אנו מודים לד&quot;ר ס &#39;סטלה והלן Vuong על תרומתו לפרוטוקול ההדמיה סידן. אנו מודים לגיליונות ד&quot;ר ק לצילום סצנות הראיון. אנו מודים לד&quot;ר ארלין היראנו על הערותיה על כתב היד. פרויקט מחקר ופיתוח זה נערך על ידי החוקרים בבית ספר דייוויד גפן לרפואה באוניברסיטת קליפורניה ומתאפשר על ידי הסכם חוזה שהוענק ומנוהל על ידי פיקוד המחקר ואמצעי רפואה של צבא ארה&quot;ב (USAMRMC) וטכנולוגית טלרפואה והמתקדמת מרכז מחקר (TATRC), בפורט דטריק, MD תחת מספר חוזה: W81XWH-10-2-0077. תמיכה במחקרים אלה גם באו מEY04067 NIH וסקירת VA הצטיינות (NB). NCB הוא VA קריירה מדען מחקר.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות לרווחתם של חיות ניסוי שהונפקו על ידי מדיניות שירות בריאות הציבור בארה&quot;ב על טיפול באדם ושימוש בחי מעבדה ואוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג&#39;לס (UCLA) ועדת מחקר בבעלי חיים. חולדות ספראג-Dawley בוגרת זכר ונקבה (נהר המעבדה צ&#39;ארלס, Wilmington, MA) בין גיל 3-5 שבועות היו בשימוש. .1 בעלי חיים ורקמות הכנה לWholemount רשתית ואימונוהיסטוכימיה פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החומרים הבאים וכלים: מיקרוסקופ לנתח, 2 מלקחיים עם טיפים יפים מאוד, מספריים, נייר סינון תאית, פיפטה פלסטיק ושקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברוש בחדר סגור על ידי עמוק הרדמת בעלי החיים עם isoflurane 1-3% אחריו עריפת ראש עם גיליוטינה. הסר את העיניים עם זוג מספריים איריס ומניחים בצלחת פטרי המכילה פתרון תאי. מצב שינה, איימסdium או פתרונות פיסיולוגיים מומלצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [צעד אופציונאלי אם למלא את המשבצות של RGCs עם Fluo-4 היא רצויה]. לבצע את תיוג Fluo-4, כמתואר ב2.3-2.4 צעדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח (עוצמת אור: 1.6 x 10 8 פוטונים / 2 מ&quot;מ ⋅sec), להסיר את הקרנית על ידי חיתוך החלק הקדמי של העין הכדור. הסר את העדשה וזגוגית מפני שטח הרשתית הפנימי עם מלקחיים. כדי להסיר את הזגוגית, לייצב את גלגל העין על ידי לחיצה על לובן העין בחוזקה עם מלקחיים אחד. לקלף בעדינות את בסיס הזגוגית לכיוון מרכז הרשתית עם המלקחיים האחרים. ההכנה בשלב זה נקראת עיינית, המשמשת לcryosections. ניתן למצוא פרטים נוספים על cryosections באזכור 14,15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרשתית מעיינית. ואז, להפוך את ארבעה חתכים, כדי לאפשר את הרשתית לשכבה. בעדינות לעלות הרשתית בשקופית מיקרוסקופ עם השכבה עד קולטי האור. הוסף טיפה אחת של פתרון לרשתית ולשים ceנייר סינון llulose על הרשתית. ברגע שהרשתית מתחברת לנייר הסינון, למקם את הרשתית חזרה בפתרון. במידת הצורך, לשטח את הרשתית עם מברשת או מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את רשתיות wholemounted לPFA 4% עבור 10-15 דק &#39;לקיבעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את רשתיות wholemounted שלוש פעמים ל30 דקות ב0.1 M חיץ פוספט (PB), pH 7.4. לחסום את הרשתיות עם 5% עזים בסרום נורמלי או חמור בדם ב0.1 PB מכיל 0.3% Triton-X 100 ו0.1% NaN 3 על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. אנו ממליצים נפח סופי של μl 500 לכל הצעדים כדי להציל את הפתרונות ונוגדנים חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, דגירה wholemounts רשתיות עם 5-7 ימי הנוגדן הראשוניים ב 4 ° C.. דילולים אופטימליים צריכים להיקבע על ידי המשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את רשתיות 3 x 30 דקות בPB 0.1 M ודגירת הלילה בשעה 4 ° C בנוגדן fluorophore מצומדות- המקביל המשני שמופנה נגד המינים של הנוגדן הראשוני (ריכוז 1: 1,000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלוש שטיפות סופיות של 30 דקות כל אחד עם PB, הר הרשתיות בהרכבה בינונית. חותם את coverslips עם לק לאחסון ממושך. דגימות חנות ב 4 ° C ולהגן מפני אור. </li></ol> .2 תיוג של תאים הגנגליון והאקסונים בעכברוש Wholemount רשתיות