalibur, MarkerLynx, Metalign 7 oder 8 XCMS und wählen Sie die Datenanalyse verarbeitet werden. </li><li> Bereiten Sie eine Tabelle der erfassten Spitzen von Ihrem Interesse nach Verbindungsklasse in Tabelle 1. </li><li> Identifizieren Spitzen, die durch Co-Elution von Standardverbindungen. </li><li> Anschließend kommentieren detektierten Peaks mit MSN Analyse, strukturelle Charakterisierung Algorithmen 9,10, Literatur survey und Metabolit-Datenbanksuche 11,12. </li></ol> 6. Kohlenwasserstoff-Extraktion 13 <ol><li> Tauchen Sie frisch geernteten N. glauca Blätter (~ 200 mg) in einem Lösungsmittel (Methanol, Ethanol, Chloroform, Hexan oder Petrolether (Siedepunkt 40-60 ° C oder 60-80 ° C) (5 ml, HPLC-Qualität) für 2 bis 20 min. </li><li> Blätter entfernen und vollständig trocknen Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung. </li><li> Resuspendieren Proben in Hexan (1 ml, HPLC-Qualität). </li><li> Führen GC-MS-Analyse mit Gaschromatographie und Bindestrich zu einem 5973MSD. Betriebsbedingungen sollte wie folgt; Trägergas Helium mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,9 ml min -1 / 11 psi. Injizieren Proben (1 ul) mit einer Splitless-Injektor bei 280 ° C Halten Sie die Gaschromatographie Schrank bei 70 ° C für 5 min vor dem Hochfahren bei 4 ° C / min bis 320 ° C. Halten Sie das endgültige Temperatur für weitere 10 min, so dass eine Gesamtzeit von 67,5 min. Einstellen der Schnittstelle mit der MS bei 280 º C und perform MS im Full-Scan-Modus mit 70 eV EI + und von 10 bis 800 D. gescannt </li><li> Zunächst verarbeitet die Komponenten Chromatogramm durch automatisierte MS Entfaltung und Identifikationssystem, und solche, die unter Verwendung der NIST-98 MS-Bibliothek identifiziert werden. </li><li> Bestätigen Sie die Identifikation von gesättigten langkettigen Alkan-Kohlenwasserstoffe (hexacosenol, Nonacosan, Triacontan, octacosenol, nonacosonal, Hentriacontan, Dotriacontan und tritriacontane) durch den Vergleich Retentionszeiten und klassische Fragmentierungsmuster zu bekannten authentischen Standards. </li><li> Bestimmen Sie quantitativ Kohlenwasserstoffe durch den Vergleich integrierten Peakflächen mit der Dosis-Wirkungs-Kurven (0,07 bis 2,5 mg), von authentischen Standards gebaut. </li><li> Berechnet Mittelwerte und Standardfehler der Mittelwerte (SEM) unter Verwendung von Excel-Software. </li></ol> 7. Analyse der Isoprenoide 14 <ol><li> Führen Homogenisierung, wie in Kapitel 2 beschrieben. Wiegen in 10 mg gefriergetrocknetes Pulver homogenisiert, in ein Zentrifugenröhrchen.</li><li> In der Reihe 250 ml Methanol auf das Pulver, mischen Sie es, dann fügen Sie 500 ml Chloroform (Laborreagens grade), und mischen Sie es mit einem Vortex. </li><li> Lassen Sie die Proben auf Eis im Dunkeln für 20 min. </li><li> In 250 ml Tris-HCl-Puffer (100 mM, pH 7,5) oder Wasser (HPLC-Qualität) zu der Suspension und vortexen. </li><li> Zentrifugieren der Mischung bei 12.000 rpm (13.523 × g) für 5 min, um das nichtpolare aus wässrigen Phasen zu trennen. Die unpolare Phase, die Chloroform-Extrakte Isoprenoid ist an der Unterseite. </li><li> Übertragen der Phase in ein neues Zentrifugenröhrchen. </li><li> Fügen Sie eine zusätzliche 500 ml Chloroform zu der wässrigen Phase, und führen eine zweite Extraktion durch Wirbel und Zentrifugation wie oben