המחברים רוצים להכיר המרכז של UC Riverside לגלייה-עצבי אינטראקציות לדיון חשוב של פרוטוקולי קנה המידה ונתונים. המחברים רוצים גם לתת תודה כנה לך Abcam למתן חסות לפרסום של עבודתם.

<ol>
	<li>Araque, A., Martin, E. D., Perea, G., Arellano, J. I., Buno, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+released+acetylcholine+evokes+Ca2++elevations+in+astrocytes+in+hippocampal+slices.">Synaptically released acetylcholine evokes Ca2+ elevations in astrocytes in hippocampal slices.</a> J. Neurosci. 22, 2443-2450 (2002).</li><li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+mediate+neuron-astrocyte+communication.">Endocannabinoids mediate neuron-astrocyte communication.</a> Neuron. 57, 883-893 (2008).</li><li>Bekar, L. K., He, W., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locus+coeruleus+alpha-adrenergic-mediated+activation+of+cortical+astrocytes+in+vivo.">Locus coeruleus alpha-adrenergic-mediated activation of cortical astrocytes in vivo.</a> Cereb. Cortex. 18, 2789-2795 (2008).</li><li>Hertz, L., Lovatt, D., Goldman, S. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenoceptors+in+brain:+cellular+gene+expression+and+effects+on+astrocytic+metabolism+and+Ca2.">Adrenoceptors in brain: cellular gene expression and effects on astrocytic metabolism and Ca2.</a> Neurochem. Int. 57, 411-420 (2010).</li><li>Porter, J. T., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+astrocytes+in+situ+respond+to+glutamate+released+from+synaptic+terminals.">Hippocampal astrocytes in situ respond to glutamate released from synaptic terminals.</a> J. Neurosci. 16, 5073-5081 (1996).</li><li>Bernardinelli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+display+complex+and+localized+calcium+responses+to+single-neuron+stimulation+in+the+hippocampus.">Astrocytes display complex and localized calcium responses to single-neuron stimulation in the hippocampus.</a> J. Neurosci. 31, 8905-8919 (2011).</li><li>Panatier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+are+endogenous+regulators+of+basal+transmission+at+central+synapses.">Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses.</a> Cell. 146, 785-798 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Ca2++signaling+evoked+by+sensory+stimulation+in+vivo.">Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo.</a> Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).</li><li>Fiacco, T. A., Agulhon, C., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+out+astrocyte+physiology+from+pharmacology.">Sorting out astrocyte physiology from pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 49, 151-174 (2009).</li><li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling+and+Gliotransmission+in+Normal+vs+Reactive+Astrocytes.">Calcium Signaling and Gliotransmission in Normal vs Reactive Astrocytes.</a> Front. Pharmacol. 3, 139 (2012).</li><li>Nedergaard, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artifact+versus+reality--how+astrocytes+contribute+to+synaptic+events.">Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events.</a> Glia. 60, 1013-1023 (2012).</li><li>Nizar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+stimulus-induced+vasodilation+occurs+without+IP3+receptor+activation+and+may+precede+astrocytic+calcium+increase.">In vivo stimulus-induced vasodilation occurs without IP3 receptor activation and may precede astrocytic calcium increase.</a> J. Neurosci. 33, 8411-8422 (2013).</li><li>Sutton, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniature+neurotransmission+stabilizes+synaptic+function+via+tonic+suppression+of+local+dendritic+protein+synthesis.">Miniature neurotransmission stabilizes synaptic function via tonic suppression of local dendritic protein synthesis.</a> Cell. 125, 785-799 (2006).</li><li>Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+synaptic+scaling+induced+by+changes+in+postsynaptic+firing.">Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing.</a> Neuron. 57, 819-826 (2008).</li><li>Xie, A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+scaling+of+astrocytic+metabotropic+glutamate+receptor+signaling+following+long-term+changes+in+neuronal+firing+rates.">Bidirectional scaling of astrocytic metabotropic glutamate receptor signaling following long-term changes in neuronal firing rates.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+calcium.">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiol. Rev. 79, 1089-1125 (1999).</li><li>Petravicz, J., Fiacco, T. A., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+IP3+receptor-dependent+Ca2++increases+in+hippocampal+astrocytes+does+not+affect+baseline+CA1+pyramidal+neuron+synaptic+activity.">Loss of IP3 receptor-dependent Ca2+ increases in hippocampal astrocytes does not affect baseline CA1 pyramidal neuron synaptic activity.</a> J. Neurosci. 28, 4967-4973 (2008).</li><li>Nett, W. J., Oloff, S. H., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+astrocytes+in+situ+exhibit+calcium+oscillations+that+occur+independent+of+neuronal+activity.">Hippocampal astrocytes in situ exhibit calcium oscillations that occur independent of neuronal activity.</a> J. Neurophysiol. 87, 528-537 (2002).</li><li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo.">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, 380-386 (2006).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+101+as+a+specific+marker+of+astroglia+in+the+neocortex+in+vivo.">Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo.</a> Nat. Methods. 1, 31-37 (2004).</li><li>Prezeau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+carboxyl-terminal+domain+of+metabotropic+glutamate+receptor+1+by+alternative+splicing+generate+receptors+with+differing+agonist-independent+activity.">Changes in the carboxyl-terminal domain of metabotropic glutamate receptor 1 by alternative splicing generate receptors with differing agonist-independent activity.