עם סידן המחוון דיי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1,000 מ&quot;ל של Ringer של יונקים המכילים (במ&quot;מ) 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl 2, 1.25 לאא 2 PO 4, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, ו10 גלוקוז מבעבע עם 95% O CO 2/5% &#173; 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את הנתיחה, כמתואר ב1.2-1.4 הצעדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטעון תאי הגנגליון ברשתית (RGCs) והאקסונים שלהם עם צבע מחוון סידן, להזריק 0.5 μl של מלח Fluo-4 pentapotassium (40 מניית מ&quot;מ בH 2 O) לגדם עצב הראייה כ מ&quot;מ אחורי 1 לגלגל העין באמצעות מזרק . כדי למדוד עליות דינמיות בתא גנגליון [Ca 2 + </sup&gt;] אני מחוון בזיקה גבוהה, כגון Fluo-4 עם ד K של 345 ננומטר, הוא אופטימלי. Fluo-4 מציע יתרון נוסף שיש לו יעילות קוונטית גבוהה מאוד וכתוצאה מכך גידול פליטה של&gt; 100 לקפל כאשר חייב סידן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את עיינית בCO 2/5% מבעבע עם 95% O רינגר יונקים &#173; 2 לשעה 1 בטמפרטורת חדר בחושך. </li></ol> פרוטוקול הדמיה 3 סידן לתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העין, העדשה וזגוגית כמתואר בשלבי 1.1-1.4. לבודד את הרשתית מעיינית ומתחלקים לרביעים. צד הר תא גנגליון רבע אחד על שקופית זכוכית ולהשתמש ברשת פרוסת נבל כדי לייצב אותו. שמור את החלקים האחרים כהים מותאמים בCO 2/5% מבעבע עם 95% O רינגר יונקים &#173; 2 על קרח לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Superfuse חדר ההקלטה עם הפתרון של רינגר יונקים ולשמור על הפתרון המבעבע ברציפות עם 95% O 2/5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת הרקמה תחת המיקרוסקופ. ניסויי התנהגות בטמפרטורת חדר (~ 23 מעלות צלזיוס) או להשיג טמפרטורות פיסיולוגיות על ידי התחממות השלב, חימום אמבט המים מתחת לדגימה או החלת אוויר חם אל פני השטח של הדגימה. הערה: חשוב לציין כי רבים תפקודים תאיים מוסדרים על ידי טמפרטורה, אשר ממלאת תפקיד מפתח בשמירה על הומאוסטזיס תאיים 16. עם זאת, כניסתה של אמצעי ההתחממות עשויה להגדיל את שיעור photobleaching, אידוי של הסחיפה בינונית ומיקוד הנגרמת על ידי התפשטות תרמית 17. שימוש בטמפרטורת חדר יורד מידור תאיים של Fluo-4 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שליטה של שתי K + פולסים גבוהים לזווג בהעדר תרופות. Depolarize האקסונים RGCs וRGC ידי העלאה [K +] o מ3 מ&quot;מ ל60 מ&quot;מ ל33 שניות במהלך כל דופק כדי להפעילVGCCs עם מערכת superfusion מונעת שמונה הכבידה ערוץ. להפחית Na + על ידי 57 מ&quot;מ לשמור isosmolarity בפתרון K + הגבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את התרומה של VGCCs שונה לאות סידן עם השימוש בחוסמי תעלות Ca כלליות או ספציפיים. לדוגמא, הירידה באות סידן הבא הממשל של קובלט חוסם תעלות הסיד שאינו ספציפי, ובלבד מידה חצי כמותית של התרומה של VGCCs לגבוה K אות סידן -evoked +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש ערכי עוצמת הקרינה על ידי הצבת אזור של עניין (ROI) ברחבי RGCs של עניין (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את השינוי בעוצמת הקרינה המיוצרת על ידי הגבוה K השני + שיא לשינוי המיוצר על ידי הגבוהה K + השיא הראשון. ואז, לבדיקה של חוסמי תעלות סידן ספציפיים, תחול תרופות רק בדופק K + הגבוה השני של זוג ולנרמל את השיא הזה נגדערך השיא הראשון. כדי למדוד את ההשפעה של התרופה על הגבוהה K + השיא, לחלק את המשרעת של K + השיא השני על ידי זה של הראשונה. ניתוח צריכה להתבצע על ערכים אלה בביחס לבקרות ההתאמה שלהם נגזרות מגבוה K לזווג + פסגות נמדדו בהעדר התרופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות ב5 מרווחי שניות. כדי להימנע מצילום הלבנה, לשמור על עירור הלייזר נמוך ככל האפשר. לספק עירור על ידי קו 488 ננומטר של לייזר הארגון, תוך הצינור מכפיל אוסף את פליטת הניאון דרך מסנן LP 505 ננומטר. </li></ol>

