Los autores desean agradecer el Centro de UC Riverside para glial-neuronal Interacciones valioso para el debate de los protocolos de escala y los datos. Los autores también quisiera dar un agradecimiento sincero a Abcam por patrocinar la publicación de su trabajo.

<ol>
	<li>Araque, A., Martin, E. D., Perea, G., Arellano, J. I., Buno, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+released+acetylcholine+evokes+Ca2++elevations+in+astrocytes+in+hippocampal+slices.">Synaptically released acetylcholine evokes Ca2+ elevations in astrocytes in hippocampal slices.</a> J. Neurosci. 22, 2443-2450 (2002).</li><li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+mediate+neuron-astrocyte+communication.">Endocannabinoids mediate neuron-astrocyte communication.</a> Neuron. 57, 883-893 (2008).</li><li>Bekar, L. K., He, W., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locus+coeruleus+alpha-adrenergic-mediated+activation+of+cortical+astrocytes+in+vivo.">Locus coeruleus alpha-adrenergic-mediated activation of cortical astrocytes in vivo.</a> Cereb. Cortex. 18, 2789-2795 (2008).</li><li>Hertz, L., Lovatt, D., Goldman, S. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenoceptors+in+brain:+cellular+gene+expression+and+effects+on+astrocytic+metabolism+and+Ca2.">Adrenoceptors in brain: cellular gene expression and effects on astrocytic metabolism and Ca2.</a> Neurochem. Int. 57, 411-420 (2010).</li><li>Porter, J. T., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+astrocytes+in+situ+respond+to+glutamate+released+from+synaptic+terminals.">Hippocampal astrocytes in situ respond to glutamate released from synaptic terminals.</a> J. Neurosci. 16, 5073-5081 (1996).</li><li>Bernardinelli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+display+complex+and+localized+calcium+responses+to+single-neuron+stimulation+in+the+hippocampus.">Astrocytes display complex and localized calcium responses to single-neuron stimulation in the hippocampus.</a> J. Neurosci. 31, 8905-8919 (2011).</li><li>Panatier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+are+endogenous+regulators+of+basal+transmission+at+central+synapses.">Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses.</a> Cell. 146, 785-798 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Ca2++signaling+evoked+by+sensory+stimulation+in+vivo.">Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo.</a> Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).</li><li>Fiacco, T. A., Agulhon, C., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+out+astrocyte+physiology+from+pharmacology.">Sorting out astrocyte physiology from pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 49, 151-174 (2009).</li><li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling+and+Gliotransmission+in+Normal+vs+Reactive+Astrocytes.">Calcium Signaling and Gliotransmission in Normal vs Reactive Astrocytes.</a> Front. Pharmacol. 3, 139 (2012).</li><li>Nedergaard, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artifact+versus+reality--how+astrocytes+contribute+to+synaptic+events.">Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events.</a> Glia. 60, 1013-1023 (2012).</li><li>Nizar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+stimulus-induced+vasodilation+occurs+without+IP3+receptor+activation+and+may+precede+astrocytic+calcium+increase.">In vivo stimulus-induced vasodilation occurs without IP3 receptor activation and may precede astrocytic calcium increase.</a> J. Neurosci. 33, 8411-8422 (2013).</li><li>Sutton, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniature+neurotransmission+stabilizes+synaptic+function+via+tonic+suppression+of+local+dendritic+protein+synthesis.">Miniature neurotransmission stabilizes synaptic function via tonic suppression of local dendritic protein synthesis.</a> Cell. 125, 785-799 (2006).</li><li>Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+synaptic+scaling+induced+by+changes+in+postsynaptic+firing.">Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing.</a> Neuron. 57, 819-826 (2008).</li><li>Xie, A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+scaling+of+astrocytic+metabotropic+glutamate+receptor+signaling+following+long-term+changes+in+neuronal+firing+rates.">Bidirectional scaling of astrocytic metabotropic glutamate receptor signaling following long-term changes in neuronal firing rates.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+calcium.">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiol. Rev. 79, 1089-1125 (1999).</li><li>Petravicz, J., Fiacco, T. A., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+IP3+receptor-dependent+Ca2++increases+in+hippocampal+astrocytes+does+not+affect+baseline+CA1+pyramidal+neuron+synaptic+activity.">Loss of IP3 receptor-dependent Ca2+ increases in hippocampal astrocytes does not affect baseline CA1 pyramidal neuron synaptic activity.</a> J. Neurosci. 28, 4967-4973 (2008).</li><li>Nett, W. J., Oloff, S. H., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+astrocytes+in+situ+exhibit+calcium+oscillations+that+occur+independent+of+neuronal+activity.">Hippocampal astrocytes in situ exhibit calcium oscillations that occur independent of neuronal activity.</a> J. Neurophysiol. 87, 528-537 (2002).</li><li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo.">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, 380-386 (2006).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+101+as+a+specific+marker+of+astroglia+in+the+neocortex+in+vivo.">Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo.</a> Nat. Methods. 1, 31-37 (2004).</li><li>Prezeau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+carboxyl-terminal+domain+of+metabotropic+glutamate+receptor+1+by+alternative+splicing+generate+receptors+with+differing+agonist-independent+activity.">Changes in the carboxyl-terminal domain of metabotropic glutamate receptor 1 by alternative splicing generate receptors with differing agonist-independent activity.</a> Mol. Pharmacol. 