Os autores gostariam de agradecer o Centro de UC Riverside para glia neuronais interações para valiosa discussão dos protocolos de escala e dados. Os autores também gostaria de dar um agradecimento sincero você Abcam por patrocinar a publicação de seu trabalho.

<ol>
	<li>Araque, A., Martin, E. D., Perea, G., Arellano, J. I., Buno, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+released+acetylcholine+evokes+Ca2++elevations+in+astrocytes+in+hippocampal+slices.">Synaptically released acetylcholine evokes Ca2+ elevations in astrocytes in hippocampal slices.</a> J. Neurosci. 22, 2443-2450 (2002).</li><li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+mediate+neuron-astrocyte+communication.">Endocannabinoids mediate neuron-astrocyte communication.</a> Neuron. 57, 883-893 (2008).</li><li>Bekar, L. K., He, W., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locus+coeruleus+alpha-adrenergic-mediated+activation+of+cortical+astrocytes+in+vivo.">Locus coeruleus alpha-adrenergic-mediated activation of cortical astrocytes in vivo.</a> Cereb. Cortex. 18, 2789-2795 (2008).</li><li>Hertz, L., Lovatt, D., Goldman, S. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenoceptors+in+brain:+cellular+gene+expression+and+effects+on+astrocytic+metabolism+and+Ca2.">Adrenoceptors in brain: cellular gene expression and effects on astrocytic metabolism and Ca2.</a> Neurochem. Int. 57, 411-420 (2010).</li><li>Porter, J. T., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+astrocytes+in+situ+respond+to+glutamate+released+from+synaptic+terminals.">Hippocampal astrocytes in situ respond to glutamate released from synaptic terminals.</a> J. Neurosci. 16, 5073-5081 (1996).</li><li>Bernardinelli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+display+complex+and+localized+calcium+responses+to+single-neuron+stimulation+in+the+hippocampus.">Astrocytes display complex and localized calcium responses to single-neuron stimulation in the hippocampus.</a> J. Neurosci. 31, 8905-8919 (2011).</li><li>Panatier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+are+endogenous+regulators+of+basal+transmission+at+central+synapses.">Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses.</a> Cell. 146, 785-798 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Ca2++signaling+evoked+by+sensory+stimulation+in+vivo.">Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo.</a> Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).</li><li>Fiacco, T. A., Agulhon, C., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+out+astrocyte+physiology+from+pharmacology.">Sorting out astrocyte physiology from pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 49, 151-174 (2009).</li><li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling+and+Gliotransmission+in+Normal+vs+Reactive+Astrocytes.">Calcium Signaling and Gliotransmission in Normal vs Reactive Astrocytes.</a> Front. Pharmacol. 3, 139 (2012).</li><li>Nedergaard, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artifact+versus+reality--how+astrocytes+contribute+to+synaptic+events.">Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events.</a> Glia. 60, 1013-1023 (2012).</li><li>Nizar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+stimulus-induced+vasodilation+occurs+without+IP3+receptor+activation+and+may+precede+astrocytic+calcium+increase.">In vivo stimulus-induced vasodilation occurs without IP3 receptor activation and may precede astrocytic calcium increase.</a> J. Neurosci. 33, 8411-8422 (2013).</li><li>Sutton, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniature+neurotransmission+stabilizes+synaptic+function+via+tonic+suppression+of+local+dendritic+protein+synthesis.">Miniature neurotransmission stabilizes synaptic function via tonic suppression of local dendritic protein synthesis.</a> Cell. 125, 785-799 (2006).</li><li>Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+synaptic+scaling+induced+by+changes+in+postsynaptic+firing.">Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing.</a> Neuron. 57, 819-826 (2008).</li><li>Xie, A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+scaling+of+astrocytic+metabotropic+glutamate+receptor+signaling+following+long-term+changes+in+neuronal+firing+rates.">Bidirectional scaling of astrocytic metabotropic glutamate receptor signaling following long-term changes in neuronal firing rates.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+calcium.">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiol. Rev. 79, 1089-1125 (1999).</li><li>Petravicz, J., Fiacco, T. A., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+IP3+receptor-dependent+Ca2++increases+in+hippocampal+astrocytes+does+not+affect+baseline+CA1+pyramidal+neuron+synaptic+activity.">Loss of IP3 receptor-dependent Ca2+ increases in hippocampal astrocytes does not affect baseline CA1 pyramidal neuron synaptic activity.</a> J. Neurosci. 28, 4967-4973 (2008).</li><li>Nett, W. J., Oloff, S. H., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+astrocytes+in+situ+exhibit+calcium+oscillations+that+occur+independent+of+neuronal+activity.">Hippocampal astrocytes in situ exhibit calcium oscillations that occur independent of neuronal activity.</a> J. Neurophysiol. 87, 528-537 (2002).</li><li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo.">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, 380-386 (2006).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+101+as+a+specific+marker+of+astroglia+in+the+neocortex+in+vivo.">Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo.</a> Nat. Methods. 1, 31-37 (2004).</li><li>Prezeau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+carboxyl-terminal+domain+of+metabotropic+glutamate+receptor+1+by+alternative+splicing+generate+receptors+with+differing+agonist-independent+activity.">Changes in the carboxyl-terminal domain of metabotropic glutamate receptor 1 by alternative splicing generate receptors with differing agonist-independent activity.</a> Mol. Pharmacol. 49, 422-429 (1996).</li><li>Shao, Y., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+relationship+between+alpha+1-adrenergic+receptor+density+and+the+receptor-mediated+calcium+response+in+individual+astroglial+cells.">Quantitative relationship between alpha 1-adrenergic receptor density and the receptor-mediated calcium response in individual astroglial cells.</a> Mol. Pharmacol. 44, 247-254 (1993).</li><li>Wang, S. S., Thompson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+changes+in+functional+muscarinic+acetylcholine+receptor+density+in+single+neuroblastoma+cells+using+calcium+release+kinetics.">Measurement of changes in functional muscarinic acetylcholine receptor density in single neuroblastoma cells using calcium release kinetics.</a> Cell Calcium. 15, 483-496 (1994).</li><li>Ostasov, P., Krusek, J., Durchankova, D., Svoboda, P., Novotny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++responses+to+thyrotropin-releasing+hormone+and+angiotensin+II:+the+role+of+plasma+membrane+integrity+and+effect+of+G11alpha+protein+overexpression+on+homologous+and+heterologous+desensitization.">Ca2+ responses to thyrotropin-releasing hormone and angiotensin II: the role of plasma membrane integrity and effect of G11alpha protein overexpression on homologous and heterologous desensitization.</a> Cell Biochem. Funct. 26, 264-274 (2008).</li><li>Shelton, M. K., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+astrocytes+exhibit+Ca2+-elevating+muscarinic+cholinergic+and+histaminergic+receptors+in+situ.">Hippocampal astrocytes exhibit Ca2+-elevating muscarinic cholinergic and histaminergic receptors in situ.</a> J. Neurochem. 74, 555-563 (2000).</li><li>Hermans, E., Challiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+signalling+and+regulatory+properties+of+the+group+I+metabotropic+glutamate+receptors:+prototypic+family+C+G-protein-coupled+receptors.">Structural signalling and regulatory properties of the group I metabotropic glutamate receptors: prototypic family C G-protein-coupled receptors.</a> Biochem. J. 359, 465-484 (2001).</li><li>Zur Nieden, R., Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Metabotropic+Glutamate+Receptors+for+the+Generation+of+Calcium+Oscillations+in+Rat+Hippocampal+Astrocytes+In+Situ.">The Role of Metabotropic Glutamate Receptors for the Generation of Calcium Oscillations in Rat Hippocampal Astrocytes In Situ.</a> Cortex. 16 (5), 676-687 (2005).</li><li>de Ligt, R. A., Kourounakis, A. P., AP, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+agonism+at+G+protein-coupled+receptors:+(patho)physiological+relevance+and+implications+for+drug+discovery.">Inverse agonism at G protein-coupled receptors: (patho)physiological relevance and implications for drug discovery.</a> Br. J. Pharmacol. 130, 1-12 (2000).</li><li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+101+induces+long-term+potentiation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+efficacy+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Sulforhodamine 101 induces long-term potentiation of intrinsic excitability and synaptic efficacy in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuroscience. 169, 1601-1609 (2010).</li><li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains.">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging.">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J. Gen. Physiol. 141, 633-647 (2013).</li><li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition.">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat. Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li><li>Fiacco, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+stimulation+of+astrocyte+calcium+in+situ+does+not+affect+neuronal+excitatory+synaptic+activity.">Selective stimulation of astrocyte calcium in situ does not affect neuronal excitatory synaptic activity.</a> Neuron. 54, 611-626 (2007).</li><li>Echegoyen, J., Neu, A., Graber, K. D., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+plasticity+studied+using+in+vivo+hippocampal+activity-blockade:+synaptic+scaling,+intrinsic+plasticity+and+age-dependence.">Homeostatic plasticity studied using in vivo hippocampal activity-blockade: synaptic scaling, intrinsic plasticity and age-dependence.</a> PLoS One. 2, (2007).</li><li>Aguado, F., Espinosa-Parrilla, J. F., Carmona, M. A., Soriano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+regulates+correlated+network+properties+of+spontaneous+calcium+transients+in+astrocytes+in+situ.">Neuronal activity regulates correlated network properties of spontaneous calcium transients in astrocytes in situ.</a> J. Neurosci. 22, 9430-9444 (2002).</li><li>Takata, N., Hirase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+layer+1+and+layer+2/3+astrocytes+exhibit+distinct+calcium+dynamics+in+vivo.">Cortical layer 1 and layer 2/3 astrocytes exhibit distinct calcium dynamics in vivo.</a> PLoS ONE. 3, e2525 (2008).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRET+biosensors+to+study+GPCR+biology,+pharmacology,+and+signal+transduction.">BRET biosensors to study GPCR biology, pharmacology, and signal transduction.</a> Front. Endocrinol. 3 (105), (2012).</li><li>Di Castro, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Ca2++detection+and+modulation+of+synaptic+release+by+astrocytes.">Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes.</a> Nat. Neurosci. 14, 1276-1284 (2011).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-dependent+neuroglial+calcium+signaling+differs+between+young+and+adult.">Glutamate-dependent neuroglial calcium signaling differs between young and adult.</a> Science. 339, 197-200 (2013).</li></ol>