<ol>
	<li>Guenther, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+calcium+currents+in+retinal+ganglion+cells+from+postnatal+rat.">Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat.</a> Brain Res. 633, 223-235 (1994).</li><li>Farrell, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+voltage-gated+ion+channels+in+rat+retinal+ganglion+cells+mediated+by+somatostatin+receptor+subtype+4.">Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4.</a> J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).</li><li>Caterall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+regulation+of+voltage-gated+Ca2++channels.">Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).</li><li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium--a+life+and+death+signal.">Calcium--a life and death signal.</a> Nature. 395, 645-648 (1998).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+microdomains+Organization+and+function.">Calcium microdomains Organization and function.</a> Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).</li><li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+diversity+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits.">Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li><li>Rottman, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribonuclease+protection+assay+a+powerful+tool+for+the+veterinary+pathologist.">The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist.</a> Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).</li><li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina.">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li><li>Segev, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+spikes+from+a+large+fraction+of+the+ganglion+cells+in+a+retinal+patch.">Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch.</a> Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).</li><li>Jeon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina.">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).</li><li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+and+extrasynaptic+factors+governing+glutamatergic+retinal+waves.">Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves.</a> Neuron. 62, 230-241 (2009).</li><li>Daniels, B. A., Baldridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=d-Serine+enhancement+of+NMDA+receptor-mediated+calcium+increases+in+rat+retinal+ganglion+cells.">d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells.</a> J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).</li><li>Weitz, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+response+of+the+retina+to+electrical+stimulation+with+genetically+encoded+calcium+indicators.">Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators.</a> J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).</li><li>P&#233;rez de Sevilla M&#252;ller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+voltage-gated+calcium+channel+&#945;(2)&#948;(4)+subunits+in+the+mouse+and+rat+retina.">Expression of voltage-gated calcium channel &#945;(2)&#948;(4) subunits in the mouse and rat retina.</a> J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).</li><li>Hirano, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP25+expression+in+mammalian+retinal+horizontal+cells.">SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells.</a> J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).</li><li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+dynamics,+homeostasis+and+remodeling.">Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).</li><li>Dailey, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+live+cells+and+tissue+slices+in+the+imaging+setup.">Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup.</a> Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).</li><li>Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+intracellular+calcium+ion+dynamics+in+hair+cell+populations+with+Fluo-4.">Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4.</a> AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).</li><li>Kwong, J. M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+protein+with+multiple+splicing+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells.">RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).</li><li>P&#233;rez deSevilla M&#252;ller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Displaced+amacrine+cells+of+the+mouse+retina.">Displaced amacrine cells of the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).</li><li>P&#233;rez de Sevilla M&#252;ller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracer+coupling+of+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+to+amacrine+cells+in+the+mouse+retina.">Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).</li><li>Raymond, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+fluorescent+protein+expression+in+ganglion+and+amacrine+cells+in+a+thy1-CFP+transgenic+mouse+retina.">Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina.</a> Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).</li><li>Raymond, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Thy1-CFP+DBA/2J+mouse+line+with+cyan+fluorescent+protein+expression+in+retinal+ganglion+cells.">A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells.</a> Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).</li><li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeation+and+block+of+N-methyl-D-aspartic+acid+receptor+channels+by+divalent+cations+in+mouse+cultured+central+neurones.">Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones.</a> J Physiol. 394, 501-527 (1987).</li><li>Ascher, P., Nowak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+divalent+cations+in+the+N-methyl-D-aspartate+responses+of+mouse+central+neurons+in+culture.">The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture.</a> J Physiol. 399, 247-266 (1988).</li><li>Aizenman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+mediated+by+excitatory+amino+acid+receptors+in+solitary+retinal+ganglion+cells+from+rat.">Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat.</a> J Physiol. 396, 75-91 (1988).</li><li>Taschenberger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+current+kinetics+in+a+solely+AMPA-receptor-operated+glutamatergic+synapse+formed+by+rat+retinal+ganglion+neurons.">Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons.</a> J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).</li><li>Chen, S., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+released+glutamate+activates+extrasynaptic+NMDA+receptors+on+cells+in+the+ganglion+cell+layer+of+rat+retina.">Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina.</a> J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).</li><li>Jakobs, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+mRNA+for+glutamate+receptor+subunits+distinguishes+the+major+classes+of+retinal+neurons,+but+is+less+specific+for+individual+cell+types.">Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types.</a> Mol Vis. 13, 933-948 (2007).</li><li>Margolis, D. J., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+mechanisms+generate+maintained+activity+in+ON+and+OFF+retinal+ganglion+cells.">Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells.</a> J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).</li><li>Margolis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+signaling+in+ON+and+OFF+mouse+retinal+ganglion+cells.">Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).</li><li>Baldridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recordings+of+the+effects+of+cholinergic+ligands+on+neurons+in+the+ganglion+cell+layer+of+mammalian+retina.">Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina.</a> J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).</li><li>Hartwick, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+glutamate+clearance+mechanisms+in+a+chronic+rat+glaucoma+model+using+retinal+ganglion+cell+calcium+imaging.">Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging.</a> J Neurochem. 94, 794-807 (2005).</li><li>Badea, T. C., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+neuronal+morphologies+in+the+mouse+retina+visualized+by+using+a+genetically+directed+reporter.">Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter.</a> J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).</li><li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+activity-mediated+refinement+of+axonal+projections+from+a+mosaic+of+genetically+identified+retinal+ganglion+cells.">Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells.</a> Neuron. 59, 425-438 (2008).</li><li>Kim, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+a+retinal+cell+type+that+responds+to+upward+motion.">Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion.</a> Nature. 452, 478-482 (2008).</li><li>Munch, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+sensitivity+in+the+retina+processed+by+a+multifunctional+neural+circuit.">Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit.</a> Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li></ol>

