Wir danken Dr. S. Stella und Helen Vuong für Beiträge zur Kalzium-Imaging-Protokoll. Wir danken Herrn Dr. K. Blätter für Dreharbeiten für den Interview-Szenen. Wir danken Dr. Arlene Hirano für ihre Kommentare zum Manuskript. Diese Forschung und Entwicklungsprojekt wurde von den Autoren an der David Geffen School of Medicine an der UCLA durchgeführt und wird von einer vertraglichen Vereinbarung, die von der US Army Medical Research &amp; Materiel Command (USAMRMC) vergeben und verwaltet wurde möglich gemacht und die Telemedizin &amp; Advanced Technology Forschungszentrum (TATRC) in Fort Detrick, unter Vertragsnummer MD: W81XWH-10-2-0077. Unterstützung für diese Studien kam auch von NIH EY04067 und VA Merit Review (NB). NZB ist ein VA Karriere Research Scientist.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für das Wohlergehen der von der US Public Health Service Politik Menschen Pflege und Verwendung von Labortieren und der University of California-Los Angeles (UCLA) Tierforschung Committee Versuchstieren durchgeführt. Männliche und weibliche erwachsene Sprague-Dawley-Ratten (Charles River Lab, Wilmington, MA) im Alter von 3-5 Wochen wurden verwendet. 1. Tier-und Gewebepräparation für Wholemount Retina und Immunhistochemie Protokoll <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Materialien und Werkzeuge: einem Binokular, 2 Pinzetten mit sehr feinen Spitzen, Schere, Zellulosefilterpapier, Kunststoffpipette und einem Objektträger. </li><li> Euthanize die Ratte in einer geschlossenen Kammer von tief Betäubung des Tieres mit 1-3% Isofluran gefolgt durch Enthauptung mit einer Guillotine. Die Augen mit einem Paar von Iris Schere und in eine Petrischale mit der extrazellulären Lösung zu entfernen. Hibernate A, Ames Medium oder physiologischen Lösungen empfohlen. </li><li> [Optional Schritt, wenn Verfüllung der RGZ mit Fluo-4 ist erwünscht]. Führen Sie die Fluo-4 Kennzeichnung wie in den Schritten 2.3-2.4 beschrieben. </li><li> Verwendung des Binokular (Lichtstärke: 1,6 x 10 8 Photonen / mm 2 ⋅sec), entfernen Sie die Hornhaut durch das Abschneiden der vor dem Auge Ball. Entfernen Sie die Linse und Glas von der inneren Netzhautoberfläche mit einer Pinzette. So entfernen Sie den Glaskörper, stabilisieren den Augapfel, indem die Lederhaut fest mit einer Zange. Ziehen Sie leicht dem Glaskörperbasis in Richtung der Mitte der Netzhaut, mit der anderen Zange. Die Zubereitung wird in diesem Stadium wird als Augenmuschel, die für Gefrierschnitte verwendet. Mehr Details über Gefrierschnitte können in den Referenzen 14,15 gefunden werden. </li><li> Entfernen Sie die Netzhaut von der Augenmuschel. Dann stellen vier Schnitte, damit der Netzhaut flach zu legen. Halterung sanft auf die Netzhaut auf einem Objektträger mit der Photorezeptorschicht auf. Geben Sie einen Tropfen der Lösung auf die Netzhaut und legte cellulose Filterpapier auf der Netzhaut. Sobald die Netzhaut wird an der Filterpapier, legen die Netzhaut wieder in Lösung. Wenn nötig, glätten die Netzhaut mit einem Pinsel oder einer Pinzette. </li><li> Legen Sie die Netzhäute wholemounted in 4% PFA für 10-15 min zur Fixierung. </li><li> Dreimal Waschen der wholemounted Netzhaut für 30 min in 0,1 M Phosphatpuffer (PB), pH 7,4. Sperrung der Netzhaut mit 5% normalem Ziegenserum oder Esel Serum in 0,1 PB, enthaltend 0,3% Triton X-100 und 0,1% NaN 3 bei 4 ° C über Nacht. Wir empfehlen ein Gesamtvolumen von 500 ul für alle Schritte zur Blockierung Lösungen und Antikörper zu speichern. </li><li> Am nächsten Tag, bebrüten die Netzhaut wholemounts mit dem primären Antikörper 5-7 Tage bei 4 ° C. Optimale Verdünnungen muss vom Anwender bestimmt werden. </li><li> Waschen