</a> Mol. Pharmacol. 49, 422-429 (1996).</li><li>Shao, Y., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+relationship+between+alpha+1-adrenergic+receptor+density+and+the+receptor-mediated+calcium+response+in+individual+astroglial+cells.">Quantitative relationship between alpha 1-adrenergic receptor density and the receptor-mediated calcium response in individual astroglial cells.</a> Mol. Pharmacol. 44, 247-254 (1993).</li><li>Wang, S. S., Thompson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+changes+in+functional+muscarinic+acetylcholine+receptor+density+in+single+neuroblastoma+cells+using+calcium+release+kinetics.">Measurement of changes in functional muscarinic acetylcholine receptor density in single neuroblastoma cells using calcium release kinetics.</a> Cell Calcium. 15, 483-496 (1994).</li><li>Ostasov, P., Krusek, J., Durchankova, D., Svoboda, P., Novotny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++responses+to+thyrotropin-releasing+hormone+and+angiotensin+II:+the+role+of+plasma+membrane+integrity+and+effect+of+G11alpha+protein+overexpression+on+homologous+and+heterologous+desensitization.">Ca2+ responses to thyrotropin-releasing hormone and angiotensin II: the role of plasma membrane integrity and effect of G11alpha protein overexpression on homologous and heterologous desensitization.</a> Cell Biochem. Funct. 26, 264-274 (2008).</li><li>Shelton, M. K., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+astrocytes+exhibit+Ca2+-elevating+muscarinic+cholinergic+and+histaminergic+receptors+in+situ.">Hippocampal astrocytes exhibit Ca2+-elevating muscarinic cholinergic and histaminergic receptors in situ.</a> J. Neurochem. 74, 555-563 (2000).</li><li>Hermans, E., Challiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+signalling+and+regulatory+properties+of+the+group+I+metabotropic+glutamate+receptors:+prototypic+family+C+G-protein-coupled+receptors.">Structural signalling and regulatory properties of the group I metabotropic glutamate receptors: prototypic family C G-protein-coupled receptors.</a> Biochem. J. 359, 465-484 (2001).</li><li>Zur Nieden, R., Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Metabotropic+Glutamate+Receptors+for+the+Generation+of+Calcium+Oscillations+in+Rat+Hippocampal+Astrocytes+In+Situ.">The Role of Metabotropic Glutamate Receptors for the Generation of Calcium Oscillations in Rat Hippocampal Astrocytes In Situ.</a> Cortex. 16 (5), 676-687 (2005).</li><li>de Ligt, R. A., Kourounakis, A. P., AP, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+agonism+at+G+protein-coupled+receptors:+(patho)physiological+relevance+and+implications+for+drug+discovery.">Inverse agonism at G protein-coupled receptors: (patho)physiological relevance and implications for drug discovery.</a> Br. J. Pharmacol. 130, 1-12 (2000).</li><li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+101+induces+long-term+potentiation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+efficacy+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Sulforhodamine 101 induces long-term potentiation of intrinsic excitability and synaptic efficacy in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuroscience. 169, 1601-1609 (2010).</li><li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains.">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging.">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J. Gen. Physiol. 141, 633-647 (2013).</li><li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition.">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat. Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li><li>Fiacco, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+stimulation+of+astrocyte+calcium+in+situ+does+not+affect+neuronal+excitatory+synaptic+activity.">Selective stimulation of astrocyte calcium in situ does not affect neuronal excitatory synaptic activity.</a> Neuron. 54, 611-626 (2007).</li><li>Echegoyen, J., Neu, A., Graber, K. D., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+plasticity+studied+using+in+vivo+hippocampal+activity-blockade:+synaptic+scaling,+intrinsic+plasticity+and+age-dependence.">Homeostatic plasticity studied using in vivo hippocampal activity-blockade: synaptic scaling, intrinsic plasticity and age-dependence.</a> PLoS One. 2, (2007).</li><li>Aguado, F., Espinosa-Parrilla, J. F., Carmona, M. A., Soriano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+regulates+correlated+network+properties+of+spontaneous+calcium+transients+in+astrocytes+in+situ.">Neuronal activity regulates correlated network properties of spontaneous calcium transients in astrocytes in situ.</a> J. Neurosci. 22, 9430-9444 (2002).</li><li>Takata, N., Hirase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+layer+1+and+layer+2/3+astrocytes+exhibit+distinct+calcium+dynamics+in+vivo.">Cortical layer 1 and layer 2/3 astrocytes exhibit distinct calcium dynamics in vivo.</a> PLoS ONE. 3, e2525 (2008).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRET+biosensors+to+study+GPCR+biology,+pharmacology,+and+signal+transduction.">BRET biosensors to study GPCR biology, pharmacology, and signal transduction.</a> Front. Endocrinol. 3 (105), (2012).</li><li>Di Castro, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Ca2++detection+and+modulation+of+synaptic+release+by+astrocytes.">Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes.</a> Nat. Neurosci. 14, 1276-1284 (2011).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-dependent+neuroglial+calcium+signaling+differs+between+young+and+adult.">Glutamate-dependent neuroglial calcium signaling differs between young and adult.</a> Science. 339, 197-200 (2013).</li></ol>

המחברים מבקשים לחשוף כי tetrodotoxin משמש במחקרים אלה נרכש מAbcam. היה לי Abcam שום מעורבות בהשערות, עיצוב, או אוסף של נתונים. כל התקשורת בעניין מתן החסות של העבודה על ידי Abcam התרחשה לאחר תהליך ביקורת העמיתים היה שלם.