beschrieben. </li><li> Kombinieren Sie die Chloroform-Extrakte und bringen die Proben bis zur Trockene mit dem Verdampfer und bei -20 ° C bis zur Analyse. </li><li> 50 ml Ethylacetat (HPLC-Qualität) auf die getrocknete Extrakt isoprenoiden, um das Material wieder zu lösen. </li><li> Inject 3 ml auf eine C18-Säule mit einem UPLC Acquity Trennmodul. Die verwendete, um die Pigmente zu trennen Gradienten sollte beinhalten; A: Methanol / H 2 0 (50:50) und B: Acetonitril / Ethylacetat (75:25), und die Anfangsbedingungen sollte eine 30% ige (v / v) und B 70% (v / v) würde 100 % B über 6 min. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 0,6 ml / min. </li><li> Überwachung des Eluats kontinuierlich mit einem Photodiodenarray (PDA)-Detektor von 250 bis 600 nm aufweist. </li><li> Identifizieren Komponenten durch Co-Chromatographie und spektrale Vergleiche zwischen authentischen Standards, Beta-Carotin (Provitamin A), Phytoen, Lycopin, Lutein und Zeaxanthin. </li><li> Führen Quantifizierung von Dosis-Wirkungs-Kurven. </li><li> Bestätigen Verbindungen mittels LC-MS; verwenden ähnliche chromatographischen Bedingungen. Der Nachweis sollte mit APCI Ionisation in positiven Modus mit einem Q-Tof Instrument durchgeführt werden. </li><li> Sind die Änderungen für die Bestimmung Tocopherol mit 25 mg gefriergetrocknetes Material, das bei 50 ° C für 1,5 Stunden extrahiert worden ist und die Verseifung in 6% KOH. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 8. RNA-Extraktion für die RNA-Seq Dieses Protokoll verbindet Trizol-RNA-Extraktion mit einem RNeasy Kit, um qualitativ hochwertige RNA zu erhalten. <ol><li> Grind 100 mg gefrorene Pflanzenmaterial in 2 ml Zentrifugenröhrchen mit einer Metallkugel durch einen Mischer Mühle. </li><li> 1 ml Trizol. </li><li> Zentrifugieren des Materials für 10 Minuten bei 12.000 × g bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand in ein neues Reaktionsröhrchen. </li><li> In 200 ul Chloroform, das Röhrchen mehrmals, und Inkubation von 3 min bei Raumtemperatur. </li><li> Zentrifugieren der Mischung für 15 min bei 12.000 × g bei 4 ° C. </li><li> Wird die obere wäßrige Phase (ca. 700 &amp;mgr; l) in ein neues Reaktionsröhrchen. </li><li> In ca. 2,5 Volumen Ethanol (100%), das Röhrchen mehrmals, und Inkubation für 30 min bei -80 ° C </li><li> Bewegen der Probe einschließlich der Niederschlag auf die Spinsäule von Kits. </li><li> Zentrifugieren Sie die Spalte für 15 Sekunden bei 8.000 g, und entsorgen Sie die fNieder durch. </li><li> Add 700 ul Puffer RW1 auf die Spinsäule und zentrifugieren für 15 sec bei 8.000 x g. Die Durchströmung zu verwerfen. </li><li> Gib 500 ul Puffer RPE auf die spin-Säule und Zentrifugieren der Säule für 15 sec bei 8.000 x g. Die Durchströmung zu verwerfen. </li><li> Gib 500 ul Puffer RPE auf die spin-Säule zentrifugieren für 2 min bei 8.000 x g. </li><li> Legen Sie die Spin-Säule in ein neues Reaktionsgefäß 1,5 ml und 50 ul RNase-freies Wasser. </li><li> Zentrifugieren der Säule für 1 min bei 8.000 × g, um die RNA zu eluieren. </li><li> Rückstände von DNA mit einem DNA-frei Ambion Kit nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Bestimmen Sie die Qualität der RNA. Die RNA sollte über 8 RNA-Integrität Nummern (RIN) haben. </li><li> Senden Sie die RNA für die nächste Generation Sequenzierung. </li></ol>