אי לנו גילויים.

במאמר זה, שתארנו שתי טכניקות שונות: 1) אימונוהיסטוכימיה להראות Fluo-4 לוקליזציה לתאי הגנגליון ברשתית wholemounts, ו2) סידן הדמיה כדי לנתח דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם. אימונוהיסטוכימיה באמצעות wholemounts נעשתה שימוש כדי ל?...

תאי הגנגליון ברשתית (RGCs) להביע VGCC L-, N-, P / Q- וT-הסוג, כפי שנקבע באמצעות מצור תרופתי של רכיבים של כל התא אלה Ca לתעל 1,2 הנוכחי. VGCC הם חלבוני Multimeric הטרנסממברני כי הם מעורבים בשחרור משדר, שעתוק הגנים, תקנת התא ו3,4,5 פלסטיות הסינפטית. VGCCs פונקציונלי מורכב של לפחות שלוש כיתות שונות של יחידות משנה: גדולות, הטרנסממברני α נקבובית 1 להרכיב יחידות משנה, אשר קובעת את מאפייני biophysical והתרופתיים של הערוץ, α בעיקר תאי עזר 2 δ יחידות משנה ותת יחידות β תאיות. שני מתחמי heteromeric הטופס האחרונים עם תת יחידות 1 α שונים ולשנות את קינטיקה gating וסחר של הערוצים לקרום הפלזמה 6. בעשורים האחרונים, בטכניקות רבות כבר מועסקות ללמוד expre חלבוןssion, כגון אימונוהיסטוכימיה, assay immunosorbent צמוד אנזים, ניתוח מערבי וcytometry זרימה. טכניקות אלו דורשות השימוש בנוגדנים ספציפיים לזיהוי של חלבון מסוים של ריבית ומספקות כלים רבי עוצמה ללוקליזציה וההפצה של חלבונים ספציפיים ברקמות שונות. טכניקות המשמשות לאיתור וללכמת רמות ביטוי mRNA של חלבון מסוים, כגון ניתוח כתם צפוני, RT-PCR, בזמן אמת RT-PCR, הכלאה באתר, microarrays cDNA וassay הגנת ribonuclease לספק גישה חלופית כאשר נוגדנים אינם בקלות רמות ביטוי זמינות או אם של חלבון מסוים הן נמוכות 7. עם זאת, מגבלה אחת לשימוש בטכניקות מולקולריות כזה הוא זיהוי הנדרש של רצף הגן. בתרגום חלבונים ברשתית, אימונוהיסטוכימיה יכולה להתבצע על רשתית wholemount. בשל הנגישות של RGCs, wholemountהכנה מספקת פלטפורמה מצוינת ללמוד הלוקליזציה של חלבונים ספציפיים לsomata RGC והאקסונים שלהם. בנוסף ללוקליזציה שלהם, ניתן להדגים כמה תכונות פונקציונליות של VGCCs בRGCs באמצעות השימוש בטכניקות הדמיה סידן. אנו מתארים פרוטוקול הדמיה סידן לתייג RGCs סלקטיבי עם צבע מחוון סידן למדידת דינמיקת סידן תוך תאי. התרומה של VGCCs שונה לאות סידן בתאים סלולריים שונים יכולה להיות מבודדת עם השימוש בחוסמי תעלות תת ספציפי Ca. אולי אחד ההיבטים מועילים ביותר של טכניקת ההדמיה סידן שתוארה כאן היא היכולת להקליט בו זמנית ובאופן עצמאי מRGCs מרובה והאקסונים שלהם. למרות שרבי טכניקות פיסיולוגיות, כגון הקלטת מהדק תא כל תיקון, לספק הקלטות גבוהות זמניות רזולוציה של זרמי קרום, סומטי או מקור axonal של thesזרמי דואר נרשמו לא יכולים להיות מופלים ולהקלטות יכולות להתבצע רק מתא עצב בודד בכל פעם. מערכי Multielectrode (MEAs) מסוגלים בו זמנית הקלטת קוצים מהתאים רבים, אבל אינו יכולים לזהות ולא להפלות את ההפעלה של, למשל, תת שונה של תעלות סידן. MEAs מעדיף להקליט מהתאים הנמצאים בסמיכות לאלקטרודה נתנה 8 ושיא מהתאים שיוצרים קוצים גדולים 9. שיטות הדמיה אופטיות לספק אסטרטגיה חלופית כדי לאפשר הקלטות בו זמנית ובלתי תלויות של אוכלוסיות שלמות של תאים שיכולים להיות משולבת עם המידע שהתקבל מmicroelectrode התא ותא והקלטת מהדק תיקון והקלטת MEA. למרות שטכניקות ההדמיה סידן המתוארות כאן הועסקו כדי ללמוד את דינמיקת סידן של RGCs, מהדק התיקון וMEAs יכולים גם לשמש במקביל על מנת להבהיר עוד יותר את הזרמים היוניים ומאפייני spiking של RGCs. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; מאחר ותאי amacrine עקורים מרכיבים כ 60% מהאוכלוסייה העצבית בשכבת תא גנגליון בעכבר רשתית 10, המטרה שלנו הייתה להשתמש בטכניקת העמסה שאופן סלקטיבי תוויות RGCs עם צבע מחוון סידן סינטטי ב הכנת wholemount. למרות צבעי מחוון סידן סינטטיים לספק פלטפורמה מצוינת ללימוד דינמיקת סידן תוך תאי, השימוש הנרחב שלה התעכב בשל חוסר היכולת לטעון ביעילות אוכלוסיות ספציפיות של תאי עצב בתוך רשת נתון. רבים טכניקות כגון טעינה בתפזורת 11 ו8,12 electroporation בוצעו לטעון אוכלוסיות שלמות של תאים, לעומת זאת, טכניקות אלה אינן מפלות בין סוגי תאים מסוימים. מבחינה גנטית מקודד מדדי סידן לספק את היכולת לתייג באופן סלקטיבי אוכלוסיות ספציפיות של תאים, לעומת זאת, שיטות אלו דורשות הדור של בעלי חיים מהונדסים 13. הטכניקה שלנו מתארת ​​methoד לתייג RGCs סלקטיבי בהכנת wholemount באמצעות הזרקת גדם עצב ראייה של צבע מחוון סידן. יחדיו, הטכניקות המבניות ופיזיולוגיות שתוארו במאמר זה מספקות פלטפורמה לחקור את הלוקליזציה ותרומה של VGCCs לאות סידן בRGCs והאקסונים שלהם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">14124-G</td>
			<td style="width:229px;">dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Straight Forceps</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">501985</td>
			<td>dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">curved iris scissors</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td>504487</td>
			<td>dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cellulose filter paper</td>
			<td style="width:112px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">HABP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hibernate A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=A1247501">A12475-01</a></td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1000&#160;</td>
			<td><a href="https://www.google.com/url?sa=t&amp;rct=j&amp;q=&amp;esrc=s&amp;source=web&amp;cd=1&amp;cad=rja&amp;sqi=2&amp;ved=0CC0QFjAA&amp;url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx%3FcatID%3D279&amp;ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw&amp;usg=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA&amp;sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg&amp;bvm=bv.48705608,d.cGE">Mounting Media for Fluorescence</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4 pentapotassium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-14200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope slide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-178-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM 5 Pascal microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:112px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A-11034</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RBPMS</td>
			<td style="width:112px;">ProSci, Poway, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>A rabbit polyclonal antibody&#160;was generated against the N-terminus of the RBPMS&#160;polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical and calcium imaging methods in wholemount rat retina