האסטרוציטים להגיב בתוך שניות לגירוי של תאי עצב או אקסונים עצביים עם עליות Ca cytoplasmic 2 + וכתוצאה מכך כמעט אך ורק מהפעלה של GPCRs GQ astrocytic. לדוגמא, קולטני אצטילכולין מוסקריניים 1, 2 קולטנים קנבינואידים, קולטנים 1A α adrenergic 3, 4, והקבוצה שאני mGluRs (ראה להלן) הם כל תת GQ GPCR astrocytic שחריפות להגיב על פעילות עצבית. הפעלה של קבוצת astrocytic אני mGluRs הודגמה נרחבת ביותר, בעקבות הגירוי של afferents glutamatergic העצבית באתרו (כמו פרוסות בהיפוקמפוס חריפות) 5-7, כמו גם בקליפת מוח עכבר המבוגר in vivo בעקבות גירוי חושי 8. התוצאה של הפעלה של astrocytic GQ GPCR איתות על הביולוגיה והפיסיולוגיה של האסטרוציטים, תאי עצב, או אינטראקציות astrocyte נוירון כבר עניין של ויכוח 9-12. זה יהיה שלשת זמן עד שהפונקציה של איתות קולטן תא העצב לastrocyte מוערך באופן מלא. למרות שזה ברור שנוירונים יכולים להפעיל קולטני astrocytic תוך שימוש בפרוטוקולים ניסיוניים, יש היבטים של תקשורת קולט נוירון לastrocyte שנותר הבינו היטב. ראשית, הסכום בפועל של פעילות עצבית הנדרשת להפעלת astrocytic GQ GPCRs אינו מוגדר היטב, ושנית, היכולת של קולטני astrocytic להפגין גמישות שימוש תלוי זכתה לתשומת לב מועטת. כדי להתחיל לענות על שאלות אלה, לאחרונה פיתחו פרוטוקול כדי לגרום לשינוי קנה מידה דו כיוונית של קבוצת astrocytic אני mGluRs בפרוסות בהיפוקמפוס לנוער חריפה בתגובה לשינויים ארוך טווח בפוטנציאל פעולה עצבי (AP) תלויים פעילות הסינפטית. בדומה למה שכבר גילה לפלסטיות homeostatic דו כיוונית של קולטנים עצביים גלוטמט ionotropic 13, 14, קבוצת astrocytic אני mGluRs בהיקף של עד עבורמצור llowing של פוטנציאל פעולה עצבי ולקצץ כאשר תדירות פוטנציאל פעולה עצבית מוגברת 15. שינויים מפצים אלה בקולטנים astrocytic ניתן למדוד על ידי הקלטה ספונטנית ועוררו astrocyte Ca 2 + ארעיים ולהשוות את המאפיינים של אירועים אלה לאלה מהאסטרוציטים בתנאי בקרה. בכתב היד הזה, אנו מתארים את המתודולוגיה המלאה לשימוש בפרוטוקול זה, ובכלל זה הכנת פרוסות בהיפוקמפוס, תנאי דגירה חריפים כדי לגרום לשינוי קנה מידה של הקולטן astrocyte, טעינת astrocyte Ca 2 + מחוון צבע, Ca 2 + טכניקות הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal, והשפעות צפויות על astrocyte פעילות GQ GPCR. השפעות צפויות על astrocyte Ca 2 + מאפייני איתות - שיתאימו לאלו שנרשמו בעבר בתאים בתרבית transfected עם רמות ביטוי שונות של GPCRs GQ - מספקים &quot;מפת דרכים&quot; שיכול לשמש במחקרים עתידיים לassay לשינויים כבביטוי GPCR trocytic. ההשלכות ויישומים אפשריים לשימוש בטכניקה זו יתרמו להבנה של אינטראקציות astrocyte עצבי במוח בריא וחולה שלנו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Chamber Supplies</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:163px;">Brinkmann pipette storage container</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">03-491</td>
			<td style="width:159px;">Use the drawer portion as the incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:163px;">Electrical drill</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Flexible tubing</td>
			<td style="width:135px;">Tygon</td>
			<td style="width:131px;">R-3603</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Silicone seam sealant&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">Also called aquarium seam sealer</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Gas tank</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">95% oxygen, 5% carbon dioxide</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">Natural beveled pipette tip</td>
			<td style="width:135px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:131px;">1111-1000</td>
			<td style="width:159px;">Cut-to-fit to connect oxygenate lines</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">One-to-six lines manifold</td>
			<td style="width:135px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:131px;">64-0210 &#160;(MP-6)</td>
			<td style="width:159px;">For the microloader-manifold apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="65" rowspan="2" style="height:65px;width:163px;">Eppendorf microloader</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Eppendorf</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">5242 956.003</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit</td>
		</tr>
		<tr height="6">
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Floating Bubble Rack</td>
			<td style="width:135px;">Bel Art Scienceware</td>
			<td style="width:131px;">F18875-0400</td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">600 micron Sefar Nitex nylon mesh</td>
			<td style="width:135px;">ELKO filtering Co.</td>
			<td style="width:131px;">&#160;06-600/51</td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Krazy Glue</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:135px;">Baxter</td>
			<td style="width:131px;">1001936060</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">NaCl</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S271-3</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:163px;">KCl</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">P333-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:163px;">CaCl2</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">C79-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:163px;">MgCl2</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">M33-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:163px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S369-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S233-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:131px;">53188-07-1</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:131px;">401471000</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Tetrodotoxin citrate (TTX)</td>
			<td style="width:135px;">Ascent Scientific</td>
			<td style="width:131px;">Asc-055</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Sulforhodamine 101 (SR-101)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">284912</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">D128-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Pluronic Acid F-127</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td style="width:131px;">P6867</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:163px;">Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging)</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td style="width:131px;">O6807</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">(RS)-3,5-DHPG</td>
			<td style="width:135px;">Ascent</td>
			<td style="width:131px;">Asc-020</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Histamine</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">H7125</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">Carbamoylcholine chloride (Carbachol)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">C4382</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:163px;">Adenosine 5&#8217;-ATP disodium (Na-ATP)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A7699</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Dissection Tools</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Single-edge razor blade&#160;</td>
			<td style="width:135px;">GEM</td>
			<td style="width:131px;">62-0161</td>
			<td style="width:159px;">For bisection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Double edge razor blade</td>
			<td style="width:135px;">TED PELLA, INC.</td>
			<td style="width:131px;">121-6</td>
			<td style="width:159px;">For cutting slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Mayo Scissors, supercut</td>
			<td style="width:135px;">WPI</td>
			<td style="width:131px;">14010-15</td>
			<td style="width:159px;">For decapitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Fine iris scissors, straight</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">14094-11</td>
			<td style="width:159px;">For cutting the skull</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Iris forceps, curved</td>
			<td style="width:135px;">WPI</td>
			<td style="width:131px;">15915</td>
			<td style="width:159px;">To remove the skin and skull</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:163px;">Small spatula</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">To remove/transfer the brain</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">11295-10</td>
			<td style="width:159px;">For hippocampus dissection</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Glass Pasteur pipette</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">13-678-20B</td>
			<td style="width:159px;">For transferring brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Pasteur pipette rubber bulb</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">03-448-22</td>
			<td style="width:159px;">For transferring brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Polystyrene 100-mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">25020</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Equipment</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Vibratome</td>
			<td style="width:135px;">Leica</td>
			<td style="width:131px;">VT 1200S</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="23" rowspan="2" style="height:23px;width:163px;">Water bath</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Fisher</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">ISOTEMP 210</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For warm incubation</td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:163px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:135px;">Narishige</td>
			<td style="width:131px;">PC-10</td>
			<td style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:131px;">Olympus Fluoview 1000</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:163px;">Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform</td>
			<td style="width:135px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:131px;">RC-26GLP</td>
			<td style="width:159px;">diamond bath with low profile</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Borosilicate glass pipette</td>
			<td style="width:135px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:131px;">TW150F-4</td>
			<td style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="25" rowspan="2" style="height:25px;width:163px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Sutter instrument</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">ROE-200</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:163px;">Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 &#181;m cellulose acetate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Costar</td>
			<td style="width:131px;">8161</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing plasticity of astrocytic receptors by manipulation of neuronal firing rates

