אנו מודים לד&quot;ר ס &#39;סטלה והלן Vuong על תרומתו לפרוטוקול ההדמיה סידן. אנו מודים לגיליונות ד&quot;ר ק לצילום סצנות הראיון. אנו מודים לד&quot;ר ארלין היראנו על הערותיה על כתב היד. פרויקט מחקר ופיתוח זה נערך על ידי החוקרים בבית ספר דייוויד גפן לרפואה באוניברסיטת קליפורניה ומתאפשר על ידי הסכם חוזה שהוענק ומנוהל על ידי פיקוד המחקר ואמצעי רפואה של צבא ארה&quot;ב (USAMRMC) וטכנולוגית טלרפואה והמתקדמת מרכז מחקר (TATRC), בפורט דטריק, MD תחת מספר חוזה: W81XWH-10-2-0077. תמיכה במחקרים אלה גם באו מEY04067 NIH וסקירת VA הצטיינות (NB). NCB הוא VA קריירה מדען מחקר.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות לרווחתם של חיות ניסוי שהונפקו על ידי מדיניות שירות בריאות הציבור בארה&quot;ב על טיפול באדם ושימוש בחי מעבדה ואוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג&#39;לס (UCLA) ועדת מחקר בבעלי חיים. חולדות ספראג-Dawley בוגרת זכר ונקבה (נהר המעבדה צ&#39;ארלס, Wilmington, MA) בין גיל 3-5 שבועות היו בשימוש. .1 בעלי חיים ורקמות הכנה לWholemount רשתית ואימונוהיסטוכימיה פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החומרים הבאים וכלים: מיקרוסקופ לנתח, 2 מלקחיים עם טיפים יפים מאוד, מספריים, נייר סינון תאית, פיפטה פלסטיק ושקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברוש בחדר סגור על ידי עמוק הרדמת בעלי החיים עם isoflurane 1-3% אחריו עריפת ראש עם גיליוטינה. הסר את העיניים עם זוג מספריים איריס ומניחים בצלחת פטרי המכילה פתרון תאי. מצב שינה, איימסdium או פתרונות פיסיולוגיים מומלצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [צעד אופציונאלי אם למלא את המשבצות של RGCs עם Fluo-4 היא רצויה]. לבצע את תיוג Fluo-4, כמתואר ב2.3-2.4 צעדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח (עוצמת אור: 1.6 x 10 8 פוטונים / 2 מ&quot;מ ⋅sec), להסיר את הקרנית על ידי חיתוך החלק הקדמי של העין הכדור. הסר את העדשה וזגוגית מפני שטח הרשתית הפנימי עם מלקחיים. כדי להסיר את הזגוגית, לייצב את גלגל העין על ידי לחיצה על לובן העין בחוזקה עם מלקחיים אחד. לקלף בעדינות את בסיס הזגוגית לכיוון מרכז הרשתית עם המלקחיים האחרים. ההכנה בשלב זה נקראת עיינית, המשמשת לcryosections. ניתן למצוא פרטים נוספים על cryosections באזכור 14,15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרשתית מעיינית. ואז, להפוך את ארבעה חתכים, כדי לאפשר את הרשתית לשכבה. בעדינות לעלות הרשתית בשקופית מיקרוסקופ עם השכבה עד קולטי האור. הוסף טיפה אחת של פתרון לרשתית ולשים ceנייר סינון llulose על הרשתית. ברגע שהרשתית מתחברת לנייר הסינון, למקם את הרשתית חזרה בפתרון. במידת הצורך, לשטח את הרשתית עם מברשת או מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את רשתיות wholemounted לPFA 4% עבור 10-15 דק &#39;לקיבעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את רשתיות wholemounted שלוש פעמים ל30 דקות ב0.1 M חיץ פוספט (PB), pH 7.4. לחסום את הרשתיות עם 5% עזים בסרום נורמלי או חמור בדם ב0.1 PB מכיל 0.3% Triton-X 100 ו0.1% NaN 3 על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. אנו ממליצים נפח סופי של μl 500 לכל הצעדים כדי להציל את הפתרונות ונוגדנים חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, דגירה wholemounts רשתיות עם 5-7 ימי הנוגדן הראשוניים ב 4 ° C.. דילולים אופטימליים צריכים להיקבע על ידי המשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את רשתיות 3 x 30 דקות בPB 0.1 M ודגירת הלילה בשעה 4 ° C בנוגדן fluorophore מצומדות- המקביל המשני שמופנה נגד המינים של הנוגדן הראשוני (ריכוז 1: 1,000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלוש שטיפות סופיות של 30 דקות כל אחד עם PB, הר הרשתיות בהרכבה בינונית. חותם את coverslips עם לק לאחסון ממושך. דגימות חנות ב 4 ° C ולהגן מפני אור. </li></ol> .2 תיוג של תאים הגנגליון והאקסונים בעכברוש Wholemount רשתיות