49, 422-429 (1996).</li><li>Shao, Y., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+relationship+between+alpha+1-adrenergic+receptor+density+and+the+receptor-mediated+calcium+response+in+individual+astroglial+cells.">Quantitative relationship between alpha 1-adrenergic receptor density and the receptor-mediated calcium response in individual astroglial cells.</a> Mol. Pharmacol. 44, 247-254 (1993).</li><li>Wang, S. S., Thompson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+changes+in+functional+muscarinic+acetylcholine+receptor+density+in+single+neuroblastoma+cells+using+calcium+release+kinetics.">Measurement of changes in functional muscarinic acetylcholine receptor density in single neuroblastoma cells using calcium release kinetics.</a> Cell Calcium. 15, 483-496 (1994).</li><li>Ostasov, P., Krusek, J., Durchankova, D., Svoboda, P., Novotny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++responses+to+thyrotropin-releasing+hormone+and+angiotensin+II:+the+role+of+plasma+membrane+integrity+and+effect+of+G11alpha+protein+overexpression+on+homologous+and+heterologous+desensitization.">Ca2+ responses to thyrotropin-releasing hormone and angiotensin II: the role of plasma membrane integrity and effect of G11alpha protein overexpression on homologous and heterologous desensitization.</a> Cell Biochem. Funct. 26, 264-274 (2008).</li><li>Shelton, M. K., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+astrocytes+exhibit+Ca2+-elevating+muscarinic+cholinergic+and+histaminergic+receptors+in+situ.">Hippocampal astrocytes exhibit Ca2+-elevating muscarinic cholinergic and histaminergic receptors in situ.</a> J. Neurochem. 74, 555-563 (2000).</li><li>Hermans, E., Challiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+signalling+and+regulatory+properties+of+the+group+I+metabotropic+glutamate+receptors:+prototypic+family+C+G-protein-coupled+receptors.">Structural signalling and regulatory properties of the group I metabotropic glutamate receptors: prototypic family C G-protein-coupled receptors.</a> Biochem. J. 359, 465-484 (2001).</li><li>Zur Nieden, R., Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Metabotropic+Glutamate+Receptors+for+the+Generation+of+Calcium+Oscillations+in+Rat+Hippocampal+Astrocytes+In+Situ.">The Role of Metabotropic Glutamate Receptors for the Generation of Calcium Oscillations in Rat Hippocampal Astrocytes In Situ.</a> Cortex. 16 (5), 676-687 (2005).</li><li>de Ligt, R. A., Kourounakis, A. P., AP, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+agonism+at+G+protein-coupled+receptors:+(patho)physiological+relevance+and+implications+for+drug+discovery.">Inverse agonism at G protein-coupled receptors: (patho)physiological relevance and implications for drug discovery.</a> Br. J. Pharmacol. 130, 1-12 (2000).</li><li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+101+induces+long-term+potentiation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+efficacy+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Sulforhodamine 101 induces long-term potentiation of intrinsic excitability and synaptic efficacy in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuroscience. 169, 1601-1609 (2010).</li><li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains.">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging.">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J. Gen. Physiol. 141, 633-647 (2013).</li><li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition.">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat. Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li><li>Fiacco, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+stimulation+of+astrocyte+calcium+in+situ+does+not+affect+neuronal+excitatory+synaptic+activity.">Selective stimulation of astrocyte calcium in situ does not affect neuronal excitatory synaptic activity.</a> Neuron. 54, 611-626 (2007).</li><li>Echegoyen, J., Neu, A., Graber, K. D., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+plasticity+studied+using+in+vivo+hippocampal+activity-blockade:+synaptic+scaling,+intrinsic+plasticity+and+age-dependence.">Homeostatic plasticity studied using in vivo hippocampal activity-blockade: synaptic scaling, intrinsic plasticity and age-dependence.</a> PLoS One. 2, (2007).</li><li>Aguado, F., Espinosa-Parrilla, J. F., Carmona, M. A., Soriano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+regulates+correlated+network+properties+of+spontaneous+calcium+transients+in+astrocytes+in+situ.">Neuronal activity regulates correlated network properties of spontaneous calcium transients in astrocytes in situ.</a> J. Neurosci. 22, 9430-9444 (2002).</li><li>Takata, N., Hirase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+layer+1+and+layer+2/3+astrocytes+exhibit+distinct+calcium+dynamics+in+vivo.">Cortical layer 1 and layer 2/3 astrocytes exhibit distinct calcium dynamics in vivo.</a> PLoS ONE. 3, e2525 (2008).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRET+biosensors+to+study+GPCR+biology,+pharmacology,+and+signal+transduction.">BRET biosensors to study GPCR biology, pharmacology, and signal transduction.</a> Front. Endocrinol. 3 (105), (2012).</li><li>Di Castro, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Ca2++detection+and+modulation+of+synaptic+release+by+astrocytes.">Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes.</a> Nat. Neurosci. 14, 1276-1284 (2011).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-dependent+neuroglial+calcium+signaling+differs+between+young+and+adult.">Glutamate-dependent neuroglial calcium signaling differs between young and adult.</a> Science. 339, 197-200 (2013).</li></ol>

Los autores desean dar a conocer que la tetrodotoxina usada en estos estudios fue adquirido de Abcam. Abcam no tuvo ninguna participación en las hipótesis, el diseño, o la recogida de datos. Toda la comunicación sobre el patrocinio de la obra por Abcam se produjo después de que el proceso de revisión por pares fue completa.