קרוב לשני עשורים של מחקר קבע כי האסטרוציטים באתר וin vivo לבטא קולטנים רבים G-חלבון בשילוב (GPCRs) שיכול להיות מגורה על ידי משדר neuronally שפורסם. עם זאת, היכולת של קולטני astrocytic להפגין גמישות בתגובה לשינויים בפעילות עצבית זכתה לתשומת לב מועטת. כאן אנו מתארים מערכת מודל שיכול לשמש לגלובלי בהיקף של למעלה או למטה קבוצת astrocytic אני metabotropic קולטני גלוטמט (mGluRs) בפרוסות מוח חריפות. הם כללו שיטות על איך להכין פרוסות בהיפוקמפוס parasagittal, לבנות תאים מתאימים לדגירת פרוסה לטווח ארוך, bidirectionally לתפעל תדירות פוטנציאלית, האסטרוציטים עומס פעולה עצבית ותהליכי astrocyte עם Ca 2 + חיווי ניאון, ולמדוד שינויים בפעילות GQ GPCR astrocytic ידי הקלטה astrocyte הספונטני ועורר Ca 2 אירועים + באמצעות מיקרוסקופיה confocal. בעיקרו של דבר, &quot;r סידןoadmap &quot;הוא הניתן לאיך למדוד את הפלסטיות של GPCRs GQ astrocytic. יישומים של הטכניקה ללימוד של האסטרוציטים הם דנו. יש שיש הבנה של אופן שאיתות קולט astrocytic מושפע משינויים בפעילות עצבית השלכות חשובות עבור שניהם הפונקציה הסינפטי הנורמלית, כמו גם הפרעות תהליכים בסיסי נוירולוגיות ומחלות ניווניות.