der Netzhaut 3 x 30 min in 0,1 M PB und Inkubation über Nacht bei 4 ° C in das entsprechende Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper, der gegen die Spezies des primären Antikörpers (Konzentration 1: 1000) gerichtet ist. </li><li> Nach drei abschließenden Waschanlagen von 30 min mit je PB, montieren die Netzhaut in Montagemedium. Verschließen Sie die Deckgläser mit Nagellack für eine längere Lagerung. Proben bei 4 ° C und vor Licht schützen. </li></ol> 2. Kennzeichnung der Ganglienzellen und Axone in Rat Wholemount Netzhäute mit einem Calcium-Indikator-Farbstoff <ol><li> Bereiten 1000 ml Ringer-Säuger (in mM) 125 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3 enthält, und 10 Glucose mit 95% O 2/5% CO geperlt &#173; 2. </li><li> Führen Sie die Präparation wie in den Schritten 1.2-1.4 beschrieben. </li><li> Um retinalen Ganglienzellen (RGC) und ihre Axone mit einem Calcium-Indikator-Farbstoff in den Sehnerv Stumpf laden, injizieren 0,5 ul Fluo-4 Pentapotassium Salz (40 mM Stamm in H 2 O) ca. 1 mm hinter dem Augapfel mit einer Spritze . Zur Messung dynamischer Anstieg der Ganglienzelle [Ca2 + </sup&gt;] i eine Anzeige mit hoher Affinität, wie Fluo-4 mit K d von 345 nM, ist optimal. Fluo-4 bietet den zusätzlichen Vorteil, dass eine sehr hohe Quantenausbeute, was zu einer Emissionserhöhung von&gt; 100-fach, wenn Calcium gebunden. </li><li> Legen Sie die Augenmuschel in Säuger Ringer-mit 95% O sprudelte 5.2% CO &#173; 2 für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li></ol> 3. Calcium Imaging Protokoll zur retinalen Ganglienzellen und Axonen. <ol><li> Entfernen Sie das Auge, Linse und Glaskörper wie in den Schritten 1.1-1.4 beschrieben. Isolieren Sie die Netzhaut von der Augenmuschel und teilen sich in Quadranten. Hängen Sie eine Quadranten Ganglienzellseite nach oben auf einem Glasobjektträger und verwenden Sie eine Harfe Scheibe Raster, um es zu stabilisieren. Halten Sie die anderen Stücke dunkeladaptierten in Säuger Ringer-mit 95% O sprudelte 5.2% CO &#173; 2 auf Eis für die spätere Verwendung. </li><li> Superfuse die Aufzeichnungskammer, die mit Säuger-Ringer-Lösung undhalten Sie die Lösung kontinuierlich sprudelnde mit 95% O 2/5% CO 2. </li><li> Bild das Gewebe unter dem Mikroskop. Verhaltensexperimente bei Raumtemperatur (~ 23 ° C) zu erreichen oder physiologischen Temperaturen durch Erwärmen der Stufe Erhitzen des Wasserbades unter der Probe oder der Anwendung warmer Luft auf die Oberfläche der Probe. Hinweis: Es ist wichtig zu beachten, dass viele Zellfunktionen werden durch Temperatur, die eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase intrazellulären 16 spielt geregelt. Jedoch können Einführung Erwärmung misst die Rate des Photobleichen, Verdampfung des Mediums und Fokusdrift durch thermische Ausdehnung verursachte 17 zu erhöhen. Verwendung von Raumtemperatur sinkt intrazellulären Kompartimentierung Fluo-4 18. </li><li> Durchführen einer Steuerung von zwei gepaarten hohen K +-Impulse in der Abwesenheit von Arzneimittel. Depolarisieren RGZ und RGC Axone durch die Erhöhung der [K +] o von 3 mm bis 60 mm für 33 sec bei jedem Impuls zu aktivierenVGCCs mit einem Acht-Kanal-Schwerkraft Superfusionssystem. Reduzieren Na + von 57 mM bis isosmolarity in der erhöhten K +-Lösung zu erhalten. </li><li> Den Beitrag der verschiedenen VGCCs auf die Kalzium-Signal mit der Verwendung von allgemeinen oder spezifischen Ca-Kanal-Blocker. Zum Beispiel kann die Verringerung der Calcium-Signal nach der Verabreichung einer nicht-spezifische Calciumkanal-Blocker, Kobalt, ein semi-quantitatives Maß für den Beitrag der VGCCs der hohen K + -evoked Calciumsignals. </li><li> Erwerben