<ol>
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Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen hat die Finanzierung aus dem Europäischen Siebten Rahmenprogramms ([FP7/2007-2013]) unter Finanzhilfevereinbarung Nr. 311804 erhalten.

Die hier vorgestellten Protokolle bieten einen umfassenden Rahmen für Tabak Baumblätter für Metaboliten und Transkripte zu analysieren. Es ist vorgesehen, dass diese gemeinsamen Anstrengungen sollten uns neue Einblicke in die Prozesse der Synthese und Extrusion der Kohlenwasserstoffe und der in diesem Gewebe vorhandenen hohen Wert zugrunde liegenden Verbindungen bereitzustellen. Diese Ansätze sollten daher geben uns ein besseres Verständnis dafür, wie die Verbindungen werden synthetisiert. Neben den Tabak Baum Aspekte der Arbeit, ist es auch Ziel, Pappel Biomasse verbessern, vor allem Targeting Verholzung der Sekundärwandstruktur, sondern auch zu erforschen, ob wir die Rinde für die Extraktion von wertvollen Verbindungen zu verwenden. Die in diesem Beitrag vorgestellten Methoden sind leichte Modifikationen von standardisierten Methoden zur Metabolit-Profiling. Diese Verfahren sind natürlich auf bekannte metabolische Profile beschränkt, und es ist möglich, dass mehrere neue metabolische Peaks für w erhalten werden,elche keine Verbindung bekannt ist. Wir hoffen, dass diese Verbindungen im Kontext zu anderen Metaboliten durch die Kombination das Verhalten von Metaboliten und Transkripte über den Entwicklungszeitreihen setzen. Keine der hier vorgestellten Verfahren sind in der Regel deutlich von Pflanzenmaterialien eingesetzten Verfahren verändert. Der interessante Aspekt liegt in der Kombination von Methoden, um die zugrunde liegende Framework für hauptsächlich langkettige Kohlenwasserstoffproduktion und Veränderung in den Tabakbaumblätter zu verstehen. Einer der kritischen Schritte zum Erhalten dieser Informationen ist die nachfolgende Kombination der verschiedenen Datentypen. Wir sehen, dass die Daten als eine erste Bewertung werden verschiedene Cluster eingeteilt werden, basierend auf dem Verhalten der Metaboliten / Transkripte über die Entwicklung und dass diese Daten dazu verwendet werden, Transkript gegen Stoffwechselverhalten abzuleiten, und auf bestimmte Stoffwechselwege potentiell zuweisen . Darüber hinaus sind weitere aufwendige Netzwerk-basierten Analysen dann vorgesehen to nutzen kausale Zusammenhänge. Die analytischen Protokolle hier vorgestellt wird auch eine Grundlage für die Feldversuche und industrielle Nutzung von Biomasse. Um dies zu erreichen, enthält die MultiBioPro Konsortium mehreren Industriepartnern, die die Fähigkeiten haben, weiter zu erforschen, die Biomasse, mit dem Ziel, Biodiesel, Bioethanol und andere hochwertige Verbindungen zu liefern. Diese Arten von Biomasse-Nutzung wird auf der Grundlage bewertet werden; (1) Prüfung der Robustheit und Qualität der Bio-Produkte hergestellt (typische Industriestandard-Tests durchgeführt, um sicherzustellen, dass die erzeugten Produkte haben gute Marktwert werden), (2), eine wirtschaftliche, soziale und ökologische Bewertung der Technologien durchgeführt werden unter Verwendung von Literaturquellen, Interviews und Material, das während der Feldversuche und Pilotanlage Bioraffinerie Einschätzungen erzeugt wird. Diese Aktivitäten gehören Kosten-Nutzen-und Lebenszyklusanalyse, die Erstellung eines Umweltdossiers, Markt-und business-Strategien. Wir glauben, dass diese Pipeline wird eine nützliche Mischung aus Wissenschaft geworden, angewandte Wissenschaft und industrielle Nutzung, weitere Pappel-und Tabak-Baum-Biomasse für die Verbraucher End-Produkte.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51393/transcript-metabolite-profiling-for-evaluation-tobacco-tree-poplar-as">Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry</a>.
There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from: 
Juan Pedro Navarro
to:
Juan Navarro-Avi&#241;&#243;

A correction was made to: Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry.