עם סידן המחוון דיי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1,000 מ&quot;ל של Ringer של יונקים המכילים (במ&quot;מ) 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl 2, 1.25 לאא 2 PO 4, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, ו10 גלוקוז מבעבע עם 95% O CO 2/5% &#173; 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את הנתיחה, כמתואר ב1.2-1.4 הצעדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטעון תאי הגנגליון ברשתית (RGCs) והאקסונים שלהם עם צבע מחוון סידן, להזריק 0.5 μl של מלח Fluo-4 pentapotassium (40 מניית מ&quot;מ בH 2 O) לגדם עצב הראייה כ מ&quot;מ אחורי 1 לגלגל העין באמצעות מזרק . כדי למדוד עליות דינמיות בתא גנגליון [Ca 2 + </sup&gt;] אני מחוון בזיקה גבוהה, כגון Fluo-4 עם ד K של 345 ננומטר, הוא אופטימלי. Fluo-4 מציע יתרון נוסף שיש לו יעילות קוונטית גבוהה מאוד וכתוצאה מכך גידול פליטה של&gt; 100 לקפל כאשר חייב סידן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את עיינית בCO 2/5% מבעבע עם 95% O רינגר יונקים &#173; 2 לשעה 1 בטמפרטורת חדר בחושך. </li></ol> פרוטוקול הדמיה 3 סידן לתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העין, העדשה וזגוגית כמתואר בשלבי 1.1-1.4. לבודד את הרשתית מעיינית ומתחלקים לרביעים. צד הר תא גנגליון רבע אחד על שקופית זכוכית ולהשתמש ברשת פרוסת נבל כדי לייצב אותו. שמור את החלקים האחרים כהים מותאמים בCO 2/5% מבעבע עם 95% O רינגר יונקים &#173; 2 על קרח לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Superfuse חדר ההקלטה עם הפתרון של רינגר יונקים ולשמור על הפתרון המבעבע ברציפות עם 95% O 2/5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת הרקמה תחת המיקרוסקופ. ניסויי התנהגות בטמפרטורת חדר (~ 23 מעלות צלזיוס) או להשיג טמפרטורות פיסיולוגיות על ידי התחממות השלב, חימום אמבט המים מתחת לדגימה או החלת אוויר חם אל פני השטח של הדגימה. הערה: חשוב לציין כי רבים תפקודים תאיים מוסדרים על ידי טמפרטורה, אשר ממלאת תפקיד מפתח בשמירה על הומאוסטזיס תאיים 16. עם זאת, כניסתה של אמצעי ההתחממות עשויה להגדיל את שיעור photobleaching, אידוי של הסחיפה בינונית ומיקוד הנגרמת על ידי התפשטות תרמית 17. שימוש בטמפרטורת חדר יורד מידור תאיים של Fluo-4 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שליטה של שתי K + פולסים גבוהים לזווג בהעדר תרופות. Depolarize האקסונים RGCs וRGC ידי העלאה [K +] o מ3 מ&quot;מ ל60 מ&quot;מ ל33 שניות במהלך כל דופק כדי להפעילVGCCs עם מערכת superfusion מונעת שמונה הכבידה ערוץ. להפחית Na + על ידי 57 מ&quot;מ לשמור isosmolarity בפתרון K + הגבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את התרומה של VGCCs שונה לאות סידן עם השימוש בחוסמי תעלות Ca כלליות או ספציפיים. לדוגמא, הירידה באות סידן הבא הממשל של קובלט חוסם תעלות הסיד שאינו ספציפי, ובלבד מידה חצי כמותית של התרומה של VGCCs לגבוה K אות סידן -evoked +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש ערכי עוצמת הקרינה על ידי הצבת אזור של עניין (ROI) ברחבי RGCs של עניין (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את השינוי בעוצמת הקרינה המיוצרת על ידי הגבוה K השני + שיא לשינוי המיוצר על ידי הגבוהה K + השיא הראשון. ואז, לבדיקה של חוסמי תעלות סידן ספציפיים, תחול תרופות רק בדופק K + הגבוה השני של זוג ולנרמל את השיא הזה נגדערך השיא הראשון. כדי למדוד את ההשפעה של התרופה על הגבוהה K + השיא, לחלק את המשרעת של K + השיא השני על ידי זה של הראשונה. ניתוח צריכה להתבצע על ערכים אלה בביחס לבקרות ההתאמה שלהם נגזרות מגבוה K לזווג + פסגות נמדדו בהעדר התרופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות ב5 מרווחי שניות. כדי להימנע מצילום הלבנה, לשמור על עירור הלייזר נמוך ככל האפשר. לספק עירור על ידי קו 488 ננומטר של לייזר הארגון, תוך הצינור מכפיל אוסף את פליטת הניאון דרך מסנן LP 505 ננומטר. </li></ol>