Os autores pretendem revelar que a tetrodotoxina utilizado nestes estudos foi comprado de Abcam. Abcam não teve nenhuma participação nas hipóteses, design, ou coleta de dados. Toda a comunicação sobre o patrocínio da obra por Abcam ocorreu após o processo de revisão por pares foi completa.

Os modelos de dimensionamento descritos representam métodos práticos para a pesquisa de plasticidade de longo prazo do grupo astrocitário eu mGluRs. Geração de imagens espontâneas e evocadas Ca 2 + eventos fornece um ensaio sensível para medir mudanças na atividade astrocitária Gq GPCR, como evidência empresa foi estabelecido que astrócitos Ca 2 + elevações ocorrem após liberação do IP 3 lojas sensível-R jusante da ativação Gq GPCR 10, 12, 17, 18. O percentual de astrócitos na população responder ao grupo I mGluR agonista eo padrão de tais Ca 2 + respostas relatam mudanças no grupo I mGluRs pelos astrócitos. A técnica específica utilizada para carregar os astrócitos com Ca 2 + indicador é uma consideração importante na concepção de ensaios para observar as mudanças na actividade astrocitário Gq GPCR. Bolus de carga ou carregamento a granel vários astrócitos, ou patch-carregamento da braçadeira de astrócitos individuais pode ser utilizado para imagem transientes de Ca 2 + em astrócitos. Cada abordagem oferece certas vantagens e desvantagens. Preenchendo diretamente astrócitos com Ca 2 + indicador via patch clamp permite a identificação inequívoca da célula como um astrócitos, sem necessidade de um marcador secundário, como SR-101. Entrega de patch-clamp de indicador também permite a gravação de Ca 2 + atividade de pequenos compartimentos astrocitárias incluindo os processos de multa espessas, potencialmente mais profundas na fatia onde as células são mais saudáveis ​​e com interações mais intactas com as sinapses (dependendo da potência do laser disponível). No entanto, patch-clamp carregamento sofre com baixa taxa de transferência como os dados são coletados uma célula de cada vez. De carregamento de grandes quantidades, por outro lado, permite que um grande número de astrócitos para ser carregado com Ca2 + indicador e fotografada simultaneamente. No entanto, apenas os astrócitos perto da superfície (&lt;20 mm) da fatia são carregados, com a preocupação associadas sobre a saúde das células e sinapses intactas. O protocolo de bolus de carregamento contrapressão aqui apresentado oferece um meio termo, com relativamente alto rendimento ea capacidade de monitorar Ca 2 + atividade mais profunda dentro da fatia (40-75 mm). Um aumento significativo na percentagem de astrócitos espontaneamente activas utilizando a técnica de bolus de carregamento é observada em relação ao volume de carga, o que sugere que as ligações entre as sinapses neuronais e os processos astrocíticos são mais completa 15. Com boa carga, pode-se frequentemente controlar Ca 2 + na actividade principais processos de astrócitos (dados não mostrados) ou, potencialmente, mesmo compartimentos menores usando microscopia de dois fotões. No entanto, os cuidados que precisam ser exercido em atribuir os processos menores para um astrocyte particular, como os limites mistura no fundo não específica coloração. Uma preocupação adicional com o uso de procedimentos de grandes quantidades de carga ou bolus de carregamento é a necessidade de um mar secundárioker para identificação dos astrócitos. Embora tenha sido conhecida há muitos anos que os astrócitos preferencialmente ocupam AM éster Ca 2 + indicadores, o marcador secundário SR-101 é frequentemente usado para verificar as células carregadas como astrócitos. SR-101 pode, por si só alterar a excitabilidade de neurónios intrínsecos 29. O uso de SR-101 corrobora a necessidade de realizar todos os Ca 2 + medições de astrócitos em TTX para limitar possíveis SR-101 efeitos sobre a excitabilidade neuronal. Supondo-se que ambos os grupos controle e experimentais incluem SR-101, o marcador em si não deve contabilizar os efeitos observados em astrócitos Ca 2 + sinalização seguintes manipulação de longo prazo dos potenciais de ação neuronais. SR-101 pode ser mais uma preocupação em alta K + experiências, no entanto, uma vez que pode reduzir a diferença entre os 2,5 mM de K + vs 5,0 mM K + se a taxa de disparo basal não é alterado proporcionalmente. Uma abordagem muito promissora para entregar Ca 2 + </sup&gt; Indicador de astrócitos surgiu recentemente, que oferece uma alternativa atraente para as abordagens mais tradicionais usando Ca 2 + corantes. Avanços significativos têm sido feitos ao longo dos últimos anos, com indicadores de cálcio geneticamente codificados (Gecis) direcionados para os astrócitos 30-32. Gecis pode ser entregue a astrócitos in vivo por microinjecção de vectores virais adeno-associados para uma região do cérebro de interesse, tais como o hipocampo. Expressão de Gecis é alcançada após cerca de duas semanas após a infecção viral 32. Há inúmeras vantagens oferecidas pela utilização de Gecis nos astrócitos. Em primeiro lugar, os vetores são direcionados para os astrócitos, utilizando um promotor específico do astrócitos, por isso as células marcadas são astrócitos 32. Em segundo lugar, o ruído de sinal-para-agora parece comparável com o que pode ser obtido usando a entrega de patch-clamp de corante, mas sem a capacidade de invasão de ter tido uma pipeta patch na célula 32. Em terceiro lugar, os indicadores podem ser delivered e expressa em tecidos adultos, o que é problemático usando métodos de entrega em massa-carga. Além disso, a expressão é mosaico, oferecendo a capacidade de diferenciar entre as várias astrócitos. Assim, vários astrócitos podem potencialmente ser trabalhada ao mesmo tempo, e ao mesmo tempo de gravação no soma e Branchlets finas, ao mesmo tempo. Portanto, potencialmente uma técnica simples pode ser usado no lugar de três técnicas diferentes (massa de carregamento, bolus de carregamento, e patch-clamp de carga) para gravar a atividade de escala de GPCRs Gq astrocitárias, aumentando significativamente a eficiência. Uma desvantagem potencial do uso de entrega viral mediada de Ca 2 + indicadores de astrócitos é o possível efeito sobre a fatia de saúde 32. Os vectores virais adeno-associados utilizados para entregar as Gecis ter sido mostrado previamente para causar a gliose reactiva de 33 astrócitos. Preparação de fatias do cérebro em geral provavelmente inicia estágios iniciais da patologia, incluindo liberação de inflammatory moléculas 10. Portanto, combinado com o tempo de incubação longos necessários para induzir a descamação de receptores astrocíticos, utilização de Gecis entregues utilizando vectores virais que necessitam de receber consideração adicional no contexto da fatia de saúde nestes tipos de experiências. Quando se emprega este protocolo, é importante ter em mente que o tempo de aplicação para o agonista para produzir uma resposta irá variar em função da disponibilidade de receptor. Para uma dada concentração do agonista, o tempo de aplicação terá de ser mais longo, se os receptores têm reduzida, e mais curtos, se os receptores têm ampliados, para a droga para alcançar uma concentração suficiente no tecido para activar os receptores suficientemente para produzir um Ca2 + resposta. Portanto, os tempos de aplicação de droga, e, potencialmente, as suas concentrações, pode ter de ser ajustado, dependendo da direcção pretendida para o dimensionamento. Por exemplo, a concentração de agonista pode ter de ser reduzido no case de TTX para evitar a saturação respostas, e aumentou após a incubação fatias em alto K + até mesmo ver uma resposta. Especificamente, a concentração de DHPG foi deslocado 5-15 fiM após o tratamento TTX 30-50 uM após tratamento 5,0 mM de K +, a fim de estudar de Ca 2 + os padrões de resposta, tal como de 5-15 uM é muitas vezes demasiado baixa para produzir respostas em fiáveis astrócitos após a escala para baixo do grupo I mGluRs. Gravação de astrócitos Ca 2 + atividade fornece nenhuma