Erratum: Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

Bevölkerungs-und Wirtschaftswachstum haben einen steigenden Bedarf an Nahrung, Wasser und Brennstoffe verursacht wird. Viele dieser Versorgung hergestellt, verarbeitet und transportiert Finite fossilen Mittel, wie Mineralöl. Es ist jedoch klar, dass diese Praxis nicht nachhaltig, und die Entwicklung von alternativen Ressourcen werden daher von großer Bedeutung 1 sein. Viele erneuerbare Ressourcen sind, in unterschiedlichem Maße, derzeit ausgenutzt, darunter Wind-, Wasser-Bewegung, Sonne, Erdwärme, Wellen-und Energieträger. Eine weitere nachhaltige und weitgehend ungenutzte Ressource ist die Biomasse aus Pflanzen. Diese Ressource bietet auch eine sehr kostengünstige Möglichkeit, Solarenergie in abgeleiteten Brennstoffe 2 konvertieren. Neben der biologisch basierten Kraftstoff bietet die pflanzliche Biomasse auch einzigartige Möglichkeiten für alternative Produkte, einschließlich Kunststoffe, Waschmittel, und wertvolle Chemikalien. Die Pflanzenzellwand, die größtenteils aus Zucker basierten Polymeren, makES bis die Hauptmasse der Biomasse der Pflanze und viel Aufwand wird derzeit in der effizienten Umwandlung in Bioethanol investiert. Die restliche Biomasse kann anschließend in Biogas-und Öl 3 verwandte Produkte verarbeitet werden. Ein Großteil der mehrjährige Pflanzenarten, darunter Gräser und Bäume, die große Mengen von Zellulose-Biomasse erzeugen typischerweise wachsen am besten in den gemäßigten Zonen. Allerdings ist etwa 20% der Landfläche semi-ariden und ist daher auch anfällig für Dürren 4. Natürlich wäre es von Interesse sein, auch diese Trockengebiete pflegen mit Pflanzen, die effektiv auf die nachhaltige Produktion von Energie-und Material beitragen könnten. Diese Pflanzen brauchen, um eine optimale Effizienz der Wassernutzung und Trockenheitsresistenz und würde den Tabak-Baum (Nicotiana glauca) und Arten der Gattung Agave enthalten. Die MultiBioPro Konsortium soll eine integrierte Bioraffinerie-Pipeline zu implementieren, mit dem zwei wichtige crop-Arten, Pappel-und Tabakbaum. Pappel als vielversprechender Biokraftstoff-Pflanze entstanden, wie es wächst schnell, einfach klonal vermehrt und sehr anpassungsfähig an einer breiten Palette von Klima-und Bodenbedingungen. Es bietet auch eine große Auswahl an Holz-, Faser-, Brennstoff Holz und andere Waldprodukte 5. Die Tabak Baum wurde auch als einer geeigneten Anlage für Biokraftstoffe und Bioraffinerie Zwecke. Es erzeugt in der Regel erhebliche Mengen von Biomasse, enthält hohe Mengen an nicht-strukturellen Kohlenhydrate 6, und hat auch die seltene Fähigkeit, große Mengen von leicht extrahierbaren Nonfood-Öle (einschließlich langen Kette C 29-C 31 gesättigten Kohlenwasserstoffen und Triterpene), die für Biodiesel geeignet sind akkumulieren Produktion. Die Tabakbaum ist darüber hinaus offen für die genetische Verbesserung, hat eine hohe Keimfähigkeit und wächst glücklich auf semi-ariden Böden nicht für die Lebensmittelproduktion verwendet. Es scheint daher, dass sowohl Pappel und Tabak Baum intrinsische Potential für multipWECK Kulturen, dh als neue, hochwertige Rohstoffe für eine integrative bio-basierten Industrie. In diesem Beitrag konzentrieren wir uns auf vielfältige Reihe von Ansätzen zu erkennen, wie Tabak Baum Einlagen langkettigen Kohlenwasserstoffen. In einem Versuch, die zugrunde liegenden molekularen Maschinen für die Produktion und Sekretion von den gesättigten langkettigen Kohlenwasserstoffen auf die Tabakblätter verantwortlich sind, wenden wir moderne &quot;Omics&quot;-Technologien basiert. Dies beinhaltet RNA seq einer Entwicklungs Blatt-Serie (zehn Stufen) und Multiplattform-Metabolite Profiling-Ansätze unter Verwendung LC und GC-MS (für polare und unpolare Metaboliten und Lipidomics). Diese Daten werden verwendet, um für die Genexpression, die mit korreliert oder vorausgeht, dem Beginn der Biosynthese der oben genannten Moleküle abbauen werden. Gene und Signalwege, die vielversprechend aus diesen Bemühungen erscheint für Funktionstests in der Modellpflanze Arabidopsis verwendet werden und könnte letztlich zugänglich für biotechnologische Technik in tob seinacco Baum.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:579px;" width="578">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Name</td>
			<td style="width:124px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:144px;">Catalog number&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol reagent</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right" style="width:144px;">101986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TURBO Dnase</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938-90034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml and 2 ml safe-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160; 0030 120.086, 0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steel balls</td>
			<td>Geyer Berlin GmbH</td>
			<td>VA2mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mixer mill MM 300</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>YO-04182-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">5424</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcript and metabolite profiling for the evaluation of tobacco tree and poplar as feedstock for the bio-based industry