Los modelos de escala descritas representan métodos prácticos para la investigación de la plasticidad a largo plazo del grupo I mGluRs astrocítica. Imagen Ca 2 + eventos espontáneos y provocados proporciona un ensayo sensible para la medición de los cambios en la actividad astrocítica Gq GPCR, como evidencia firme se ha establecido que los astrocitos de Ca 2 + elevaciones se producen después de la liberación de 3 tiendas-R sensible IP aguas abajo de la activación Gq GPCR 10, 12, 17, 18. El porcentaje de los astrocitos en la población que responde al grupo agonista I mGluR y el patrón de tales Ca 2 + respuestas informan de cambios en el grupo I mGluRs por los astrocitos. La técnica específica usada para cargar los astrocitos con Ca 2 + indicador es una consideración importante en el diseño de experimentos para buscar cambios en la actividad de los astrocitos Gq de GPCR. Bolo de carga o múltiples astrocitos carga masiva, o patch-abrazadera de carga de los astrocitos individuales se puede utilizar para imagen Ca 2 + transitorios en los astrocitos. Cada enfoque ofrece ciertas ventajas y desventajas. Llenar directamente los astrocitos con Ca 2 + indicador a través de patch clamp permite la identificación inequívoca de la célula como un astrocito sin necesidad de un marcador secundario tal como SR-101. Entrega Patch-clamp de indicador también permite la grabación de Ca 2 + actividad de pequeños compartimentos astrocytic incluyendo los procesos finas y tupidas, potencialmente más profundos en el segmento donde las células son más sanos y con interacciones más intactas con las sinapsis (dependiendo de la potencia del láser disponible). Sin embargo, de patch-clamp de carga sufre de bajo rendimiento como los datos se recogen una célula a la vez. Granel de carga, por el contrario, permite un gran número de astrocitos a ser cargado con Ca 2 + indicador y la imagen de forma simultánea. Sin embargo, sólo los astrocitos cerca de la superficie (&lt;20 micras) de la rodaja se cargan, con preocupación asociadas acerca de la salud celular y sinapsis intactas. El protocolo de bolo de carga contrapresión presentado aquí ofrece un punto medio, con rendimiento relativamente alto y la capacidad de supervisar Ca 2 + la actividad más profundo dentro de la porción (40-75 micras). Se observó un aumento significativo en el porcentaje de astrocitos espontáneamente activas usando la técnica de bolo de carga en comparación con la carga masiva, lo que sugiere que las conexiones entre las sinapsis neuronales y los procesos astrocíticos son más completa 15. Con buena carga, a menudo se puede controlar Ca 2 + actividad en los principales procesos de astrocitos (datos no mostrados) o, potencialmente, incluso compartimentos más pequeños utilizando microscopía de 2-fotón. Sin embargo, tendría que ser ejercido en la asignación de los procesos más pequeños a un astrocito en particular, ya que los límites se funden en la tinción de fondo inespecífica cuidado. Una preocupación adicional con el uso de los procedimientos de carga a granel o en bolo de carga es la necesidad de un mar secundariaKer para la identificación de astrocitos. Mientras que se ha sabido durante muchos años que los astrocitos preferentemente ocupan éster AM de Ca 2 + indicadores, el marcador secundario SR-101 se utiliza a menudo para verificar las células cargadas como astrocitos. SR-101 en sí mismo puede alterar la excitabilidad intrínseca de las neuronas 29. El uso de SR-101 corrobora la necesidad de realizar todas Ca 2 + mediciones de astrocitos en la TTX para limitar posibles SR-101 efectos en la excitabilidad neuronal. Suponiendo que los grupos control y experimentales incluyen SR-101, el marcador en sí mismo no debe tener en cuenta los efectos observados en los astrocitos Ca 2 + señalización siguientes manipulación a largo plazo de los potenciales de acción neuronales. SR-101 puede ser más de una preocupación en la escuela de K + experimentos, sin embargo, ya que puede reducir la diferencia entre mM K + 2.5 vs 5,0 mM de K +, si la velocidad de disparo basal no se altera de forma proporcional. Un enfoque muy prometedor para entregar Ca 2 + </sup&gt; Indicador de astrocitos ha surgido recientemente que ofrece una atractiva alternativa a los enfoques más tradicionales utilizando Ca 2 + tintes. Avances significativos se han hecho en los últimos años con los indicadores de calcio codificados genéticamente (Gecis) dirigidos a los astrocitos 30-32. Gecis puede ser entregado a los astrocitos por microinyección in vivo de vectores virales adeno-asociados en una región del cerebro de interés, tales como el hipocampo. Expresión de Gecis se alcanza después de aproximadamente dos semanas después de la infección viral 32. Hay numerosas ventajas presentadas por el uso de Gecis en astrocitos. En primer lugar, los vectores se dirigen a los astrocitos utilizando un promotor específico de astrocitos, por lo que las células marcadas son astrocitos 32. En segundo lugar, el ruido de la señal-a-ahora parece comparable a lo que puede ser obtenido usando la entrega de patch-clamp de tinte, pero sin la invasividad de haber tenido una pipeta de parche en la celda 32. En tercer lugar, los indicadores pueden ser delivered y se expresa en el tejido adulto, lo que es problemático el uso de métodos de entrega de la carga masiva. Por otra parte, la expresión es de mosaico, que ofrece la capacidad de diferenciar entre múltiples astrocitos. Por lo tanto, varios