נציג תוצאות באיור 3 מראות את ההשפעה של דגירה של פרוסות בהיפוקמפוס העכבר חריפות בTTX ל4-6 שעות על astrocyte SR Ca 2 + פעילות. הנתונים כוללים גם Ca 2 + ארעיים ספונטניות וקבוצה עוררו DHPG אני mGluR Ca 2 + תגובות, מפרוסות מודגרות בACSF שליטה לעומת ACSF תוספת TTX. מלבד תכונות בסיסיות אופייניות מורפולוגיים, הרכבה תהליך stellate וגודל סומה קטנה (~ 10 מיקרומטר), האסטרוציטים מזוהים בSR על ידי כיסוי של AM Ca 2 + המחוון OGB-1 עם סמן astrocyte סלקטיבית SR-101 19, 20 ( איור 3 א). קופסות ממוספרות על גופי תא astrocyte מתאימות לקרינה הממוספרת על עקבות זמן שמוצגים באיור 3. אגוניסט קבוצת 1 mGluR (RS)-3.5 DHPG מוחל כדי לקבוע את השפעות קנה מידה הספציפיות על mGluRs קבוצת 1 בהאסטרוציטים. להפלות בין Physiology בספציפי של השפעת קנה המידה לmGluRs קבוצת 1 לעומת GPCRs GQ אחרת, קוקטייל של אגוניסטים מיושם בסופו של כל ניסוי. כאן אנו משמשים 10 מיקרומטר כל אחת מGPCR GQ אגוניסטים היסטמין, כלוריד carbamylcholine (carbachol) וdisodium אדנוזין 5&#39;-ATP (Na-ATP). קוקטייל אגוניסט משמש גם כביקורת חיובית לזהות האסטרוציטים קיימא, מגיבים במקרים בהם תאים אינם מגיבים לDHPG, כנראה משום האסטרוציטים בפרט אלה אינם מבטאים כמויות מספיקות של הקולטן כדי לעורר תגובה לDHPG. אנחנו השתמשנו בריכוזים שונים של DHPG, כוללים 5 מיקרומטר ו15 מיקרומטר (איור 3), כמו גם 30 מיקרומטר ו50 מיקרומטר (איור 4 א) כדי לסייע בחשיפה לשינויים בקבוצה astrocytic אני mGluRs. מערכת היחסים בין 2 תגובות הסלולר Ca + ורמות ביטוי GQ GPCR כבר נבדקו בעבר במבחנה 21-24. ראשית,סף להגיב לריכוז אגוניסט מסוים תלוי בצפיפות של קולטנים מתבטאים בכל תא. באוכלוסייה של תאים, תאים יותר להגיב בCa 2 + גובה לריכוז מסוים של אגוניסט כאשר התאים transfected עם צפיפות גבוהה יותר של הקולטנים. לאחר דוגרים פרוסות בTTX, אחוז האסטרוציטים באוכלוסייה מגיב לריכוז קבוע של עליות אגוניסט (3B דמויות ו3 ג). מצאנו כי מיקרומטר 5 ו15 מיקרומטר DHPG מגלים הבדלים ברורים בשיעור של האסטרוציטים מגיבים בין השליטה ותאים שטופלו TTX, בעוד 30 ו50 מיקרומטר DHPG נדרש כדי להשוות את תגובות אני mGluR קבוצה ב5.0 מ&quot;מ K + טופל לעומת שליטה תאים (איור 4 א). הקשר בין דפוסי Ca 2 + תגובת astrocytic וריכוז אגוניסט גם נבדק באתרם. הגדלת אגוניסטריכוז מסיט את הדפוס של Ca 2 + בתגובת האסטרוציטים מהשיא יחיד Ca 2 + גבהים לmultipeak ורמה Ca 2 + גבהים 25-27. בהתבסס על ממצאים קודמים אלו, אנו צופים כי דפוס התגובה לריכוז אחד של אגוניסט יעבור אם יש שינויים ברמת ביטוי הקולטן. לכן, תלוי באיזה משתי השיטות דרוג הוא מנוצל (עיכוב ירי עצבי או בהגדלתו), הריכוז של אגוניסט הדרוש כדי לייצר דפוס תגובה מסוים יהיה להגדיל או להקטין. לדוגמא, האסטרוציטים מודגרות בTTX משמרת Ca 2 + דפוס התגובה עוררו DHPG ליותר רמה מסוג Ca 2 + גבהים ולהגיב כדי להוריד את ריכוזי אגוניסט לעומת השליטה האסטרוציטים (איור 3 ג). אם ניקח בחשבון את המחקרים הקודמים, תצפיות אלה מראים כי קבוצת רמות ביטוי הקולטן אני mGluR בהאסטרוציטים גדלה. זמן עלייה והתפרצות (חביון) של Ca 2 + הגבהים גם הוכחו לתאם ישירות לשינויים ברמות ביטוי GQ GPCR בתאים בתרבית 22-24. רמות ביטוי קולט גבוהות יותר לגרום לשיהוי תגובה קצר יותר וזמני עלייה מהירים יותר בעת ירידה בצפיפות הקולטן מייצרת את האפקט ההפוך. להאסטרוציטים מודגרות בTTX, Ca יש 2 + ארעיים עורר על ידי יישום של DHPG באופן משמעותי מהר יותר יעלה פעמים לעומת האסטרוציטים מודגרות בACSF שליטה (איור 3D). כפי שהוזכר קודם לכן, אמפליטודות של Ca 2 + תגובות עוררות אגוניסט תישאר ללא שינוי ללא קשר