evidência direta de inserção receptor ou internalização de ou para a membrana plasmática. No entanto, com base na similaridade notável dos dados com os dados de estudos anteriores in vitro que examinaram a relação direta entre os níveis de expressão Gq GPCR e espontânea e evocadas Ca 2 + transientes 21-24, a interpretação mais lógica das mudanças em Ca 2 + sinalização é que os níveis de expressão dos receptores de superfície de astrócitos têmalterados. Uma abordagem complementar pode ser uma consideração importante quando se quer fornecer evidências adicionais sobre o locus do efeito sobre o Ca 2 + atividade. Uma estratégia que usamos foi examinar o efeito de TTX incubação em fatias de hipocampo de ratos MrgA1R astrocitárias. Estes ratos transgênicos expressar uma Gq GPCR estrangeira (o MrgA1R) só nos astrócitos. Porque este não é o receptor nativo para o cérebro, não há neurotransmissor endógeno presente para alterar os seus níveis de actividade. Trabalho anterior sugeriu que este receptor envolve o mesmo intracelular moléculas de sinalização como grupo endógeno I mGluR nas mesmas astrócitos 34. Após incubação a longo prazo das fatias de ratinhos MrgA1R em TTX, não há diferenças nas respostas MrgA1R evocada por agonista, em comparação com o controlo de ninhada incubadas fatias poderia fornecer provas de que o efeito em astrócitos de Ca 2 + a actividade é devida a variações localizadas para o receptor da superfície, especialmente se as respostas do grupo I mGluR ainda são signifivamente melhorado nos mesmos astrócitos. Uma alternativa, no entanto estratégia talvez mais envolvido seria isolar astrócitos das fatias para análise de Western blot, enquanto uma fracção de membrana pode ser analisado para alterações nos níveis de expressão dos receptores de superfície. Fluorescência ativado celular (FACS) ou citometria de fluxo pode ser útil aqui. As possíveis aplicações desta técnica para o estudo de neurónios, astrócitos e interacções astrócitos neuronal são muitos. Em nossos experimentos, único grupo DHPG evocadas eu mGluR foram estudados astrocitárias Ca 2 + respostas, em fatias de hipocampo agudas isoladas de ratos juvenis. Esta preparação não só tem as aferentes intactos (efeitos colaterais Schaffer), mas também os neurônios que dão origem a eles (células piramidais CA3), tornando-se possível manipular as taxas de disparo desses neurônios glutamatérgicos sobre as células pós-sinápticas (células piramidais CA1) e astrócitos no estrato radiatum cujos processos assoenviar um e com estas sinapses. A fatia do hipocampo aguda pode não ser a melhor preparação para a manipulação de taxas de disparo de outros tipos de neurônios, no entanto, como muitos aferentes são cortados a partir dos neurônios que dão origem a eles. No entanto, pode ser possível, em certas preparações fatia observar plasticidade de outros subtipos Gq GPCR astrocíticos. Por exemplo, as fatias podem ser preparados com os neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal e suas projeções para hipocampo intacto. A incubação dessas fatias em TTX ou elevada K + afetaria taxas de disparo dos neurônios colinérgicos basais, levando a descamação dos receptores muscarínicos em astrócitos de oriens estrato, que recebem uma parcela significativa da entrada colinérgica 1. Uma alternativa abordagem ainda não testados para estudar o dimensionamento do receptor astrocitário dentro de uma área específica do cérebro, com todas as ligações intactas, enquanto ocorre escamação, poderia ser a utilização de um modelo in vivo, onde uma libertação prolongada de TTX é conseguido por implantação de um plastpolímero ic Elvax 40W acima da região de interesse 35. Esta abordagem tem sido usada anteriormente em um estudo de escalonamento neuronal, mas também deve ser aplicável a descamação astrocitária. Finalmente, com a leitura adequada, estudos futuros poderiam examinar outras famílias GPCR, incluindo mudanças na L s ou L i GPCRs. Alguém poderia prever astrocitário GABA B G i GPCRs a ser afetado com a inibição do disparo no local projetando interneurônios GABA dentro de qualquer preparação fatia. Desenvolvimento de novos indicadores que visam outras moléculas sinalizadoras, como um indicador de tempo real do segundo acampamento mensageiro, abriria toda uma nova área de pesquisa sobre comunicação neurônio receptor-a-astrócitos. Escamação bidireccional de mGluRs astrocíticos por manipulação das taxas de queima neurónios basais fornece uma medida da sensibilidade dos astrócitos para libertação AP-mediada de neurotransmissor. Os astrócitos aparentemente pode sentir APs espontâneos e glutamatoliberação te a garantia Schaffer-CA1 sinapses celulares piramidal mesmo quando extracelular K + está dentro de uma faixa fisiológica. Embora a aplicação aguda da TTX não reduz a freqüência de astrócitos espontânea Ca 2 + actividade 18, 36, 37, o Ca 2 + atividade entre os astrócitos na população torna-se decorrelated 36, fornecendo evidências de que os receptores astrocitárias são detectores de AP. Isto sugere que os astrócitos sentir APs neuronal espontânea sem afetar em seu Ca 2 + actividade global. É amplamente aceito que as concentrações intracelulares de IP 3 precisa atingir um nível de limiar para estimular IP 3 Rs suficiente para levar a uma detectável Ca 2 + elevação. Poderia APs neuronal espontânea ativar GPCRs astrocitárias sem produzir mensuráveis ​​Ca 2 + elevações? Estudos futuros poderão utilizar fluorescência Resonance Energy Transfer (FRET) ou um tecnol semelhante<html> ique (tais como BRET) para analisar a relação entre a proteína G de acoplamento ao receptor (uma medida da activação do receptor) e Ca 2 + de libertação das reservas internas. BRET tem sido amplamente utilizado para a detecção in vitro de proteína G-a-GPCR de acoplamento 38, embora possa haver algum tempo antes de esta tecnologia esteja disponível para utilização em preparações de tecidos intactos. É possível que GPCRs Gq astrocitárias estão sendo ativados com muito mais freqüência do que pode ser gravado usando as ferramentas de Ca 2 + de imagem atualmente disponíveis. Além de sentir os potenciais de ação, GPCRs Gq astrocitárias também pode ser capaz de detectar liberação quântica miniatura de neurotransmissores como relatado em um estudo recente 39. O método de escalonamento bidireccional aqui descrito pode ser utilizado em estudos futuros para fornecer uma medida da extensão em que os GPCRs astrocitário Gq detectar libertação vesicular quântico de neurotransmissor, incluindo bafilomicina A1 no protocolo de incubação. ntent &quot;&gt; Até aqui, os protocolos de dimensionamento apenas têm sido utilizadas em fatias de hipocampo de ratinhos jovens (p12-p18). Portanto, é actualmente desconhecido se o dimensionamento do receptor astrocitário também podia ser induzida em tecidos obtidos a partir de ratinhos adultos. Um estudo recente convincente sugere que a expressão grupo I de mGluR em astrócitos diminui consideravelmente após a primeira semana de idade e continua a descer até à idade adulta, com níveis muito baixos de expressão do receptor nos astrócitos adultos 40. Assim, seria interessante determinar se os mGluRs astrocíticos intensificar seguinte longo inibição prazo de disparo neuronal em fatias do hipocampo do rato adulto para níveis próximos aos observados em astrócitos de ratos juvenis. Este achado sugere que a expressão do receptor astrocitário não é estática a uma determinada idade, mas podem mudar rapidamente, dependendo de níveis de atividade neuronal. Em contraste com expressão reduzida de mGluRs grupo I em ratos adultos, estão surgindo evidências que os receptores adrenérgicos, incluindo &amp; #945, 1A, 2A α, e β subtipos 1, são predominantemente expressos por astrócitos no cérebro adulto 3, 4. O adrenérgicos α 1A Gq GPCR pode ser um alvo atraente para futuros estudos de comunicação neurônio-a-astrócitos, inclusive se esses receptores são sensíveis a mudanças nas taxas de disparo dos neurônios adrenérgicos.