astrocitos potencialmente se pueden obtener imágenes de forma simultánea, a la vez que la grabación en el soma y ramillas finas al mismo tiempo. Por lo tanto, potencialmente, una sola técnica podría ser utilizada en lugar de tres técnicas separadas (la carga masiva, bolo de carga, y la carga de patch-clamp) para registrar la actividad de la ampliación de los GPCRs Gq astrocíticos, incrementando en gran medida la eficiencia. Una desventaja potencial de usar la entrega mediada por virus de Ca 2 + indicadores de los astrocitos es el posible efecto sobre la salud de la rebanada 32. Los vectores virales adeno-asociados utilizados para entregar las Gecis se han demostrado previamente para causar gliosis reactiva de astrocitos 33. Preparación de cortes de cerebro en general probablemente inicia primeras etapas de la patología, incluida la liberación de inflammatory moléculas 10. Por lo tanto, junto con los tiempos de incubación largos requeridos para inducir la escala de los receptores de los astrocitos, el uso de Gecis entregado usando vectores virales tendrían que recibir una consideración adicional en el contexto de la salud rebanada en este tipo de experimentos. Cuando se emplea este protocolo, es importante tener en cuenta que el tiempo de aplicación para el agonista para producir una respuesta variará en función de la disponibilidad del receptor. Para una concentración dada de agonista, el tiempo de aplicación tendrá que ser más largo si los receptores han reducido, y más corto si los receptores se han ampliado, para el fármaco para alcanzar una concentración adecuada en el tejido para activar los receptores suficientemente para producir un Ca 2 + respuesta. Por lo tanto, los tiempos de aplicación de la droga, y, potencialmente, sus concentraciones, pueden tener que ser ajustados dependiendo de la dirección prevista de la escala. Por ejemplo, es posible que la concentración de agonista que bajar en el case de TTX para evitar la saturación de las respuestas, y aumentó después de la incubación de las rebanadas de alto K + ver aún una respuesta. En concreto, la concentración DHPG fue desplazado 5-15 M después del tratamiento TTX 30-50 M después del tratamiento 5,0 mM de K + con el fin de estudiar Ca 2 + patrones de respuesta, como 5-15 M era con frecuencia demasiado baja para producir respuestas fiables en astrocitos después de escalar hacia abajo del grupo I mGluRs. De grabación de astrocito Ca 2 + actividad no proporciona ninguna evidencia directa de la inserción del receptor o la internalización hacia o desde la membrana plasmática. Sin embargo, en base a la notable similitud de los datos con los datos de estudios previos in vitro que examinaron la relación directa entre los niveles de expresión de GPCR Gq y espontánea y evocó Ca 2 + transitorios 21-24, la interpretación más lógica de los cambios en el Ca 2 + de señalización es que la superficie de los niveles de expresión de los receptores de astrocitos tienencambiado. Un enfoque complementario puede ser una consideración importante si se quiere proporcionar evidencia adicional sobre el locus del efecto sobre el Ca 2 + actividad. Una estrategia que utilizamos fue examinar el efecto de la incubación TTX en rodajas de hipocampo de ratones astrocytic MrgA1R. Estos ratones transgénicos expresan un GPCR Gq extranjera (el MrgA1R) sólo en los astrocitos. Debido a que este receptor no es nativo al cerebro, no hay neurotransmisor endógeno presente para cambiar sus niveles de actividad. El trabajo previo sugiere que este receptor se acopla a la misma moléculas de señalización intracelular como grupo endógeno I mGluRs en los mismos astrocitos 34. Después de la incubación a largo plazo de las rebanadas de ratones MrgA1R en TTX, no hay diferencias en las respuestas MrgA1R agonistas-evocada en comparación con el control de la misma camada incubó rebanadas se proporcionan evidencia de que el efecto sobre los astrocitos Ca 2 + actividad es debido a los cambios localizados en el receptor de la superficie, especialmente si las respuestas del grupo I mGluR siguen siendo signifinificativamente mayor en los mismos astrocitos. Una alternativa, aunque estrategia tal vez más implicados sería para aislar los astrocitos de las rodajas para el análisis de Western blot, siempre y cuando una fracción de membrana se podría analizar los cambios en los niveles de expresión de los receptores de superficie. La fluorescencia de células activadas clasificación (FACS) o citometría de flujo pueden ser útiles aquí. Las posibles aplicaciones de esta técnica para el estudio de las neuronas, astrocitos y las interacciones de astrocitos neuronal son muchos. En nuestros experimentos, único grupo-evocó DHPG I mGluR se estudiaron astrocytic Ca 2 + respuestas, en rodajas de hipocampo aisladas agudas de ratones jóvenes. Esta preparación no sólo tiene los aferentes intactas (colaterales de Schaffer), sino también las neuronas que dan lugar a ellas (las células piramidales CA3), por lo que es posible manipular las tasas de disparo de estas neuronas glutamatérgicas en las células postsinápticas (células piramidales CA1) y los astrocitos en estrato radiado cuyos procesos asoE con estas sinapsis. La rebanada del hipocampo aguda puede no ser la mejor preparación para la manipulación de las tasas de disparo de otros tipos de neuronas, sin embargo, el mayor número de fibras aferentes se separan de las neuronas que dan lugar a los mismos. Sin embargo, puede ser posible en