לריכוז אגוניסט או מודל קנה המידה 15 (איור 3D). בנוסף לשינויים שנצפו ישירות על ידי הפעלת קבוצה אני mGluRs עם DHPG, astrocyte הספונטני Ca 2 + פעילות מושפעת גם באופן משמעותי על ידי מניפולציה זו. אנו צופיםעליית 2.26 פי דה בשיעור של האסטרוציטים פעילים באופן ספונטני מודגרות בTTX לעומת שליטה. זוהי עלייה מרק 12.9% מהאסטרוציטים שליטה מציגים פעילות ספונטנית בסומה ל42.1% בTTX מודגרות האסטרוציטים (איור 3E). כי זה ידוע שפעילות תערוכת GPCRs &quot;מהותית&quot; או מכוננת בהיעדר אגוניסט 21, 26, 28, ושעולה רמת פעילות מהותית זו עם עלייה ברמות ביטוי הקולטן, נתונים אלה מצביעים על כך שהצפיפות של עליות GQ GPCRs astrocytic בעקבות הפחתה ארוך טווח בירי פוטנציאל פעולה עצבית. בדומה לתגובות עוררות אגוניסט, זמני עלייה של Ca 2 + הגבהים ספונטניים גם מוגברים (איור 3E). נציגי נתונים באמצעות הפרוטוקול השני, הדגירה באשלגן החוץ תאי גבוה (5.0 מ&quot;מ), מתואר בFigure 4. עלייה בK תאי + 2.5-5.0 תוצאות מ&quot;מ לעלייה משמעותית בתדירות פעולת נוירון CA3 בסיס פוטנציאל 15. ריכוזים גבוהים יותר של DHPG (30 מיקרומטר ו50 מיקרומטר) הם הכרחיים על מנת לעורר קבוצה אני mGluR Ca 2 + תגובות מהאסטרוציטים מודגרות באשלגן גבוה (איורים 4 א ו -4 ב). זה עולה בקנה אחד עם רמה מופחתת של קבוצת היענות אני mGluR בהאסטרוציטים לאחר עלייה ארוך טווח בפוטנציאל פעולה עצבי. בנוסף, דפוס התגובה עורר לריכוז קבוע של DHPG משמרות מתגובות כמו רמה לתגובות חלשות בודד שיא (איור 4). בוחן את אחוז האסטרוציטים הפעילים באופן ספונטני בשני תנאי אשלגן מגלה כי פחות האסטרוציטים מודגרות גבוה K + הם פעילים באופן ספונטני בהשוואה למצב השליטה (איור 4C). השפעה זו היא בoppositכיוון אלקטרוני של מצב TTX שבה אחוז של האסטרוציטים מציגים 2 + גבהים Ca ספונטניים הוא גדל. אחרון, שניהם עוררו ויש לי Ca 2 + גבהים ספונטניים זמני עלייה איטיים יותר בהאסטרוציטים מודגרות גבוהה K + לעומת מצב השליטה (4C דמויות ו4D). בסך הכל נתונים אלה מראים כי רמות ביטוי GQ GPCR astrocytic סולם bidirectionally בהתאם לרמת פעילות עצבית פוטנציאל פעולה לאורך תקופת זמן ממושכת. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. ייצור תא דגירה פרוס ולהגדיר. () חלק המגירה של מיכל אחסון פיפטה Brinkmann יחד עם מכסה האוויר חזק שלה משמש לבניית תא הדגירה הפרוסה. (ב) דר.י.ל. חור בצד השני של המכל כ ¼ 1 מלמעלה ו¼ מהצד. תתאים בחתיכת צינור גמיש. (ג) חבר את מנגנון microloader-סעפת עד הסוף הפנימי של צינורות גמישים. שים לב לחתוך להתאמת קצה טבעי 200 μl פיפטה (חץ לבן). שש microloaders אפנדורף 20 μl (ד &#39;) הם חתכו להתאמה לסעפת שורה אחת עד שש ליצור מנגנון microloader-סעפת. (ה) מקדחה שני חורים קטנים על המכסה. Rack בועה צף להכנת מחזיק פרוסה (F). (ז) &quot;הרגליים&quot; התחתונה של המתלה הבועה צף יוסרו כך שפיסת חומר רשת ניילון יכולה להיות דבוקה לתחתית. (H) מלא את תא הדגירה עם כמות מספקת של ACSF כך שצף בעל פרוסה. התאם את אורך הצינור ולכן הטיפים של microloaders יכולים לנוח באחת מפינות רצפת החדר. כאשר מניח את תא הדגירה באמבט המים, מפלס המים באמבטיה צריך להיות באותה הרמה כמו ACSF בחדר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. הערכה של בריאות פרוסה. () פרוס בהיפוקמפוס למראה בריאה באמצעות התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) אופטיקה. יש פרוסות בריאים, מראה קטיפתי חלק ואחוז גבוה של נוירונים פירמידליים CA1 בריאים. הערה דנדריטים הפסגה מקרינים לתוך radiatum שכבה. תיקון מהדק של נוירונים שנראים כמו אלה המוצגים כאן חושף פוטנציאל נמוך מנוחת קרום (-61 ל-62 mV) בתקן 2.5 מ&quot;מ K + ACSF עם פוטנציאל פעולה ספונטנית כמה. שיעורי פוטנציאל הממברנה וירי ישתנו כפונקציה של האקסtracellular K + (שיה ואח&#39;. 