<ol>
	<li>Guenther, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+calcium+currents+in+retinal+ganglion+cells+from+postnatal+rat.">Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat.</a> Brain Res. 633, 223-235 (1994).</li><li>Farrell, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+voltage-gated+ion+channels+in+rat+retinal+ganglion+cells+mediated+by+somatostatin+receptor+subtype+4.">Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4.</a> J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).</li><li>Caterall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+regulation+of+voltage-gated+Ca2++channels.">Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).</li><li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium--a+life+and+death+signal.">Calcium--a life and death signal.</a> Nature. 395, 645-648 (1998).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+microdomains+Organization+and+function.">Calcium microdomains Organization and function.</a> Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).</li><li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+diversity+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits.">Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li><li>Rottman, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribonuclease+protection+assay+a+powerful+tool+for+the+veterinary+pathologist.">The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist.</a> Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).</li><li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina.">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li><li>Segev, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+spikes+from+a+large+fraction+of+the+ganglion+cells+in+a+retinal+patch.">Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch.</a> Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).</li><li>Jeon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina.">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).</li><li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+and+extrasynaptic+factors+governing+glutamatergic+retinal+waves.">Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves.</a> Neuron. 62, 230-241 (2009).</li><li>Daniels, B. A., Baldridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=d-Serine+enhancement+of+NMDA+receptor-mediated+calcium+increases+in+rat+retinal+ganglion+cells.">d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells.</a> J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).</li><li>Weitz, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+response+of+the+retina+to+electrical+stimulation+with+genetically+encoded+calcium+indicators.">Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators.</a> J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).</li><li>P&#233;rez de Sevilla M&#252;ller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+voltage-gated+calcium+channel+&#945;(2)&#948;(4)+subunits+in+the+mouse+and+rat+retina.">Expression of voltage-gated calcium channel &#945;(2)&#948;(4) subunits in the mouse and rat retina.</a> J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).</li><li>Hirano, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP25+expression+in+mammalian+retinal+horizontal+cells.">SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells.</a> J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).</li><li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+dynamics,+homeostasis+and+remodeling.">Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).</li><li>Dailey, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+live+cells+and+tissue+slices+in+the+imaging+setup.">Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup.</a> Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).</li><li>Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+intracellular+calcium+ion+dynamics+in+hair+cell+populations+with+Fluo-4.">Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4.</a> AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).</li><li>Kwong, J. M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+protein+with+multiple+splicing+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells.">RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).</li><li>P&#233;rez deSevilla M&#252;ller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Displaced+amacrine+cells+of+the+mouse+retina.">Displaced amacrine cells of the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).</li><li>P&#233;rez de Sevilla M&#252;ller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracer+coupling+of+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+to+amacrine+cells+in+the+mouse+retina.">Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).</li><li>Raymond, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+fluorescent+protein+expression+in+ganglion+and+amacrine+cells+in+a+thy1-CFP+transgenic+mouse+retina.">Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina.</a> Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).</li><li>Raymond, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Thy1-CFP+DBA/2J+mouse+line+with+cyan+fluorescent+protein+expression+in+retinal+ganglion+cells.">A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells.</a> Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).</li><li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeation+and+block+of+N-methyl-D-aspartic+acid+receptor+channels+by+divalent+cations+in+mouse+cultured+central+neurones.">Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones.</a> J Physiol. 394, 501-527 (1987).</li><li>Ascher, P., Nowak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+divalent+cations+in+the+N-methyl-D-aspartate+responses+of+mouse+central+neurons+in+culture.">The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture.</a> J Physiol. 399, 247-266 (1988).</li><li>Aizenman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+mediated+by+excitatory+amino+acid+receptors+in+solitary+retinal+ganglion+cells+from+rat.">Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat.</a> J Physiol. 396, 75-91 (1988).</li><li>Taschenberger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+current+kinetics+in+a+solely+AMPA-receptor-operated+glutamatergic+synapse+formed+by+rat+retinal+ganglion+neurons.">Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons.</a> J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).</li><li>Chen, S., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+released+glutamate+activates+extrasynaptic+NMDA+receptors+on+cells+in+the+ganglion+cell+layer+of+rat+retina.">Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina.</a> J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).</li><li>Jakobs, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+mRNA+for+glutamate+receptor+subunits+distinguishes+the+major+classes+of+retinal+neurons,+but+is+less+specific+for+individual+cell+types.">Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types.</a> Mol Vis. 13, 933-948 (2007).</li><li>Margolis, D. J., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+mechanisms+generate+maintained+activity+in+ON+and+OFF+retinal+ganglion+cells.">Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells.</a> J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).</li><li>Margolis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+signaling+in+ON+and+OFF+mouse+retinal+ganglion+cells.">Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).</li><li>Baldridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recordings+of+the+effects+of+cholinergic+ligands+on+neurons+in+the+ganglion+cell+layer+of+mammalian+retina.">Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina.</a> J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).</li><li>Hartwick, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+glutamate+clearance+mechanisms+in+a+chronic+rat+glaucoma+model+using+retinal+ganglion+cell+calcium+imaging.">Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging.</a> J Neurochem. 94, 794-807 (2005).</li><li>Badea, T. C., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+neuronal+morphologies+in+the+mouse+retina+visualized+by+using+a+genetically+directed+reporter.">Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter.</a> J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).</li><li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+activity-mediated+refinement+of+axonal+projections+from+a+mosaic+of+genetically+identified+retinal+ganglion+cells.">Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells.</a> Neuron. 59, 425-438 (2008).</li><li>Kim, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+a+retinal+cell+type+that+responds+to+upward+motion.">Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion.</a> Nature. 452, 478-482 (2008).</li><li>Munch, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+sensitivity+in+the+retina+processed+by+a+multifunctional+neural+circuit.">Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit.</a> Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li></ol>