Fluoreszenzintensität Werte, indem Sie eine Region of Interest (ROI) um die RGZ von Interesse (Abbildung 2). </li><li> Normalisieren der Änderung der durch den zweiten Hoch K + Peak, der durch den ersten Hoch K + Peak erzeugt Änderung erzeugten Fluoreszenzintensität. Dann zum Testen spezifischer Calcium-Kanal-Blocker, gelten Medikamente nur während der zweiten Hoch K + Impuls eines Paares und normalisieren diese Spitze gegender erste Spitzenwert. So messen Sie die Auswirkungen der Droge auf der hohen K + Peak, teilen Sie die Amplitude der zweiten K + Peak durch die des ersten. Analyse sollte dieser Werte in Bezug auf ihre Übereinstimmungen Steuerungen von gepaarten hohen K + Peaks in Abwesenheit des Arzneimittels gemessen abgeleitet geführt werden. </li><li> Erwerben Sie Bilder mit 5 Sekunden-Intervallen. Auf Foto-Bleich zu vermeiden, halten Sie die Laseranregung so gering wie möglich. Bereitzustellen Anregung durch den 488 nm-Linie des Argon-Lasers, während der Photovervielfacherröhre sammelt die Fluoreszenzemission durch einen 505 nm-LP-Filter. </li></ol>

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Die Autoren haben keine Angaben.

1) Immunhistochemie auf Fluo-4-Lokalisierung in den Ganglienzellen in der Netzhautwholemounts zeigen, und 2) Calcium Imaging, Kalzium Dynamik in retinalen Ganglienzellen und ihre Axone zu analysieren: In diesem Artikel haben wir zwei verschiedene Techniken beschrieben. Immunhistochemie unter Verwendung wholemounts wurde verwendet, um die Lokalisierung von Proteinen in den Nager Retina 20-23 offenbaren. Es gibt jedoch einige Einschränkungen. Die Qualität der Färbung hängt stark...

Retinalen Ganglienzellen (RGCs) exprimieren L, N, P / Q-und T-Typ VGCC wie durch pharmakologische Blockade dieser Komponenten der gesamten Zelle bestimmt Ca-Kanalstrom 1,2. VGCC sind Trans multimeren Proteine, die in Transmitterfreisetzung, Gen-Transkription, Zellregulation und der synaptischen Plastizität 3,4,5 beteiligt sind. Groß, Trans α 1 porenbildenden Untereinheiten, die biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften des Kanals, in erster Linie Hilfsextrazellulären α-Untereinheiten und 2 δ intrazellulären β-Untereinheiten zu etablieren: Funktions VGCCs bestehen aus mindestens drei verschiedene Klassen von Untereinheiten. Die beiden letztgenannten Form heteromeren Komplexe mit verschiedenen α-Untereinheiten 1 und ändern Sie die Gating-Kinetik und den Handel mit den Kanälen in der Plasmamembran 6. In den letzten Jahrzehnten wurden viele Techniken eingesetzt, um Protein expre studierenSpaltung, wie der Immunhistochemie, Enzyme-linked Immunosorbent Assay, Western-Analyse und Durchflusszytometrie. Diese Techniken erfordern die Verwendung spezifischer Antikörper zum Nachweis eines bestimmten Proteins von Interesse und liefern leistungsstarke Werkzeuge für die Lokalisierung und Verteilung spezifischer Proteine ​​in unterschiedlichen Geweben. Techniken zum Nachweis und zur Quantifizierung der mRNA Expression eines bestimmten Proteins, wie Northern-Blot-Analyse, RT-PCR, quantitative Echtzeit-RT-PCR, in situ-Hybridisierung, cDNA-Microarrays und Ribonuclease Protection Assay einen alternativen Ansatz bei der Antikörper nicht ohne weiteres verfügbar ist oder wenn die Expressionsniveaus eines bestimmten Proteins niedrig sind 7. , Eine Beschränkung auf die Verwendung von solchen molekularen Techniken ist jedoch die erforderliche Identifizierung der Gensequenz. Um Proteine ​​in der Netzhaut zu lokalisieren, kann die Immunhistochemie auf wholemount Netzhaut durchgeführt werden. Aufgrund der Zugänglichkeit der RGCs, der WholemountVorbereitung bietet eine hervorragende