15). חיצים מצביעים על האסטרוציטים משוערים. קיצורים: SR, radiatum שכבה; s.py., pyramidale שכבה. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. (ב) פרוסות לא בריאים תהיה אחוז גבוה של נוירונים פירמידליים CA1 מתים, שבו יש את המראה של ביצים מטוגנות (חיצים לבנים מצביעים על גרעינים של תאי עצב מתים - &quot;החלמון&quot; של הביצה מטוגנת). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. הקלטה מוגברת פעילות GQ GPCR והקבוצה עוררה אני mGluR Ca 2 + תגובות לאחר עיכוב ארוך טווח של נקודתי גישה עצביות על ידי דגירה בTTX. (א) נציג תמונות של תאים בתחום ההקלטה מודגרות בגontrol תנאים (פנלים העליונים) או בTTX (לוחות נמוכים) שלקחו את אורגון גרין BAPTA-1:00 Ca 2 + צבע מחוון (פנלים משמאל) ו-SR-101 (פנלים באמצע). בר סולם הוא 10 מיקרומטר. כיסוי של שני האותות (&quot;מיזוג&quot;) מצביע על כך שעומס האסטרוציטים עם Ca 2 + מדד. תיבות נמשכות מעל סומה astrocyte בודדת להקליט עוצמת הקרינה לאורך הזמן בערוץ הירוק כדי לפקח על Ca 2 + פעילות בהאסטרוציטים. (ב) עקבות לדוגמא מתיבות ההקלטה ב) של Ca 2 + פעילות בהאסטרוציטים. האסטרוציטים מודגרות במופע TTX מוגבר פעילות ספונטנית וקבוצה עוררה חזקה יותר אני mGluR Ca 2 + תגובות כפי שמעידים שינויים בדפוס התגובה. דוגמאות לשיא יחיד (מעגל), multipeak (מלבן), ומישור (מלבן מקווקו) Ca 2 + הארעיים מוצגות. שינויים (ג) בדפוסי תגובה ניכרים במיוחד באמצעות concent שונהמנות של הקבוצה אני mGluR אגוניסט DHPG. תגובות multipeak ורמה יותר ניכרות לאחר הדגירה בTTX בהשוואה לשליטה בריכוז אגוניסט נתון. (ד) עלייה פעמים של 2 + תגובות Ca עוררו DHPG הם מהירים יותר בהאסטרוציטים מודגרות בTTX בהשוואה לבקרה (פנל עליון), בעוד אמפליטודות לא משתנה (פנל תחתון), מעיד על אמפליטודות תגובה &quot;הכל או לא כלום&quot; פעם אחת כבר הגיע לסף להגיב. (ה) Rise זמנים של astrocyte הספונטני Ca 2 + ארעיים הם גם מהיר יותר בTTX מודגרות לעומת שליטה מודגרות האסטרוציטים (פנל עליון), בעוד שהאחוז של האסטרוציטים באוכלוסייה מציג 2 עליות ספונטניות GQ GPCR Ca + פעילות (פנל תחתון). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 4" fo:content-wiDTH = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; איור 4. astrocytic פחת הקלטת פעילות GQ GPCR וקבוצה עוררה אני mGluR Ca 2 תגובות + בהמשך לעלייה ארוך טווח בנקודתי גישה עצבית על ידי דגירה באשלגן החוץ תאי גבוה. () עקבות נציג astrocyte Ca 2 + הקלטות מפרוסות מודגרות ב5.0 מ&quot;מ K + ACSF לdepolarize נוירונים ולהגדיל את קצב הירי שלהם הבסיסי לעומת השליטה ACSF (2.5 מ&quot;מ K + ACSF). האסטרוציטים הודגרו עם 5.0 תערוכת מ&quot;מ K + ACSF Ca 2 + ארעיים גופני פחות ספונטנית וDHPG החלש עוררו תגובות בהשוואה להאסטרוציטים מודגרות בACSF שליטה. (ב) השוואה של דפוסים עוררו תגובות לריכוזים שונים של DHPG מגלה סוגים חלשים תגובה לאחר עלייה ארוך טווח בנקודתי גישה עצבית. (ג) ירידה בשיעור של האסטרוציטים בפוpulation מציג 2 + Ca פעילות ספונטנית הוא ציין לאחר דגירה ארוך טווח בK גבוה + לעומת השליטה ACSF (פנל עליון), בעוד שזמני עלייה של הפעילות הספונטנית הפכו איטיים יותר (פנל תחתון). (ד) עלייה זמנים של astrocyte עורר Ca 2 + תגובות לריכוזים שונים של DHPG להיות איטי הבא 5.0 טיפול מ&quot;מ K + בהשוואה להאסטרוציטים מודגרות בACSF שליטה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates at JoVE.com