Die weltweite Nachfrage nach Lebensmitteln, Futtermitteln, Energie und Wasser stellt außergewöhnliche Herausforderungen für zukünftige Generationen. Es ist offensichtlich, dass stabile Plattformen für die Erforschung von erneuerbaren Ressourcen notwendig, um diese Herausforderungen zu meistern sind. Innerhalb der multinationalen Rahmen MultiBioPro entwickeln wir Bioraffinerie-Pipelines, um die Nutzung pflanzlicher Biomasse zu maximieren. Genauer gesagt, verwenden wir Pappelbaum und Tabak (Nicotiana glauca) als Zielkulturarten zur Verbesserung der Verzuckerung isoprenoiden, langkettigen Kohlenwasserstoff Inhalte, Faserqualität und Suberin und Lignin Inhalte. Die Ausgänge verwendet, um diese zu erhalten Methoden gehören GC-MS, LC-MS-und RNA-Sequenzierungsplattformen. Der Metabolit Pipelines gut etabliert Werkzeuge, um diese Arten von Daten zu erzeugen, sondern auch über die Grenzen daß nur gut charakterisiert Metaboliten verwendet werden. Die tiefe Sequenzierung wird uns erlauben, alle während der Entwicklungsstadien der Tabak Baum Blatt vorliegenden Abschriften, aber h sind, um zurück zu der Sequenz von Nicotiana tabacum abgebildet werden. Mit diesen Set-ups, zielen wir auf ein grundlegendes Verständnis für die zugrunde liegenden Prozesse und auf die Schaffung einer industriellen Rahmen, um die Ergebnisse zu nutzen. In einer langfristigen Perspektive, glauben wir, dass die Daten hier erzeugt wird, Mittel für eine nachhaltige Bioraffinerie-Verfahren unter Verwendung von Pappel-und Tabak Baum als Rohstoff zu liefern. Um das Basisniveau von Metaboliten in den Proben heute wurden analysiert und die verwendeten Protokolle sind in diesem Artikel bereitgestellt.