Plattform, um die Lokalisierung von spezifischen Proteinen auf die RGC Somata und ihre Axone zu studieren. Zusätzlich zu ihrer Lokalisierung, können einige funktionelle Eigenschaften der VGCCs in RGCs durch die Verwendung von Calcium-Imaging-Techniken nachgewiesen werden. Wir beschreiben eine Kalzium-Imaging-Protokoll, um selektive Markierung RGZ mit einem Calcium-Indikatorfarbstoff, um intrazelluläre Kalziumdynamik messen. Der Beitrag der unterschiedlichen VGCCs um das Calciumsignal in verschiedenen Zellkompartimenten können mit der Verwendung von subtypspezifischen Ca-Kanalblocker, isoliert werden. Vielleicht einer der vorteilhaften Aspekte des hier beschriebenen Calciumabbildungstechnik ist die Möglichkeit, gleichzeitig und unabhängig voneinander von mehreren RGCs und ihre Axone aufzuzeichnen. Obwohl viele physiologische Techniken, wie beispielsweise Voll Patch-Clamp-Aufnahme, eine hohe Zeitauflösung Aufnahmen Membranströme, die somatische oder axonale Quelle thesaufgezeichnet e Ströme nicht unterschieden werden und Aufnahmen können nur von einem einzelnen Neuron zu einem Zeitpunkt vorgenommen werden. Multielektroden-Arrays (MEA) sind in der Lage, gleichzeitig die Aufzeichnung Spitzen von vielen Zellen, aber weder erkennen noch zu benachteiligen die Aktivierung, beispielsweise unterschiedliche Subtypen von Calciumkanälen. MEAs bevorzugt von Zellen, die in der Nähe einer bestimmten Elektrode 8 und Satzes aus Zellen, die große Spitzen 9 erzeugen befinden aufzuzeichnen. Optischen bildgebenden Verfahren bieten eine alternative Strategie, um die gleichzeitige und unabhängige Aufnahmen von ganzen Populationen von Zellen, die mit dem von der Einzelzellmikroelektroden-und Patch-Clamp-Aufzeichnung und MEA Aufnahme gewonnenen Informationen integriert werden können ermöglichen. Obwohl die hier beschriebenen Kalzium-Imaging-Techniken wurden eingesetzt, um die Dynamik von Kalzium RGZ studieren können Patch-Clamp-und MEAs auch parallel zur weiteren Aufklärung der Ionenströme und Spick Eigenschaften der RGZ werden. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Seit verschoben Amakrinzellen machen etwa 60% der neuronalen Population in der Ganglienzellschicht in der Netzhaut der Maus 10, unser Ziel war es, eine Ladetechnik, die selektiv Etiketten RGZ mit einem synthetischen Kalzium-Indikator-Farbstoff in einer Gebrauchs wholemount Vorbereitung. Obwohl synthetische Calcium-Indikator-Farbstoffe eine ausgezeichnete Plattform für die Untersuchung der intrazellulären Calciumdynamik hat weitverbreitete Verwendung durch die Unfähigkeit behindert, um spezifische Populationen von Neuronen in einem bestimmten Netzwerk effektiv zu laden. Viele Techniken wie Bulkbeladung 11 und Elektroporation 8,12 durchgeführt, um zu laden ganze Populationen von Zellen, aber solche Techniken nicht zwischen bestimmten Zelltypen zu unterscheiden. Genetisch kodierte Calciumindikatoren liefern die Fähigkeit, selektiv zu markieren spezifischen Populationen von Zellen, jedoch erfordern solche Verfahren die Herstellung von transgenen Tieren 13. Unsere Technik beschreibt ein method selektiv beschriften RGZ in der wholemount Herstellung über Sehnerv Stumpf Injektion eines Kalzium-Indikator-Farbstoff. Zusammengenommen, strukturelle und physiologische Techniken in diesem Artikel beschrieben eine Plattform bieten, um die Lokalisierung und den Beitrag der VGCCs auf die Kalzium-Signal in RGZ und ihre Axone zu studieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">14124-G</td>
			<td style="width:229px;">dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Straight Forceps</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">501985</td>