Os astrócitos responder em segundos a estimulação dos neurônios ou axônios neuronais com o aumento do Ca 2 + citoplasmático resultantes quase exclusivamente da ativação de GPCRs Gq astrocitárias. Por exemplo, os receptores de acetilcolina muscarínicos 1, 2 receptores de canabinóides, receptores adrenérgicos α 1A 3, 4 e grupo I mGluRs (veja abaixo) são todos os subtipos astrocitárias Gq GPCR que agudamente respondem à atividade neuronal. A activação do grupo astrocitário I mGluR foi demonstrado mais extensivamente, após a estimulação de aferentes glutamatérgicos neuronais in situ (tal como fatias de hipocampo agudas) 5-7, assim como no córtex do rato adulto in vivo após estimulação sensorial 8. O resultado da ativação de astrócitos Gq GPCR sinalização sobre a biologia e fisiologia dos astrócitos, neurônios, ou interações astrócitos-neurônios tem sido uma questão de debate 9-12. Será some tempo antes que a função de sinalização do receptor do neurônio-a-astrócitos é totalmente apreciado. Embora seja claro que os neurônios podem ativar receptores astrocitárias usando protocolos experimentais, existem aspectos da comunicação neurônio-a-astrócitos receptor que permanecem pouco conhecidos. Em primeiro lugar, a quantidade real de actividade neuronal requerida para activar astrocitário Gq GPCRs não é bem definida, e em segundo lugar, a capacidade dos receptores astrocíticos para expor dependente de utilização plasticidade tem recebido pouca atenção. Para começar a responder a estas questões, que recentemente desenvolveu um protocolo para induzir a descamação bidirecional de grupo astrocitário I mGluRs em fatias de hipocampo juvenis agudos em resposta às mudanças de longo prazo no potencial de ação neuronal (AP)-dependentes atividade sináptica. À semelhança do que foi descoberto para a plasticidade homeostático bidirecional de receptores de glutamato ionotrópicos neuronais 13, 14, grupo astrocitário eu mGluRs expandir as following bloqueio de potenciais de ação neuronais e escala para baixo quando a ação neuronal freqüência potencial é aumentado 15. Estas alterações de compensação em receptores astrocíticos pode ser medido através da gravação espontânea e evocada astrócitos transientes de Ca 2 + e comparação das propriedades destes eventos para aqueles a partir de astrócitos em condições de controle. Neste artigo, descrevemos a metodologia completa para o uso deste protocolo, incluindo a preparação de fatias do hipocampo, condições agudas de incubação para induzir a descamação receptor astrócitos, astrócitos Ca 2 + indicador corante de carregamento, Ca 2 + técnicas de imagem por meio de microscopia confocal e efeitos esperados em astrócitos atividade Gq GPCR. Previsíveis efeitos em astrócitos Ca 2 + propriedades de sinalização - que correspondam às registradas previamente em pilhas cultivadas transfectadas com diferentes níveis de GPCRs Gq de expressão - fornecer um &quot;roteiro&quot;, que pode ser usado em estudos futuros para analisar mudanças em comoexpressão GPCR trocytic. As ramificações e aplicações potenciais para o uso desta técnica irá contribuir para a nossa compreensão das interações astrócitos-neurônios no cérebro saudável e doente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Chamber Supplies</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:163px;">Brinkmann pipette storage container</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">03-491</td>
			<td style="width:159px;">Use the drawer portion as the incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:163px;">Electrical drill</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Flexible tubing</td>
			<td style="width:135px;">Tygon</td>
			<td style="width:131px;">R-3603</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Silicone seam sealant&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">Also called aquarium seam sealer</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Gas tank</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">95% oxygen, 5% carbon dioxide</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">Natural beveled pipette tip</td>
			<td style="width:135px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:131px;">1111-1000</td>
			<td style="width:159px;">Cut-to-fit to connect oxygenate lines</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">One-to-six lines manifold</td>
			<td style="width:135px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:131px;">64-0210 &#160;(MP-6)</td>
			<td style="width:159px;">For the microloader-manifold apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="65" rowspan="2" style="height:65px;width:163px;">Eppendorf microloader</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Eppendorf</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">5242 956.003</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit</td>
		</tr>
		<tr height="6">
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Floating Bubble Rack</td>
			<td style="width:135px;">Bel Art Scienceware</td>
			<td style="width:131px;">F18875-0400</td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">600 micron Sefar Nitex nylon mesh</td>
			<td style="width:135px;">ELKO filtering Co.</td>
			<td style="width:131px;">&#160;06-600/51</td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Krazy Glue</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:135px;">Baxter</td>
			<td style="width:131px;">1001936060</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">NaCl</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S271-3</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:163px;">KCl</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">P333-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:163px;">CaCl2</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">C79-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:163px;">MgCl2</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">M33-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:163px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S369-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S233-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:131px;">53188-07-1</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:131px;">401471000</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Tetrodotoxin citrate (TTX)</td>
			<td style="width:135px;">Ascent Scientific</td>
			<td style="width:131px;">Asc-055</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Sulforhodamine 101 (SR-101)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">284912</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">D128-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Pluronic Acid F-127</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td style="width:131px;">P6867</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:163px;">Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging)</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td style="width:131px;">O6807</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">(RS)-3,5-DHPG</td>
			<td style="width:135px;">Ascent</td>
			<td style="width:131px;">Asc-020</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Histamine</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">H7125</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">Carbamoylcholine chloride (Carbachol)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">C4382</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:163px;">Adenosine 5&#8217;-ATP disodium (Na-ATP)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A7699</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Dissection Tools</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Single-edge razor blade&#160;</td>
			<td style="width:135px;">GEM</td>
			<td style="width:131px;">62-0161</td>
			<td style="width:159px;">For bisection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Double edge razor blade</td>
			<td style="width:135px;">TED PELLA, INC.</td>
			<td style="width:131px;">121-6</td>
			<td style="width:159px;">For cutting slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Mayo Scissors, supercut</td>
			<td style="width:135px;">WPI</td>
			<td style="width:131px;">14010-15</td>
			<td style="width:159px;">For decapitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Fine iris scissors, straight</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">14094-11</td>
			<td style="width:159px;">For cutting the skull</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Iris forceps, curved</td>
			<td style="width:135px;">WPI</td>
			<td style="width:131px;">15915</td>
			<td style="width:159px;">To remove the skin and skull</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:163px;">Small spatula</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">To remove/transfer the brain</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">11295-10</td>
			<td style="width:159px;">For hippocampus dissection</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Glass Pasteur pipette</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">13-678-20B</td>
			<td style="width:159px;">For transferring brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Pasteur pipette rubber bulb</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">03-448-22</td>
			<td style="width:159px;">For transferring brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Polystyrene 100-mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">25020</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Equipment</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Vibratome</td>
			<td style="width:135px;">Leica</td>
			<td style="width:131px;">VT 1200S</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="23" rowspan="2" style="height:23px;width:163px;">Water bath</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Fisher</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">ISOTEMP 210</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For warm incubation</td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:163px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:135px;">Narishige</td>
			<td style="width:131px;">PC-10</td>
			<td style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:131px;">Olympus Fluoview 1000</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:163px;">Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform</td>
			<td style="width:135px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:131px;">RC-26GLP</td>
			<td style="width:159px;">diamond bath with low profile</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Borosilicate glass pipette</td>
			<td style="width:135px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:131px;">TW150F-4</td>
			<td style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="25" rowspan="2" style="height:25px;width:163px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Sutter instrument</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">ROE-200</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:163px;">Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 &#181;m cellulose acetate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Costar</td>
			<td style="width:131px;">8161</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing plasticity of astrocytic receptors by manipulation of neuronal firing rates