Das HPLC-Profil in Fig. 1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis der Isoprenoid-Analyse von N. glauca Blattextrakten. Die verschiedenen Isoprenoiden von C40 und oben wurden mit einem Fotodiodenarray (PDA)-Detektor nachgewiesen. Die Spitzen wurden basierend auf Co-Chromatographie und der spektralen Vergleich zwischen authentischen Standards, Beta-Carotin (Provitamin A), Phytoen, Lycopin, Lutein und Zeaxanthin kommentiert. Die beiden MS-Chromatogramme in Abbildung 2 zeigen das Ergebnis der Analyse von primären Metaboliten N. glauca Blatt-und Stammmaterial auf. Das MS-Spektrum eines Peaks, der Serin (durch einen Pfeil angedeutet) wird auch als ein Beispiel gegeben. Fig. 3 zeigt die Bioanalyzer zur Bestimmung der Qualität der RNA und ein repräsentatives Ausgangssignal von der Vorrichtung verwendet. Die beiden Haupt-Peaks im Chromatogramm entspricht, 18 S und 25 S ribosomalen RNA, was intakte RNA in der Probe. Weitere Gipfel der fragmentierten Rippeosomal RNA würde im Falle der teilweise oder stark degradierten RNA angezeigt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51393/51393fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51393/51393fig1.jpg" /> Abbildung 1. HPLC-Profil zeigen, in Blattextrakten von N. vorhanden Isoprenoiden glauca. meisten Isoprenoide von C40 und darüber nicht zugänglich sind GC-MS-Analyse. Wir haben daher HPLC-Trennungen mit Photodiodenarray-Detektion. Ein typisches Chromatogramm bei 450 nm aufgezeichnet gezeigt. Die Carotinoid-Pigmente sind typisch für photosynthetischen Geweben mit Lutein wiegt. Ebenfalls anwesend ist Zeaxanthin, die nur selten in Blattgewebe zu finden ist, es sei denn unter Hochlichtstress gelegt. Die Ebenen von Zeaxanthin machen es eine gute Quelle dieser hochwertigen Verbindung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51192/51192fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere v ansehen</a>ersion dieser Figur. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51393/51393fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51393/51393fig2.jpg" /> 2. MS-Chromatogramm und Bandbreite der N. glauca Gewebeextrakten. Insgesamt Ionen-MS-Chromatogramm (TIC) von Blatt und Stamm-Extrakte mit GC-MS gemessen wird vorgestellt (70 bis 600 m / z). GC-MS-Analyse wurde wie zuvor in 15 beschrieben durchgeführt. Erkannt Peaks wurden mit Hilfe der Massenspektrenbibliothek Tags annotiert. MS-Spektrum von Serin (2TMS) als ein Beispiel gezeigt. MS-Chromatogramm: X-Achse und Y-Achse angeben Retentionszeit (min) und die Intensität (Fülle) des Signals, MS-Spektrum: X-Achse und Y-Achse zeigen die M / Z-Verhältnisse und die Intensität (Fülle) des Signals. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51393/51393fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um zu vergrößern</a>Bild. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51393/51393fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51393/51393fig3.jpg" /> Abbildung 3. Bioanalyzer Messung von RNA zur RNA-Seq von N. vorbereitet glauca Blattmaterial. Um hochreine RNA zur RNA-Seq wir extrahierte RNA mit Trizol-Reagenz und anschließend gereinigt die RNA mit den Spalten aus dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) benötigt zu erhalten. Wir bestimmten die RNA-Qualität mit dem Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Deutschland) auf der linken Seite angezeigt. Ein Beispiel eines Bioanalyzer Ausgang rechts angegeben. Die beiden Hauptgipfel in der Probe vertreten 18 S und 25 S ribosomalen RNA. Unsere Probe zeigte einen RNA Integrity Number (RIN) von 9,2, was deutlich über dem geforderten Wert von 8 ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51393/51393fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken sie</a>E für eine größere Ansicht.

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Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

Pflanzenbiomasse bietet eine erneuerbare Ressource für mehrere Produkte, einschließlich Kraftstoff, Futtermittel-, Lebensmittel-und einer Vielzahl von Materialien. In diesem Papier untersuchen wir die Eigenschaften von Tabakbaum (Nicotiana glauca) und Pappel als geeignete Quellen für eine Bioraffinerie-Pipeline.

Transcript und Metabolite Profiling für die Beurteilung von Tabakbaum und Pappel als Rohstoff für die Bio-basierte Industrie

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

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Research

JoVE Journal

Environment

15.1K Aufrufe.  Max Planck Institute for Molecular Plant Physiology.  Pflanzenbiomasse bietet eine erneuerbare Ressource für mehrere Produkte, einschließlich Kraftstoff, Futtermittel-, Lebensmittel-und einer Vielzahl von Materialien. In diesem Papier untersuchen wir die Eigenschaften von Tabakbaum (Nicotiana glauca) und Pappel als geeignete Quellen für eine Bioraffinerie-Pipeline. 

Serie: Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

Technique for Studying Arthropod and Microbial Communities within Tree Tissues

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms. Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear young, feed, or hide from natural enemies or harsh environmental conditions outside of the tree. Organisms that persist within the phloem habitat are difficult to observe given their location under bark. We provide a technique to preserve intact phloem and prepare it for experimentation with invertebrates and microorganisms. The apparatus is called a &#8216;phloem sandwich&#8217; and allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms. This technique has resulted in a better understanding of the feeding behaviors, life-history traits, reproduction, development, and interactions of organisms within tree phloem. The strengths of this technique include the use of inexpensive materials, variability in sandwich size, flexibility to re-open the sandwich or introduce multiple organisms through drilled holes, and the preservation and maintenance of phloem integrity. The phloem sandwich is an excellent educational tool for scientific discovery in both K-12 science courses and university research laboratories.

We provide a technique to preserve intact tree phloem and prepare it for observation. We create an apparatus called a phloem sandwich that allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms that inhabit phloem tissues.

Technik zur Untersuchung Gliederfüßer und Mikrobielle Gemeinschaften im Baum Tissues

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms.  Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear ...