			<td>dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">curved iris scissors</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td>504487</td>
			<td>dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cellulose filter paper</td>
			<td style="width:112px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">HABP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hibernate A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=A1247501">A12475-01</a></td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1000&#160;</td>
			<td><a href="https://www.google.com/url?sa=t&amp;rct=j&amp;q=&amp;esrc=s&amp;source=web&amp;cd=1&amp;cad=rja&amp;sqi=2&amp;ved=0CC0QFjAA&amp;url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx%3FcatID%3D279&amp;ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw&amp;usg=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA&amp;sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg&amp;bvm=bv.48705608,d.cGE">Mounting Media for Fluorescence</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4 pentapotassium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-14200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope slide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-178-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM 5 Pascal microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:112px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A-11034</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RBPMS</td>
			<td style="width:112px;">ProSci, Poway, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>A rabbit polyclonal antibody&#160;was generated against the N-terminus of the RBPMS&#160;polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical and calcium imaging methods in wholemount rat retina

In diesem Beitrag beschreiben wir die Werkzeuge, Reagenzien und die praktischen Schritte, die für notwendig: 1) erfolgreiche Vorbereitung von wholemount Netzhaut für die Immunhistochemie und 2) Kalzium-Imaging für die Untersuchung von spannungsabhängigen Calcium-Kanal (VGCC) vermittelt Calcium-Signalgebung in der Netzhaut Ganglienzellen. Die Kalzium-Imaging-Methode beschreiben wir circumvents Fragen über nicht-spezifische Belastung von Vertriebenen Amakrinzellen in der Ganglienzellschicht.

Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern bietet eine Plattform, um die Lokalisierung von bestimmten Proteinen von Interesse in der Netzhaut und des Calciumbildgebungstechnik zu untersuchen erlaubt die Untersuchung der Beiträge der VGCCs den Calciumdynamik in den retinalen Ganglienzellen und ihre Axone. Durch die Verwendung eines Antikörpers gegen den Ganglienzellprotein RBPMS (RNA-Bindeprotein mit mehreren Spleißen), die selektiv markiert RGCs 19, konnten wir zeigen, dass ...

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Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Immunhistochemie Protokolle werden verwendet, um die Lokalisierung eines bestimmten Proteins in der Netzhaut zu untersuchen. Calcium-Imaging-Techniken verwendet werden, um Calciumdynamik in retinalen Ganglienzellen und ihre Axone zu studieren.

Immunhistochemischen und Calcium Imaging Methoden in der Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

immunohistochemical-calcium-imaging-methods-wholemount-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.3K Aufrufe.  University of California, Los Angeles.  Immunhistochemie Protokolle werden verwendet, um die Lokalisierung eines bestimmten Proteins in der Netzhaut zu untersuchen. Calcium-Imaging-Techniken verwendet werden, um Calciumdynamik in retinalen Ganglienzellen und ihre Axone zu studieren. 