Perto de duas décadas de pesquisa estabeleceu que os astrócitos in situ e in vivo expressar inúmeros receptores acoplados à proteína G (GPCRs) que podem ser estimulados pelo transmissor neuronalmente-lançado. No entanto, a capacidade dos receptores astrocitárias para expor plasticidade em resposta a mudanças na atividade neuronal tem recebido pouca atenção. Aqui, descrevemos um sistema modelo que pode ser usado para escalonar globalmente para cima ou para baixo grupo astrocíticos que os receptores de glutamato metabotrópicos (mGluRs) em fatias cerebrais agudas. Estão incluídos os métodos de como preparar fatias de hipocampo parassagitais, construir aposentos adequados para a incubação fatia de longo prazo, bidirectionally manipular ação neuronal potencial de freqüência, astrócitos de carga e processos de astrócitos com fluorescente Ca 2 + indicador, e medir as mudanças na atividade Gq GPCR astrocitário por gravação astrócitos espontâneas e evocadas Ca 2 + eventos usando microscopia confocal. Em essência, um &quot;r cálciooadmap &quot;é prevista como medir a plasticidade de GPCRs Gq astrocitárias. São discutidas aplicações da técnica para o estudo dos astrócitos. Ter uma compreensão de como a sinalização do receptor astrocitária é afetada por mudanças na atividade neuronal tem implicações importantes tanto para a função sináptica normal, assim como os processos subjacentes distúrbios neurológicos e doenças neurodegenerativas.