Forschung

Umwelt

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

Expression von rekombinanten Cellulase aus Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In Tabakpflanzen

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Evaluation of Integrated Anaerobic Digestion and Hydrothermal Carbonization for Bioenergy Production

Lignocellulosic biomass is one of the most abundant yet underutilized renewable energy resources. Both anaerobic digestion (AD) and hydrothermal carbonization (HTC) are promising technologies for bioenergy production from biomass in terms of biogas and HTC biochar, respectively. In this study, the combination of AD and HTC is proposed to increase overall bioenergy production. Wheat straw was anaerobically digested in a novel upflow anaerobic solid state reactor (UASS) in both mesophilic (37 &#176;C) and thermophilic (55 &#176;C) conditions. Wet digested from thermophilic AD was hydrothermally carbonized at 230 &#176;C for 6 hr for HTC biochar production. At thermophilic temperature, the UASS system yields an average of 165 LCH4/kgVS&#160;(VS: volatile solids) and 121 L CH4/kgVS&#160;at mesophilic AD over the continuous operation of 200 days. Meanwhile, 43.4 g of HTC biochar with 29.6 MJ/kgdry_biochar was obtained from HTC of 1 kg digestate (dry basis) from mesophilic AD. The combination of AD and HTC, in this particular set of experiment yield 13.2 MJ of energy per 1 kg of dry wheat straw, which is at least 20% higher than HTC alone and 60.2% higher than AD only.

A novel Upflow Anaerobic Solid State (UASS) reactor was used for biogas production from fibrous feedstock. Digestate from UASS reactor was hydrothermally carbonized into HTC biochar in a pressurized batch reactor. The integration of the two bioenergy concepts was applied in this study to increase overall bioenergy production.

Bewertung des integrierten Biogas-und Hydrothermale Karbonisierung für die Bioenergieproduktion

Lignocellulosic biomass is one of the most abundant yet underutilized renewable energy resources. Both anaerobic digestion (AD) and hydrothermal ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of scientific publications address microplastic pollution of the sea surface. The protocol below describes the methodology for sampling, sample preparation, separation and chemical identification of microplastic particles. A manta net fixed on an &#187;A frame&#171; attached to the side of the vessel was used for sampling. Microplastic particles caught in the cod end of the net were separated from samples by visual identification and use of stereomicroscopes. Particles were analyzed for their size using an image analysis program and for their chemical structure using ATR-FTIR and micro FTIR spectroscopy. The described protocol is in line with recommendations for microplastics monitoring published by the Marine Strategy Framework Directive (MSFD) Technical Subgroup on Marine Litter. This written protocol with video guide will support the work of researchers that deal with microplastics monitoring all over the world.

The protocol below describes the methodology for: microplastics sampling on the sea surface, separation of microplastic and chemical identification of particles. This protocol is in line with the recommendations for microplastics monitoring published by the MSFD Technical Subgroup on Marine Litter.

Protokoll für die Mikroplastik Probenahme auf der Meeresoberfläche und Probenanalyse

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment during manufacturing and transport. Because of their environmental persistence, they are widely distributed in the oceans and on beaches all over the world. They can act as a vector of potentially toxic organic compounds (e.g., polychlorinated biphenyls) and might consequently negatively affect marine organisms. Their possible impacts along the food chain are not yet well understood. In order to assess the hazards associated with the occurrence of plastic pellets in the marine environment, it is necessary to develop methodologies that allow for rapid determination of associated organic contaminant levels. The present protocol describes the different steps required for sampling resin pellets, analyzing adsorbed organochlorine pesticides (OCPs) and identifying the plastic type. The focus is on the extraction of OCPs from plastic pellets by means of a pressurized fluid extractor (PFE) and on the polymer chemical analysis applying Fourier Transform-InfraRed (FT-IR) spectroscopy. The developed methodology focuses on 11 OCPs and related compounds, including dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) and its two main metabolites, lindane and two production isomers, as well as the two biologically active isomers of technical endosulfan. This protocol constitutes a simple and rapid alternative to existing methodology for evaluating the concentration of organic contaminants adsorbed on plastic pieces.

Microplastics act as vector of potentially toxic organic contaminants with unpredictable effects. This protocol describes an alternative methodology for assessing the levels of organochlorine pesticides adsorbed on plastic pellets and identifying the polymer chemical structure. The focus is on pressurized fluid extraction and attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy.