אי לנו גילויים.

במאמר זה, שתארנו שתי טכניקות שונות: 1) אימונוהיסטוכימיה להראות Fluo-4 לוקליזציה לתאי הגנגליון ברשתית wholemounts, ו2) סידן הדמיה כדי לנתח דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם. אימונוהיסטוכימיה באמצעות wholemounts נעשתה שימוש כדי ל?...

תאי הגנגליון ברשתית (RGCs) להביע VGCC L-, N-, P / Q- וT-הסוג, כפי שנקבע באמצעות מצור תרופתי של רכיבים של כל התא אלה Ca לתעל 1,2 הנוכחי. VGCC הם חלבוני Multimeric הטרנסממברני כי הם מעורבים בשחרור משדר, שעתוק הגנים, תקנת התא ו3,4,5 פלסטיות הסינפטית. VGCCs פונקציונלי מורכב של לפחות שלוש כיתות שונות של יחידות משנה: גדולות, הטרנסממברני α נקבובית 1 להרכיב יחידות משנה, אשר קובעת את מאפייני biophysical והתרופתיים של הערוץ, α בעיקר תאי עזר 2 δ יחידות משנה ותת יחידות β תאיות. שני מתחמי heteromeric הטופס האחרונים עם תת יחידות 1 α שונים ולשנות את קינטיקה gating וסחר של הערוצים לקרום הפלזמה 6. בעשורים האחרונים, בטכניקות רבות כבר מועסקות ללמוד expre חלבוןssion, כגון אימונוהיסטוכימיה, assay immunosorbent צמוד אנזים, ניתוח מערבי וcytometry זרימה. טכניקות אלו דורשות השימוש בנוגדנים ספציפיים לזיהוי של חלבון מסוים של ריבית ומספקות כלים רבי עוצמה ללוקליזציה וההפצה של חלבונים ספציפיים ברקמות שונות. טכניקות המשמשות לאיתור וללכמת רמות ביטוי mRNA של חלבון מסוים, כגון ניתוח כתם צפוני, RT-PCR, בזמן אמת RT-PCR, הכלאה באתר, microarrays cDNA וassay הגנת ribonuclease לספק גישה חלופית כאשר נוגדנים אינם בקלות רמות ביטוי זמינות או אם של חלבון מסוים הן נמוכות 7. עם זאת, מגבלה אחת לשימוש בטכניקות מולקולריות כזה הוא זיהוי הנדרש של רצף הגן. בתרגום חלבונים ברשתית, אימונוהיסטוכימיה יכולה להתבצע על רשתית wholemount. בשל הנגישות של RGCs, wholemountהכנה מספקת פלטפורמה מצוינת ללמוד הלוקליזציה של חלבונים ספציפיים לsomata RGC והאקסונים שלהם. בנוסף ללוקליזציה שלהם, ניתן להדגים כמה תכונות פונקציונליות של VGCCs בRGCs באמצעות השימוש בטכניקות הדמיה סידן. אנו מתארים פרוטוקול הדמיה סידן לתייג RGCs סלקטיבי עם צבע מחוון סידן למדידת דינמיקת סידן תוך תאי. התרומה של VGCCs שונה לאות סידן בתאים סלולריים שונים יכולה להיות מבודדת עם השימוש בחוסמי