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

כאן אנו מתארים עיבוד של פרוטוקולים המשמשים כדי לגרום פלסטיות homeostatic בנוירונים לחקר הפלסטיות של קולטני G-חלבון בשילוב astrocytic. לאחרונה משמש כדי לבחון שינויים בקבוצת astrocytic אני mGluRs בעכברים לנוער, ניתן ליישם השיטה למדידת קנה מידה של GPCRs astrocytic השונות, ברקמות של עכברים בוגרים באתרו וin vivo, ולקבל הערכה טובה יותר של הרגישות של קולטני astrocytic לשינויים בפעילות עצבית.

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

inducing-plasticity-astrocytic-receptors-manipulation-neuronal-firing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K Views.  University of California Riverside.  כאן אנו מתארים עיבוד של פרוטוקולים המשמשים כדי לגרום פלסטיות homeostatic בנוירונים לחקר הפלסטיות של קולטני G-חלבון בשילוב astrocytic. לאחרונה משמש כדי לבחון שינויים בקבוצת astrocytic אני mGluRs בעכברים לנוער, ניתן ליישם השיטה למדידת קנה מידה של GPCRs astrocytic השו...

Video: Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

הכנת Oligomeric β עמילואיד 1-42 ו אינדוקציה של ירידת ערך הפלסטיות הסינפטית על Slices בהיפוקמפוס

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into diverse subtypes based on their immunochemical, morphological, and physiological properties1-4. Although previous research has revealed much about intrinsic properties of individual types of inhibitory neurons, knowledge about their local circuit connections is still relatively limited3,5,6. Given that each individual neuron's function is shaped by its excitatory and inhibitory synaptic input within cortical circuits, we have been using laser scanning photostimulation (LSPS) to map local circuit connections to specific inhibitory cell types. Compared to conventional electrical stimulation or glutamate puff stimulation, LSPS has unique advantages allowing for extensive mapping and quantitative analysis of local functional inputs to individually recorded neurons3,7-9. Laser photostimulation via glutamate uncaging selectively activates neurons perisomatically, without activating axons of passage or distal dendrites, which ensures a sub-laminar mapping resolution. The sensitivity and efficiency of LSPS for mapping inputs from many stimulation sites over a large region are well suited for cortical circuit analysis.
Here we introduce the technique of LSPS combined with whole-cell patch clamping for local inhibitory circuit mapping. Targeted recordings of specific inhibitory cell types are facilitated by use of transgenic mice expressing green fluorescent proteins (GFP) in limited inhibitory neuron populations in the cortex3,10, which enables consistent sampling of the targeted cell types and unambiguous identification of the cell types recorded. As for LSPS mapping, we outline the system instrumentation, describe the experimental procedure and data acquisition, and present examples of circuit mapping in mouse primary somatosensory cortex. As illustrated in our experiments, caged glutamate is activated in a spatially restricted region of the brain slice by UV laser photolysis; simultaneous voltage-clamp recordings allow detection of photostimulation-evoked synaptic responses. Maps of either excitatory or inhibitory synaptic input to the targeted neuron are generated by scanning the laser beam to stimulate hundreds of potential presynaptic sites. Thus, LSPS enables the construction of detailed maps of synaptic inputs impinging onto specific types of inhibitory neurons through repeated experiments. Taken together, the photostimulation-based technique offers neuroscientists a powerful tool for determining the functional organization of local cortical circuits.

This paper introduces an approach of combining laser scanning photostimulation with whole cell recordings in transgenic mice expressing GFP in limited inhibitory neuron populations. The technique allows for extensive mapping and quantitative analysis of local synaptic circuits of specific inhibitory cortical neurons.

מיפוי מעגלים עצביים מעכבים ידי Photostimulation סריקת הליזר

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

הנובע את מהלך הזמן של חיסול גלוטמט עם ניתוח Deconvolution של זרמי Transporter astrocytic

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

<em&gt; במבחנה</emהכנת שרירים עצבים&gt; עכבר למבוגרים ללימוד מאפייני ירי afferents השריר

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high dose, whereas sequential injections of a subconvulsive dose have been used for the development of chemical kindling, an epilepsy model. A single low-dose injection of PTZ induces a mild seizure without convulsion. However, repetitive low-dose injections of PTZ decrease the threshold to evoke a convulsive seizure. Finally, continuous low-dose administration of PTZ induces a severe tonic-clonic seizure. This method is simple and widely applicable to investigate the pathophysiology of epilepsy, which is defined as a chronic disease that involves repetitive seizures. This chemical kindling protocol causes repetitive seizures in animals. With this method, vulnerability to PTZ-mediated seizures or the degree of aggravation of epileptic seizures was estimated. These advantages have led to the use of this method for screening anti-epileptic drugs and epilepsy-related genes. In addition, this method has been used to investigate neuronal damage after epileptic seizures because the histological changes observed in the brains of epileptic patients also appear in the brains of chemical-kindled animals. Thus, this protocol is useful for conveniently producing animal models of epilepsy.

This protocol describes a method of chemical kindling with pentylenetetrazole and provides a mouse model of epilepsy. This protocol can also be used to investigate vulnerability to seizure induction and pathogenesis after epileptic seizures in mice.

דגם העכבר מתמצקים הנוצרות על-ידי Pentylenetetrazole

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADDs) have become the most popular chemogenetic approach used in modern neuroscience. Most studies deliver the ligand clozapine-N-oxide (CNO) using a single intraperitoneal injection, which is suitable for the acute activation/inhibition of the targeted neuronal population. There are, however, only a few examples of strategies for chronic modulation of DREADD-controlled neurons, the majority of which rely on the use of delivery systems that require surgical intervention. Here, we expand on two non-invasive strategies for delivering the ligand CNO to chronically manipulate neural population in mice. CNO was administered either by using repetitive (daily) eye-drops, or chronically through the animal&#39;s drinking water. These non-invasive paradigms result in robust activation of the designer receptors that persisted throughout the CNO treatments. The methods described here offer alternatives for the chronic DREADD-mediated control of neuronal activity and may be useful for experiments designed to evaluate behavior in freely moving animals, focusing on less-invasive CNO delivery methods.

Here we describe two non-invasive methods to chronically control neuronal activity using chemogenetics in mice. Eye-drops were used to deliver clozapine-N-oxide (CNO) daily. We also describe two methods for prolonged administration of CNO in drinking water. These strategies for chronic neuronal control require minimal intervention reducing animals&#8217; stress.

שאינם פולשנית אסטרטגיות עבור מניפולציה כרונית של פעילות עצבית מבוקרת של הראסטות

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...