Extraktion von Organochlor-Pestiziden aus Kunststoff-Pellets und Kunststoff-Typ-Analyse

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, and the majority of extant heteropterans retain this trophic strategy. Some heteropterans have transitioned to feeding on vertebrate blood (such as the kissing bugs, Triatominae; and bed bugs, Cimicidae) while others have reverted to feeding on plants (most Pentatomomorpha). However, with the exception of saliva used by kissing bugs to facilitate blood-feeding, little is known about heteropteran venoms compared to the venoms of spiders, scorpions and snakes.
One obstacle to the characterization of heteropteran venom toxins is the structure and function of the venom/labial glands, which are both morphologically complex and perform multiple biological roles (defense, prey capture, and extra-oral digestion). In this article, we describe three methods we have successfully used to collect heteropteran venoms. First, we present electrostimulation as a convenient way to collect venom that is often lethal when injected into prey animals, and which obviates contamination by glandular tissue. Second, we show that gentle harassment of animals is sufficient to produce venom extrusion from the proboscis and/or venom spitting in some groups of heteropterans. Third, we describe methods to harvest venom toxins by dissection of anaesthetized animals to obtain the venom glands. This method is complementary to other methods, as it may allow harvesting of toxins from taxa in which electrostimulation and harassment are ineffective. These protocols will enable researchers to harvest toxins from heteropteran insects for structure-function characterization and possible applications in medicine and agriculture.

Although many insects in the suborder Heteroptera (Insecta: Hemiptera) are venomous, their venom composition and the functions of their venom toxins are mostly unknown. This protocol describes methods to harvest heteropteran venoms for further characterization, using electrostimulation, harassment, and gland dissection.

Ernte Venom Giftstoffe aus Assassin Bugs und andere Heteropteran Insekten

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on collecting various sized particulate matter (PM) retained on leaf surfaces. We further characterized the retention efficiency of leaves to various sized PM, which will help to assess the abilities of urban trees to remove PM from ambient air quantitatively. 
Taking three broadleaf tree species (Ginkgo biloba, Sophora japonica, and Salix babylonica) and two needleleaf tree species (Pinus tabuliformis and Sabina chinensis) as the research objects, leaf samples were collected 4 days (short PM retention period) and 14 days (long PM retention period) after the latest rainfall. PM retained on the leaf surfaces was collected by means of WC, BC, and UC in sequence. Then, retention efficiencies of leaves (AEleaf) to three types of the various sized PM, including easily removable PM (ERP), difficult-to-remove PM (DRP), and totally removable PM (TRP), were calculated. Only around 23%-45% of the total PM retained on leaves could be cleaned off and collected by WC. When the leaves were cleaned through WC+BC, the underestimation of the PM retention capacity of different tree species was in the range of 29%-46% for various sized PM. Almost all PM retained on leaves could be removed if UC was supplemented to WC+BC. 
In conclusion, if the UC was complemented after the conventional cleaning methods, more PM on leaf surfaces could be eluted and collected. The procedure developed in this study can be used for assessing the PM removal abilities of different tree species.

The ultrasonic cleaning method was applied to elute the particulate matter (PM) retained on leaf surfaces after PM was eluted by the conventional cleaning methods (water cleaning only or water cleaning plus brush cleaning). The methodology can help to improve the estimation accuracy for PM retention capacity of leaves.

Beurteilung der Feinstaub entfernen Fähigkeiten des Baumes Blätter

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Ein High-Throughput-Assay für die Vorhersage der chemischen Toxizität durch automatisierte phänotypischen Profilierung von Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

The symplastic tracer 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) has been widely applied in living plants to demonstrate the intercellular connection, phloem transport and vascular patterning. This protocol shows bottom-to-top carboxyfluorescein (CF) movement in the Arabidopsis by using the root-cutting and the hypocotyl-pinching procedure respectively. These two different procedures result in different efficiencies of CF movement: about 91% appearance of CF in the shoots with the hypocotyl-pinching procedure, whereas only about 70% appearance of CF with the root-cutting procedure. The simple change of loading sites, resulting in significant changes in the mobile efficiency of this symplastic dye, suggests CF movement might be subject to the symplastic regulation, most probably by the root-hypocotyl junction.

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

The goal of this protocol is to show how to load the CFDA into different sites of the bottom parts of Arabidopsis. We then present the resulting distribution pattern of CF in the shoots.

The symplastic tracer 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) has been widely applied in living plants to demonstrate the intercellular connection, ...