תעלות תת ספציפי Ca. אולי אחד ההיבטים מועילים ביותר של טכניקת ההדמיה סידן שתוארה כאן היא היכולת להקליט בו זמנית ובאופן עצמאי מRGCs מרובה והאקסונים שלהם. למרות שרבי טכניקות פיסיולוגיות, כגון הקלטת מהדק תא כל תיקון, לספק הקלטות גבוהות זמניות רזולוציה של זרמי קרום, סומטי או מקור axonal של thesזרמי דואר נרשמו לא יכולים להיות מופלים ולהקלטות יכולות להתבצע רק מתא עצב בודד בכל פעם. מערכי Multielectrode (MEAs) מסוגלים בו זמנית הקלטת קוצים מהתאים רבים, אבל אינו יכולים לזהות ולא להפלות את ההפעלה של, למשל, תת שונה של תעלות סידן. MEAs מעדיף להקליט מהתאים הנמצאים בסמיכות לאלקטרודה נתנה 8 ושיא מהתאים שיוצרים קוצים גדולים 9. שיטות הדמיה אופטיות לספק אסטרטגיה חלופית כדי לאפשר הקלטות בו זמנית ובלתי תלויות של אוכלוסיות שלמות של תאים שיכולים להיות משולבת עם המידע שהתקבל מmicroelectrode התא ותא והקלטת מהדק תיקון והקלטת MEA. למרות שטכניקות ההדמיה סידן המתוארות כאן הועסקו כדי ללמוד את דינמיקת סידן של RGCs, מהדק התיקון וMEAs יכולים גם לשמש במקביל על מנת להבהיר עוד יותר את הזרמים היוניים ומאפייני spiking של RGCs. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; מאחר ותאי amacrine עקורים מרכיבים כ 60% מהאוכלוסייה העצבית בשכבת תא גנגליון בעכבר רשתית 10, המטרה שלנו הייתה להשתמש בטכניקת העמסה שאופן סלקטיבי תוויות RGCs עם צבע מחוון סידן סינטטי ב הכנת wholemount. למרות צבעי מחוון סידן סינטטיים לספק פלטפורמה מצוינת ללימוד דינמיקת סידן תוך תאי, השימוש הנרחב שלה התעכב בשל חוסר היכולת לטעון ביעילות אוכלוסיות ספציפיות של תאי עצב בתוך רשת נתון. רבים טכניקות כגון טעינה בתפזורת 11 ו8,12 electroporation בוצעו לטעון אוכלוסיות שלמות של תאים, לעומת זאת, טכניקות אלה אינן מפלות בין סוגי תאים מסוימים. מבחינה גנטית מקודד מדדי סידן לספק את היכולת לתייג באופן סלקטיבי אוכלוסיות ספציפיות של תאים, לעומת זאת, שיטות אלו דורשות הדור של בעלי חיים מהונדסים 13. הטכניקה שלנו מתארת ​​methoד לתייג RGCs סלקטיבי בהכנת wholemount באמצעות הזרקת גדם עצב ראייה של צבע מחוון סידן. יחדיו, הטכניקות המבניות ופיזיולוגיות שתוארו במאמר זה מספקות פלטפורמה לחקור את הלוקליזציה ותרומה של VGCCs לאות סידן בRGCs והאקסונים שלהם.