במאמר זה אנו מתארים את הכלים, חומרים כימיים, וצעדים המעשיים הדרושים ל: 1) הכנה מוצלחת של רשתית wholemount אימונוהיסטוכימיה ו, 2) הדמיה סידן לחקר תעלות סידן מתח מגודרת (VGCC) בתיווך איתות סידן ברשתית תאי הגנגליון. שיטת ההדמיה סידן אנו מתארים בעיות עוקפים לגבי הטעינה הלא ספציפית של תאי amacrine עקורים בשכבת תא גנגליון.

Immunolabeling עם נוגדנים ספציפיים מספק פלטפורמה ללמוד הלוקליזציה של חלבונים מסוימים של עניין ברשתית וטכניקת ההדמיה סידן מאפשר המחקר של התרומה של VGCCs לדינמיקה סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם. על ידי שימוש בנוגדנים נגד RBPMS חלב?...

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina at JoVE.com

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

פרוטוקולי אימונוהיסטוכימיה משמשים ללמוד את הלוקליזציה של חלבון מסוים ברשתית. טכניקות הדמיה סידן מועסקות ללמוד דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם.

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

immunohistochemical-calcium-imaging-methods-wholemount-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.4K Views.  University of California, Los Angeles.  פרוטוקולי אימונוהיסטוכימיה משמשים ללמוד את הלוקליזציה של חלבון מסוים ברשתית. טכניקות הדמיה סידן מועסקות ללמוד דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם. 

Video: Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

סידן הדמיה תפקודית בפיתוח רשתות קליפתיים

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

אימונוהיסטוכימיה Wholemount על טופוגרפיה חושפני המוח קומפלקס

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

דימות פריסייט במוח והדמיה המודינמית בעכברים מהונדסים ב- Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

הדמיית סידן דו-פוטונית ורחבת שדה בקוליקולוס העליון

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

מחבר זרקור: חשיפת קידוד עצבי ומנגנונים של עיבוד חזותי בקוליקולוס העליון 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...