ciertas preparaciones rebanada para observar la plasticidad de otros subtipos Gq GPCR astrocíticos. Por ejemplo, las rebanadas se podrían preparar con las neuronas colinérgicas del cerebro anterior basal y sus proyecciones al hipocampo intacto. La incubación de estas rebanadas en TTX o elevada de K + podría afectar las tasas de disparo de las neuronas colinérgicas basales, que conduce a la escala de mAChRs en astrocitos de estrato oriens, que reciben una parte significativa de la entrada colinérgica 1. Una alternativa todavía no probado enfoque para estudiar la escala del receptor de los astrocitos dentro de un área específica del cerebro, con todas las conexiones intactas mientras se realiza un escalado, podría ser el uso de un modelo in vivo donde una liberación sostenida de TTX se consigue mediante la implantación de un Plastpolímero IC Elvax 40W por encima de la región de interés 35. Este enfoque ha sido utilizado previamente en un estudio de escalado neuronal, sino también debe ser aplicable a la escala de los astrocitos. Finalmente, con la lectura correcta, futuros estudios podrían examinar otras familias de GPCR, incluyendo cambios en T o s T i GPCRs. Uno podría predecir astrocítica GABA B G i GPCRs verse afectados tras la inhibición del disparo en la proyección a nivel local interneuronas GABA dentro de cualquier rebanada preparación. Desarrollo de nuevos indicadores destinados a otras moléculas de señalización, como un indicador de tiempo real del segundo mensajero AMPc, se abriría un nuevo campo de investigación sobre la comunicación del receptor de la neurona-astrocito a. Escalamiento bidireccional de los mGluRs astrocíticos por la manipulación de las tasas de disparo de las neuronas basales proporciona una medida de la sensibilidad de los astrocitos a la liberación mediada por AP de neurotransmisor. Los astrocitos aparentemente pueden detectar puntos de acceso espontáneas y glutamaliberación TE en las sinapsis de células piramidales CA1 colateral de Schaffer incluso cuando K + extracelular está dentro de un rango fisiológico. Si bien la aplicación aguda de TTX no reduce la frecuencia de los astrocitos espontánea Ca 2 + actividad 18, 36, 37, el Ca 2 + actividad entre los astrocitos en la población se convierte en decorrelacionada 36, proporcionando evidencia de que los receptores de los astrocitos son detectores de AP. Esto sugiere que los astrocitos sienten APs neuronales espontáneas con ningún efecto en su actividad general Ca 2 +. Es ampliamente aceptado que las concentraciones intracelulares de IP 3 necesitan para alcanzar un nivel de umbral para estimular IP 3 Rs lo suficiente como para dar lugar a una detectable Ca 2 + elevación. Podrían APs neuronales espontáneas activar GPCRs astrocytic sin producir mensurables Ca 2 + elevaciones? Los estudios futuros podrían utilizar energía de resonancia fluorescente Transfer (FRET) o una tecn similares<html> ique (como BRET) para examinar la relación entre G acoplamiento proteína al receptor (una medida de la activación del receptor) y Ca 2 + liberación de las reservas internas. BRET se ha utilizado ampliamente in vitro para detectar g Acoplamiento de proteína a GPCR 38, aunque puede ser algún tiempo antes de que esta tecnología esté disponible para su uso en preparaciones de tejidos intactos. Es posible que los GPCRs Gq astrocitos se activan con mayor frecuencia que se puede grabar utilizando las herramientas de Ca 2 + de imágenes disponibles en la actualidad. Además de detectar potenciales de acción, los GPCR Gq astrocíticos también pueden ser capaces de detectar la liberación cuántica en miniatura de neurotransmisor como se informa en un estudio reciente 39. El método de escalado bidireccional aquí descrito se puede usar en futuros estudios para proporcionar una medida de la medida en que los GPCR astrocítico Gq detectar la liberación vesicular cuántica de neurotransmisor, incluyendo bafilomicina A1 en el protocolo de incubación. ntent &quot;&gt; Hasta el momento, los protocolos de escala sólo se han usado en cortes de hipocampo de ratones jóvenes (P12-P18). Por lo tanto, actualmente se desconoce si la escala del receptor de los astrocitos también podría ser inducido en el tejido obtenido a partir de ratones adultos. Un estudio reciente convincente sugiere que la expresión grupo I mGluR en astrocitos disminuye considerablemente después de la primera semana de edad y sigue disminuyendo hasta la edad adulta, con muy bajos niveles de expresión del receptor en los astrocitos adultos 40. Por tanto, sería interesante determinar si mGluRs astrocytic escala a raíz de largo inhibición término de la descarga neuronal en adultos rodajas de hipocampo de ratón a niveles cercanos a los observados en los astrocitos de ratones jóvenes. Este hallazgo sugiere que la expresión del receptor astrocítica no es estática a una edad determinada, pero puede cambiar rápidamente dependiendo de los niveles de actividad neuronal. A diferencia de reducción de la expresión del grupo I mGluRs en ratones adultos, la evidencia está emergiendo que los receptores adrenérgicos, incluyendo &amp; #945; 1A, 2A α, β y 1 subtipos, se expresan predominantemente por los astrocitos en el cerebro adulto 3, 4. El adrenérgicos α 1A Gq GPCR puede ser un blanco atractivo para los futuros estudios de la comunicación de las neuronas a los astrocitos, indicar si estos receptores son sensibles a los cambios en las tasas de disparo de las neuronas adrenérgicas.