<table><tbody><tr><td>Straight scissors</td><td>WPI</td><td>14124-G</td><td>dissecting tools</td></tr><tr><td>Straight Forceps</td><td>WPI</td><td>501985</td><td>dissecting tools</td></tr><tr><td>curved iris scissors</td><td>WPI</td><td>504487</td><td>dissecting tools</td></tr><tr><td>Cellulose filter paper</td><td>Millipore</td><td>HABP04700</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate A</td><td>Invitrogen</td><td>&lt;a href=&quot;http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;amp;productID=A1247501&quot;&gt;A12475-01&lt;/a&gt;</td><td>Media</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.google.com/url?sa=t&amp;amp;rct=j&amp;amp;q=&amp;amp;esrc=s&amp;amp;source=web&amp;amp;cd=1&amp;amp;cad=rja&amp;amp;sqi=2&amp;amp;ved=0CC0QFjAA&amp;amp;url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx%3FcatID%3D279&amp;amp;ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw&amp;amp;usg=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA&amp;amp;sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg&amp;amp;bvm=bv.48705608,d.cGE&quot;&gt;Mounting Media for Fluorescence&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Fluo-4 pentapotassium</td><td>Invitrogen</td><td>F-14200</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Laboratories</td><td>05260-05</td><td>anesthesia</td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-178-277</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 5 Pascal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11034</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>ProSci, Poway, CA</td><td></td><td>A rabbit polyclonal antibody&amp;nbsp;was generated against the N-terminus of the RBPMS&amp;nbsp;polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).</td></tr></tbody></table>

immunohistochemical and calcium imaging methods in wholemount rat retina

במאמר זה אנו מתארים את הכלים, חומרים כימיים, וצעדים המעשיים הדרושים ל: 1) הכנה מוצלחת של רשתית wholemount אימונוהיסטוכימיה ו, 2) הדמיה סידן לחקר תעלות סידן מתח מגודרת (VGCC) בתיווך איתות סידן ברשתית תאי הגנגליון. שיטת ההדמיה סידן אנו מתארים בעיות עוקפים לגבי הטעינה הלא ספציפית של תאי amacrine עקורים בשכבת תא גנגליון.

Immunolabeling עם נוגדנים ספציפיים מספק פלטפורמה ללמוד הלוקליזציה של חלבונים מסוימים של עניין ברשתית וטכניקת ההדמיה סידן מאפשר המחקר של התרומה של VGCCs לדינמיקה סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם. על ידי שימוש בנוגדנים נגד RBPMS חלב?...

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina at JoVE.com

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

פרוטוקולי אימונוהיסטוכימיה משמשים ללמוד את הלוקליזציה של חלבון מסוים ברשתית. טכניקות הדמיה סידן מועסקות ללמוד דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם.

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

immunohistochemical-calcium-imaging-methods-wholemount-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.4K Views.  University of California, Los Angeles.  פרוטוקולי אימונוהיסטוכימיה משמשים ללמוד את הלוקליזציה של חלבון מסוים ברשתית. טכניקות הדמיה סידן מועסקות ללמוד דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם. 

Video: Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Bioengineering

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Biology

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

הדמיית סידן דו-פוטונית ורחבת שדה בקוליקולוס העליון

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

מחבר זרקור: חשיפת קידוד עצבי ומנגנונים של עיבוד חזותי בקוליקולוס העליון 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

הערכת פעילות הסידן בשכבת תאי גנגליון ברשתית

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the impaired light-sensing photoreceptor cells in the degenerated retina, aiming to partially restore vision by inducing visual percepts. One common avenue of investigation involves the design and production of implantable devices with a flexible physical structure, housing a high number of electrodes. This enables the efficient and precise generation of visual percepts. However, with each technological advancement, there arises a need for a reliable and manageable ex vivo method to verify the functionality of the device before progressing to in vivo experiments, where factors beyond the device's performance come into play. This article presents a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer (GCL) following electrical stimulation. Specifically, the following steps are outlined: (1) fluorescently labeling the rat retina using genetically encoded calcium indicators, (2) capturing the fluorescence signal using an inverted fluorescence microscope while applying distinct patterns of electrical stimulation, and (3) extracting and analyzing the calcium traces from individual cells within the GCL. By following this procedure, researchers can efficiently test new stimulation protocols prior to conducting in vivo experiments.

Author Spotlight: גישה חדשנית לגירוי חשמלי עצבי באמצעות הדמיית סידן 

Retinal prostheses have the ability to generate visual perceptions. To advance the development of new prostheses, ex vivo methods are needed to test devices before implantation. This article provides a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer when subjected to electrical stimulation.

הדמיית סידן ברשתית שטוחה עם גירוי חשמלי

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

ההדמיה Ca

ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

הדמיית סידן ברשתית שטוחה עם גירוי חשמלי