Os resultados representativos na Figura 3 mostra o efeito da incubação de fatias do hipocampo do rato agudas em TTX para 4-6 horas em astrócitos sr Ca 2 + actividade. Os dados incluem tanto espontâneas Ca 2 + transientes e grupo DHPG evocadas eu mGluR Ca 2 + respostas, a partir de fatias incubadas no controle ACSF vs ACSF mais TTX. Para além de características morfológicas características básicas, a montagem processo stellate e pequeno tamanho físico (~ 10 mM), os astrócitos são identificados na sr por sobreposição do Ca 2 + indicador OGB-01:00 com o marcador de astrócitos selectiva SR-101 19, 20 ( Figura 3A). As caixas numeradas mais de corpos celulares de astrócitos corresponde à fluorescência numeradas sobre traços de tempo mostrado na Figura 3B. O agonista de mGluR do grupo 1 (RS)-3.5-DHPG é aplicado para determinar os efeitos de dimensionamento específicos no grupo 1 mGluRs em astrócitos. Para discriminar entre physiology na especificidade do efeito de escala para os mGluRs do grupo 1, versus outros GPCRs Gq, um cocktail de agonistas é aplicado no final de cada experiência. Aqui utilizou-se 10 ^ M de cada de Gq GPCR agonistas de histamina, cloreto carbamilcolina (carbacol) e adenosina-5&#39;-ATP dissódico (Na-ATP). O coquetel de agonista também serve como um controlo positivo para identificar, os astrócitos reactivos viáveis ​​nos casos em que as células não respondem a DHPG, presumivelmente porque estas astrócitos particulares não expressam quantidades suficientes do receptor para induzir uma resposta a DHPG. Foram utilizados diferentes concentrações de DHPG, incluindo 5 uM e 15 uM (Figura 3B), bem como 30 uM e 50 uM (Figura 4A) para ajudar a revelar alterações no grupo astrocitária I mGluR. A relação entre Ca 2 + respostas celulares e os níveis de expressão Gq GPCR foi examinado anteriormente in vitro 21-24. Em primeiro lugar, olimiar de resposta a um agonista em particular a concentração depende da densidade de receptores expressos por cada célula. Em uma população de células, mais as células respondem com um Ca2 + elevação para uma dada concentração de agonista quando as células são transfectadas com maiores densidades de receptores. Após a incubação as fatias em TTX, a percentagem de astrócitos na população de responder a uma concentração fixa de agonistas aumentos (figuras 3B e 3C). Verificou-se que 5 uM e 15 uM DHPG revelam diferenças óbvias na percentagem de astrócitos reactivos entre o controlo e as células tratadas TTX, enquanto que 30 e 50 uM DHPG são necessários para comparar as respostas de grupo I de mGluR em 5,0 mM de K + tratados vs controle células (Figura 4A). A relação entre os padrões de Ca 2 + resposta astrocitárias e concentração agonista também foi examinada in situ. Aumentando o agonistaconcentração muda o padrão do Ca 2 + resposta em astrócitos de pico único Ca 2 + elevações para multipeak e planalto Ca 2 + elevações 25-27. Com base nestas descobertas anteriores, previmos que o padrão de resposta a uma única concentração de agonista mudará se houver alterações no nível de expressão do receptor. Assim, dependendo de qual dos dois métodos de escala está a ser utilizado (inibindo o disparo neuronal ou aumentando-a), a concentração de agonista necessária para produzir um padrão de resposta particular irá aumentar ou diminuir. Por exemplo, os astrócitos foram incubadas em TTX deslocar sua DHPG evocadas Ca 2 + padrão de resposta a mais platô do tipo Ca 2 + elevações e responder a reduzir as concentrações de agonista, em comparação com o controle astrócitos (Figura 3C). Tendo em conta estudos anteriores, estas observações sugerem que o I mGluR os níveis de expressão do receptor em astrócitos grupo aumentou. Tempo de subida e início (latência) dos Ca 2 + elevações também foram mostrados para correlacionar diretamente a mudanças nos níveis de expressão Gq GPCR em células cultivadas 22-24. Níveis mais elevados de expressão do receptor de resultar em menores latências de resposta e tempos de subida mais rápido enquanto que a redução na densidade do receptor produz o efeito oposto. Para astrócitos incubados em TTX, Ca 2 + transientes evocadas pela aplicação de DHPG têm significativamente mais rápido subir vezes em comparação com os astrócitos incubados no controle ACSF (Figura 3D). Como mencionado anteriormente, as amplitudes das respostas de Ca 2 + evocada por agonista permanecem inalterados, independentemente da concentração de agonista ou o modelo de escalonamento 15 (Figura 3D). Além das mudanças observadas pelo grupo ativando diretamente eu mGluRs com DHPG, astrócitos espontânea Ca 2 + atividade também é afetada significativamente por esta manipulação. Observamosda aumento de 2,26 vezes na percentagem de astrócitos espontaneamente activos incubadas em TTX versus controlo. Isso representa um aumento de apenas 12,9% dos astrócitos de controle exibindo atividade espontânea na soma para 42,1% no TTX incubadas astrócitos (Figura 3E). Porque é sabido que a actividade GPCR exposição &quot;intrínseco&quot; ou constitutiva na ausência de agonista de 21, 26, 28, e que o nível de esta actividade intrínseca aumenta com o aumento dos níveis de expressão do receptor, estes dados sugerem que a densidade de astrocíticos Gq GPCRs aumentos seguinte redução longo prazo ação neuronal potencial fuzilamento. Similar às respostas evocadas por agonistas, os tempos de subida dos espontâneos Ca 2 + elevações são também aumentou (Figura 3E). Dados representativos utilizando o segundo protocolo, incubação em potássio extracelular elevada (5,0 mM), está representado na Figura 4. Um aumento em K + extracelular 2,5-5,0 resultados mM em um aumento significativo na acção basal neurónio CA3 potencial de frequência 15. As concentrações mais elevadas de DHPG (30 uM e 50 uM) são necessárias com o fim de provocar o grupo I de mGluR de Ca 2 + as respostas a partir dos astrócitos incubados em elevada de potássio (Figuras 4A e 4B). Isto é consistente com um nível reduzido de mGluR do grupo I, a capacidade de resposta em astrócitos seguindo um aumento de longa duração em potenciais de acção neuronais. Além disso, o padrão de resposta evocada a uma concentração fixa de DHPG muda de respostas do tipo plataforma para respostas mais fracas de um único pico (Figura 4B). Examinando o percentual de astrócitos espontânea ativos nas duas condições potássio revela que menos astrócitos incubados em alta K + são espontânea ativa em relação à condição controle (Figura 4C). Este efeito é na opposite direcção da condição TTX em que a percentagem de astrócitos exibem espontânea de Ca 2 + elevações é aumentada. Por último, tanto evocado e espontâneas Ca 2 + elevações têm tempos de subida mais lenta em astrócitos incubados em relação à condição controle (Figuras 4C e 4D) de altura K +. Globalmente, estes dados sugerem que os níveis de expressão astrocitárias Gq GPCR escama bidirecional, dependendo do nível de ação neuronal atividade potencial ao longo de um período de tempo prolongado. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Fabricação Slice câmara de incubação e configurar. (A) A parte de gaveta de um recipiente de armazenamento pipeta Brinkmann, juntamente com a tampa hermeticamente fechado é usado para construir a câmara de fatia incubação. (B) Drill um furo no lado do recipiente de cerca de 1 ¼ a partir do topo e ¼ a partir do lado. Coloque em um pedaço de tubo flexível. (C) ligação ao aparelho microloader-colector para a extremidade interior da tubagem flexível. Nota cut-to-ajuste natural ponta da pipeta de 200 mL (seta branca). (D) Seis 20 ul microloaders Eppendorf são cortadas-para-ajuste a um colector de linha de um a seis para criar um aparelho microloader-colector. (E) Faça dois pequenos furos na tampa. (F) A cremalheira da bolha flutuante para fazer o suporte da fatia. (G) As &quot;pernas&quot; inferiores da cremalheira bolha flutuante são removidos de modo a que um pedaço de material de malha de nylon pode ser colada à parte inferior. (H) Encha a câmara de incubação com quantidade suficiente de ACSF para que os carros alegóricos titular fatia. Ajuste o comprimento da tubulação de modo que as pontas dos microloaders pode descansar em um canto do chão da câmara. Ao colocar a câmara de incubação ema água do banho, o nível da água no banho deve estar no mesmo nível que o ACSF na câmara. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Estimativa da fatia de saúde. (A) Uma fatia do hipocampo com aparência saudável usando diferencial interferência contraste (DIC) óptica. Fatias saudáveis ​​têm uma aparência aveludada e uma alta porcentagem de neurônios piramidais CA1 saudáveis. Observe as dendrites apicais projetando em estrato radiatum. Patch-clamp de neurônios que se parecem com os apresentados aqui revelam um potencial de repouso baixa (-61 a -62 mV) no padrão de 2,5 mM K + ACSF com poucos potenciais de ação espontânea. O potencial de membrana e de queima taxas vão variar em função do exintracelular de K + (Xie et al. 15). As setas apontam para os astrócitos putativos. Abreviações: sr, estrato radiatum; s.py., estrato pyramidale. Barra de escala, 10 ^ m. (B) fatias insalubres terá uma alta porcentagem de neurônios piramidais CA1 mortos, que têm a aparência de ovos fritos (setas brancas apontam para núcleos de neurônios mortos - a &quot;gema&quot; do ovo frito). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Gravação amplificado actividade de GPCR e Gq grupo evocado I de mGluR de Ca 2 + respostas após a inibição de longo prazo de APs neuronais por incubação em TTX. (A) Imagens representativas de células no campo de gravação incubadas em control condições (painéis superiores) ou em TTX (painéis inferiores) que assumiram Oregon Verde BAPTA-1 AM Ca 2 + corante indicador (painéis à esquerda) e SR-101 (painéis de média). A barra de escala representa 10 um. Sobreposição de ambos os sinais (&quot;merge&quot;) indica que a carga astrócitos com Ca 2 + indicador. As caixas são desenhadas sobre soma astrocyte indivíduo para registrar a intensidade de fluorescência ao longo do tempo no canal verde para monitorar Ca 2 + atividade em astrócitos. (B) os vestígios de amostra das caixas registradoras em A) de Ca 2 + atividade nos astrócitos. Os astrócitos incubados em TTX mostram aumento da atividade espontânea e evocada grupo mais robusto eu mGluR Ca 2 + respostas como evidenciado por mudanças no padrão de resposta. Exemplos de pico único (círculo), multipeak (retângulo) e planalto (retângulo pontilhado) Ca 2 + transientes são mostrados. (C) As mudanças nos padrões de resposta são especialmente evidentes usando concent diferenterações do grupo I mGluR agonista DHPG. Mais multipeak planalto e respostas são evidentes após incubação em TTX em comparação com o controlo de uma determinada concentração de agonista. (D) Aumento tempos de Ca 2 + respostas DHPG-evocadas são mais rápidos em astrócitos incubados em TTX em relação ao controle (painel superior), enquanto amplitudes não mudam (painel inferior), indicativo de &quot;tudo-ou-nada&quot; amplitudes de resposta, uma vez o limiar de resposta foi atingido. (E) Aumento tempos de astrócitos espontânea de Ca 2 + transientes também são mais rápidos em TTX incubadas vs controle incubadas astrócitos (painel superior), enquanto o percentual de astrócitos na população exibindo espontâneas Gq GPCR Ca 2 + atividade aumenta (painel inferior). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width = &quot;6 pol&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 4. Gravação astrocitário diminuída atividade Gq GPCR e de grupo evocou eu mGluR Ca 2 + respostas seguintes aumento a longo prazo em APs neuronais por incubação em potássio extracelular elevada. (A) os traços representativos dos astrócitos Ca 2 + gravações de fatias incubadas em 5,0 mM K + ACSF para despolarizar neurônios e aumentar a sua taxa de disparo basal em relação ao controle ACSF (2,5 mM K + ACSF). Os astrócitos incubados com 5,0 mM K + ACSF exposição menos espontâneas somáticas Ca 2 + transientes e mais fraco DHPG respostas evocadas em comparação com os astrócitos incubados no controle ACSF. (B) uma comparação de padrões de respostas evocadas para várias concentrações de DHPG revela tipos de respostas mais fracas após crescimento a longo prazo em APs neuronais. (C) A redução no percentual de astrócitos no população exibindo espontânea de Ca 2 + observa-se a actividade após incubação a longo prazo em elevado K + comparado com o controlo ACSF (painel superior), enquanto que tempos de subida da actividade espontânea tornar mais lento (painel inferior). (D) Aumento tempos de astrócitos evocado Ca 2 + respostas a diferentes concentrações de DHPG ficar mais lenta após 5,0 mM K + tratamento em comparação com os astrócitos incubados no controle ACSF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates at JoVE.com