Los astrocitos responden dentro de segundos a la estimulación de las neuronas o axones neuronales con aumentos en citoplásmica de Ca 2 + resultantes casi exclusivamente a partir de la activación de GPCR Gq astrocíticos. Por ejemplo, los receptores de acetilcolina muscarínicos 1, 2 receptores cannabinoides, los receptores α-adrenérgicos 1A 3, 4, y el grupo I mGluRs (ver abajo) son todos los subtipos Gq GPCR astrocytic que responden de forma aguda con la actividad neuronal. La activación de los astrocitos grupo I mGluRs se ha demostrado más ampliamente, después de la estimulación de aferentes glutamatérgicas neuronales in situ (tales como cortes de hipocampo agudos) 5-7, así como en la corteza adulto de ratón in vivo después de la estimulación sensorial 8. El resultado de la activación de astrocítica Gq señalización de GPCR en la biología y la fisiología de los astrocitos, neuronas, o las interacciones neurona-astrocito ha sido un tema de debate 9-12. Será some hora antes de la función de señalización del receptor de la neurona-astrocito a se aprecia plenamente. Aunque está claro que las neuronas pueden activar los receptores astrocytic utilizando protocolos experimentales, hay aspectos de la comunicación de las neuronas a los astrocitos receptor que siguen siendo poco conocidos. En primer lugar, no está bien definido el monto real de la actividad neuronal necesaria para activar astrocítica Gq GPCRs, y en segundo lugar, la capacidad de los receptores de los astrocitos a exhibir su uso dependen de la plasticidad ha recibido poca atención. Para comenzar a abordar estas preguntas, hemos desarrollado recientemente un protocolo para inducir escala bidireccional del grupo I mGluRs astrocítica en rodajas de hipocampo de menores agudas en respuesta a los cambios a largo plazo en el potencial de acción neuronal (AP) que dependen de la actividad sináptica. De manera similar a lo que se ha descubierto para la plasticidad homeostática bidireccional de los receptores ionotrópicos de glutamato neuronal 13, 14, grupo astrocítica I mGluRs Scale Up fobloqueo llowing de potenciales de acción neuronales y escalar hacia abajo cuando la acción neuronal potencial de la frecuencia se incrementa 15. Estos cambios compensatorios en receptores astrocíticos se pueden medir mediante el registro de espontáneas y provocadas de astrocitos Ca 2 + transitorios y la comparación de las propiedades de estos eventos a los que a partir de astrocitos en condiciones de control. En este manuscrito, se describe la metodología completa para el uso de este protocolo, incluyendo la preparación de cortes de hipocampo, condiciones de incubación agudos para inducir escalado receptor astrocito, astrocitos Ca 2 + indicador de carga de tintes, Ca 2 + técnicas de imagen mediante microscopía confocal, y efectos esperados en astrocitos actividad Gq GPCR. Efectos previsibles sobre los astrocitos Ca 2 + propiedades de señalización - que coinciden con los registrados previamente en células cultivadas transfectadas con diferentes niveles de expresión de GPCR Gq - proporcionar una &quot;hoja de ruta&quot; que se puede utilizar en futuros estudios para analizar los cambios en loexpresión GPCR trocytic. Las ramificaciones y aplicaciones potenciales para el uso de esta técnica contribuirá a nuestra comprensión de las interacciones entre astrocitos neuronal en el cerebro sano y enfermo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Chamber Supplies</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:163px;">Brinkmann pipette storage container</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">03-491</td>
			<td style="width:159px;">Use the drawer portion as the incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:163px;">Electrical drill</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Flexible tubing</td>
			<td style="width:135px;">Tygon</td>
			<td style="width:131px;">R-3603</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Silicone seam sealant&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">Also called aquarium seam sealer</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Gas tank</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">95% oxygen, 5% carbon dioxide</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">Natural beveled pipette tip</td>
			<td style="width:135px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:131px;">1111-1000</td>
			<td style="width:159px;">Cut-to-fit to connect oxygenate lines</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">One-to-six lines manifold</td>
			<td style="width:135px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:131px;">64-0210 &#160;(MP-6)</td>
			<td style="width:159px;">For the microloader-manifold apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="65" rowspan="2" style="height:65px;width:163px;">Eppendorf microloader</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Eppendorf</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">5242 956.003</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit</td>
		</tr>
		<tr height="6">
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Floating Bubble Rack</td>
			<td style="width:135px;">Bel Art Scienceware</td>
			<td style="width:131px;">F18875-0400</td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">600 micron Sefar Nitex nylon mesh</td>
			<td style="width:135px;">ELKO filtering Co.</td>
			<td style="width:131px;">&#160;06-600/51</td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Krazy Glue</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:135px;">Baxter</td>
			<td style="width:131px;">1001936060</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">NaCl</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S271-3</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:163px;">KCl</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">P333-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:163px;">CaCl2</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">C79-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:163px;">MgCl2</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">M33-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:163px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S369-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S233-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:131px;">53188-07-1</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:131px;">401471000</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Tetrodotoxin citrate (TTX)</td>
			<td style="width:135px;">Ascent Scientific</td>
			<td style="width:131px;">Asc-055</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Sulforhodamine 101 (SR-101)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">284912</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">D128-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Pluronic Acid F-127</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td style="width:131px;">P6867</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:163px;">Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging)</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td style="width:131px;">O6807</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">(RS)-3,5-DHPG</td>
			<td style="width:135px;">Ascent</td>
			<td style="width:131px;">Asc-020</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Histamine</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">H7125</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">Carbamoylcholine chloride (Carbachol)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">C4382</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:163px;">Adenosine 5&#8217;-ATP disodium (Na-ATP)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A7699</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Dissection Tools</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Single-edge razor blade&#160;</td>
			<td style="width:135px;">GEM</td>
			<td style="width:131px;">62-0161</td>
			<td style="width:159px;">For bisection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Double edge razor blade</td>
			<td style="width:135px;">TED PELLA, INC.</td>
			<td style="width:131px;">121-6</td>
			<td style="width:159px;">For cutting slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Mayo Scissors, supercut</td>
			<td style="width:135px;">WPI</td>
			<td style="width:131px;">14010-15</td>
			<td style="width:159px;">For decapitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Fine iris scissors, straight</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">14094-11</td>
			<td style="width:159px;">For cutting the skull</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Iris forceps, curved</td>
			<td style="width:135px;">WPI</td>
			<td style="width:131px;">15915</td>
			<td style="width:159px;">To remove the skin and skull</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:163px;">Small spatula</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">To remove/transfer the brain</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">11295-10</td>
			<td style="width:159px;">For hippocampus dissection</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Glass Pasteur pipette</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">13-678-20B</td>
			<td style="width:159px;">For transferring brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Pasteur pipette rubber bulb</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">03-448-22</td>
			<td style="width:159px;">For transferring brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Polystyrene 100-mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">25020</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Equipment</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Vibratome</td>
			<td style="width:135px;">Leica</td>
			<td style="width:131px;">VT 1200S</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="23" rowspan="2" style="height:23px;width:163px;">Water bath</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Fisher</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">ISOTEMP 210</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For warm incubation</td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:163px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:135px;">Narishige</td>
			<td style="width:131px;">PC-10</td>
			<td style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:131px;">Olympus Fluoview 1000</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:163px;">Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform</td>
			<td style="width:135px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:131px;">RC-26GLP</td>
			<td style="width:159px;">diamond bath with low profile</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Borosilicate glass pipette</td>
			<td style="width:135px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:131px;">TW150F-4</td>
			<td style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="25" rowspan="2" style="height:25px;width:163px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Sutter instrument</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">ROE-200</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:163px;">Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 &#181;m cellulose acetate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Costar</td>
			<td style="width:131px;">8161</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing plasticity of astrocytic receptors by manipulation of neuronal firing rates

Cerca de dos décadas de investigación ha establecido que los astrocitos in situ e in vivo expresan numerosos receptores acoplados a proteínas G (GPCR) que pueden ser estimulados por el transmisor neuronal-lanzado. Sin embargo, la capacidad de los receptores de astrocíticos para exhibir plasticidad en respuesta a cambios en la actividad neuronal ha recibido poca atención. Aquí se describe un modelo de sistema que se puede utilizar a nivel mundial escalar hacia arriba o hacia abajo astrocítica grupo I metabotrópicos receptores de glutamato (mGluRs) en rodajas de cerebro agudas. Se incluyen métodos sobre cómo preparar cortes de hipocampo parasagitales, construir cámaras adecuados para la incubación rebanada de largo plazo, de manera bidireccional manipular acción neuronal de frecuencia potencial, astrocitos de carga y procesos de astrocitos con fluorescente Ca 2 + indicador y medir los cambios en la actividad astrocítica Gq GPCR mediante el registro astrocitos espontáneo y evocado Ca 2 + eventos mediante microscopía confocal. En esencia, un &quot;r calciooadmap &quot;es proporcionado por la forma de medir la plasticidad de los GPCRs Gq astrocíticos. Se discuten aplicaciones de la técnica para el estudio de los astrocitos. Tener una comprensión de la forma en la señalización del receptor astrocítica se ve afectada por cambios en la actividad neuronal tiene importantes implicaciones tanto para la función sináptica normal, así como los procesos de trastornos neurológicos subyacentes y las enfermedades neurodegenerativas.