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Descrevemos aqui uma adaptação de protocolos utilizados para induzir plasticidade homeostático em neurónios para o estudo da plasticidade dos receptores acoplados à proteína G astrocíticos. Recentemente usado para examinar as mudanças no grupo I astrocitário mGluRs em ratos juvenis, o método pode ser aplicado para medir o dimensionamento de vários GPCRs astrocitárias, em tecidos de camundongos adultos in situ e in vivo, e para obter uma melhor apreciação da sensibilidade dos receptores astrocitárias a mudanças na atividade neuronal.

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

inducing-plasticity-astrocytic-receptors-manipulation-neuronal-firing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K visualizações.  University of California Riverside.  Descrevemos aqui uma adaptação de protocolos utilizados para induzir plasticidade homeostático em neurónios para o estudo da plasticidade dos receptores acoplados à proteína G astrocíticos. Recentemente usado para examinar as mudanças no grupo I astrocitário mGluRs em ratos juvenis, o método pode ser aplicado para medir o dimensionamento de vários GPCRs astrocitárias, em tecidos de camundongos adultos in situ e in vivo, e para obter uma melh...

Vídeo: Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Preparação de Oligoméricas β-amilóide 1-42 Indução e de Impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Neurociência

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into diverse subtypes based on their immunochemical, morphological, and physiological properties1-4. Although previous research has revealed much about intrinsic properties of individual types of inhibitory neurons, knowledge about their local circuit connections is still relatively limited3,5,6. Given that each individual neuron's function is shaped by its excitatory and inhibitory synaptic input within cortical circuits, we have been using laser scanning photostimulation (LSPS) to map local circuit connections to specific inhibitory cell types. Compared to conventional electrical stimulation or glutamate puff stimulation, LSPS has unique advantages allowing for extensive mapping and quantitative analysis of local functional inputs to individually recorded neurons3,7-9. Laser photostimulation via glutamate uncaging selectively activates neurons perisomatically, without activating axons of passage or distal dendrites, which ensures a sub-laminar mapping resolution. The sensitivity and efficiency of LSPS for mapping inputs from many stimulation sites over a large region are well suited for cortical circuit analysis.
Here we introduce the technique of LSPS combined with whole-cell patch clamping for local inhibitory circuit mapping. Targeted recordings of specific inhibitory cell types are facilitated by use of transgenic mice expressing green fluorescent proteins (GFP) in limited inhibitory neuron populations in the cortex3,10, which enables consistent sampling of the targeted cell types and unambiguous identification of the cell types recorded. As for LSPS mapping, we outline the system instrumentation, describe the experimental procedure and data acquisition, and present examples of circuit mapping in mouse primary somatosensory cortex. As illustrated in our experiments, caged glutamate is activated in a spatially restricted region of the brain slice by UV laser photolysis; simultaneous voltage-clamp recordings allow detection of photostimulation-evoked synaptic responses. Maps of either excitatory or inhibitory synaptic input to the targeted neuron are generated by scanning the laser beam to stimulate hundreds of potential presynaptic sites. Thus, LSPS enables the construction of detailed maps of synaptic inputs impinging onto specific types of inhibitory neurons through repeated experiments. Taken together, the photostimulation-based technique offers neuroscientists a powerful tool for determining the functional organization of local cortical circuits.

This paper introduces an approach of combining laser scanning photostimulation with whole cell recordings in transgenic mice expressing GFP in limited inhibitory neuron populations. The technique allows for extensive mapping and quantitative analysis of local synaptic circuits of specific inhibitory cortical neurons.

Mapeamento Inibitória Circuitos Neuronal por Laser Scanning fotoestimulação

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Difusão lateral e Exocitose de proteínas de membrana em neurônios cultivados avaliada através da recuperação de fluorescência e fluorescência perda de fotobranqueamento

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Derivando o Curso momento do desembaraço glutamato com uma Análise de Deconvolução das correntes Transporter astrocitárias

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

Um<em&gt; In Vitro</emPreparação Muscle-nervo&gt; Adulto mouse para estudar as propriedades de queima de músculos aferentes

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high dose, whereas sequential injections of a subconvulsive dose have been used for the development of chemical kindling, an epilepsy model. A single low-dose injection of PTZ induces a mild seizure without convulsion. However, repetitive low-dose injections of PTZ decrease the threshold to evoke a convulsive seizure. Finally, continuous low-dose administration of PTZ induces a severe tonic-clonic seizure. This method is simple and widely applicable to investigate the pathophysiology of epilepsy, which is defined as a chronic disease that involves repetitive seizures. This chemical kindling protocol causes repetitive seizures in animals. With this method, vulnerability to PTZ-mediated seizures or the degree of aggravation of epileptic seizures was estimated. These advantages have led to the use of this method for screening anti-epileptic drugs and epilepsy-related genes. In addition, this method has been used to investigate neuronal damage after epileptic seizures because the histological changes observed in the brains of epileptic patients also appear in the brains of chemical-kindled animals. Thus, this protocol is useful for conveniently producing animal models of epilepsy.

This protocol describes a method of chemical kindling with pentylenetetrazole and provides a mouse model of epilepsy. This protocol can also be used to investigate vulnerability to seizure induction and pathogenesis after epileptic seizures in mice.

Inflamação induzida pela mielinização Mouse modelo

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADDs) have become the most popular chemogenetic approach used in modern neuroscience. Most studies deliver the ligand clozapine-N-oxide (CNO) using a single intraperitoneal injection, which is suitable for the acute activation/inhibition of the targeted neuronal population. There are, however, only a few examples of strategies for chronic modulation of DREADD-controlled neurons, the majority of which rely on the use of delivery systems that require surgical intervention. Here, we expand on two non-invasive strategies for delivering the ligand CNO to chronically manipulate neural population in mice. CNO was administered either by using repetitive (daily) eye-drops, or chronically through the animal&#39;s drinking water. These non-invasive paradigms result in robust activation of the designer receptors that persisted throughout the CNO treatments. The methods described here offer alternatives for the chronic DREADD-mediated control of neuronal activity and may be useful for experiments designed to evaluate behavior in freely moving animals, focusing on less-invasive CNO delivery methods.

Here we describe two non-invasive methods to chronically control neuronal activity using chemogenetics in mice. Eye-drops were used to deliver clozapine-N-oxide (CNO) daily. We also describe two methods for prolonged administration of CNO in drinking water. These strategies for chronic neuronal control require minimal intervention reducing animals&#8217; stress.

Estratégias não invasivas para manipulação crônica da atividade neuronal controlada por DREADD

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...