Los resultados representativos en la Figura 3 muestran el efecto de la incubación de secciones de hipocampo de ratón agudos en TTX durante 4-6 h en astrocitos SR Ca 2 + actividad. Los datos incluyen tanto espontánea Ca 2 + transitorios y grupo-evocó DHPG I mGluR Ca 2 + respuestas, de las rebanadas se incubaron en control ACSF vs ACSF más TTX. Aparte de las características morfológicas características básicas, el montaje de proceso estrelladas y el pequeño tamaño del soma (~ 10 m), astrocitos se identifican en la SR por superposición de la Ca 2 + indicador de OGB-01 a.m. con el marcador de astrocitos selectiva SR-101 19, 20 ( Figura 3A). Las cajas numeradas más de los cuerpos celulares de astrocitos se corresponden con la fluorescencia de número superior a los rastros tiempo que se muestran en la Figura 3B. El grupo 1 agonista de mGluR (RS)-3.5-DHPG se aplica para determinar los efectos de escala específicas en grupo 1 mGluRs en astrocitos. Para discriminar entre Phys.iology en la especificidad del efecto de escala para los mGluRs del grupo 1 versus otros GPCRs Gq, un cóctel de los agonistas se aplica al final de cada experimento. Aquí hemos utilizado 10 M cada uno de los Gq GPCR agonistas de histamina, cloruro carbamilcolina (carbacol) y disódico de adenosina 5&#39;-ATP (Na-ATP). El cóctel de agonista también sirve como un control positivo para identificar, astrocitos responden viables en los casos en que las células no responden a DHPG, supuestamente debido a que los astrocitos particulares no expresan cantidades suficientes del receptor para provocar una respuesta a DHPG. Utilizamos diferentes concentraciones de DHPG, incluyendo 5 M y 15 M (Figura 3 B), así como 30 M y 50 M (Figura 4A) para ayudar en la revelación de los cambios en el grupo I mGluRs astrocítica. La relación entre celulares Ca 2 + respuestas y los niveles de expresión Gq GPCR que hubiera sido previamente in vitro 21-24. En primer lugar, laumbral para responder a una concentración de agonista en particular depende de la densidad de receptores expresados ​​por cada célula. En una población de células, las células responden más con un Ca 2 + elevación a una concentración dada de agonista cuando las células son transfectadas con mayores densidades de receptores. Después de incubar las rebanadas en TTX, el porcentaje de astrocitos en la población que responde a una concentración fija de los aumentos de agonistas (Figuras 3B y 3C). Hemos encontrado que 5 M y 15 M DHPG revelan diferencias obvias en el porcentaje de astrocitos de respuesta entre el control y las células tratadas TTX, mientras que 30 y 50 M DHPG son necesarios para comparar las respuestas del grupo I mGluR en 5,0 mM de K + tratados frente a control células (Figura 4A). La relación entre los patrones de Ca 2 + de respuesta astrocíticos y concentración de agonista también ha sido examinada in situ. El aumento de la agonistaconcentración cambia el patrón de la Ca 2 + respuesta en astrocitos de solo pico de Ca 2 + elevaciones a multipeak y meseta de Ca 2 + elevaciones 25-27. Basándose en estos hallazgos anteriores, predijimos que el patrón de respuesta a una única concentración de agonista se desplazará si hay cambios en el nivel de expresión del receptor. Por lo tanto, dependiendo de cuál de los dos métodos de escalado se está utilizando (la inhibición de la descarga neuronal o aumentarla), la concentración de agonista necesaria para producir un patrón de respuesta particular, aumentará o disminuirá. Por ejemplo, los astrocitos incubadas en TTX cambian su patrón de Ca 2 +-evocó DHPG respuesta a más Ca de tipo meseta 2 + elevaciones y responden a reducir las concentraciones de agonistas en comparación con el control de los astrocitos (Figura 3C). Teniendo en cuenta los estudios anteriores, estas observaciones sugieren que el grupo I de mGluR los niveles de expresión del receptor en los astrocitos se ha incrementado. El tiempo de subida y el inicio (latencia) de la Ca 2 + elevaciones también han demostrado que se correlaciona directamente con los cambios en los niveles de expresión Gq GPCR en células cultivadas de 22-24. Los niveles de expresión del receptor de altos producen latencias de respuesta más cortos y tiempos de subida más rápidos mientras que la reducción en la densidad de receptores produce el efecto contrario. Para astrocitos incubadas en TTX, Ca 2 + transitorios provocados por la aplicación de DHPG tienen significativamente más rápido los tiempos de subida en comparación con los astrocitos incubadas en control ACSF (Figura 3D). Como se mencionó anteriormente, las amplitudes de Ca 2 + respuestas agonistas-evocó permanecen sin cambios, independientemente de la concentración de agonista o el modelo de escalamiento 15 (Figura 3D). Además de los cambios observados por la activación directa de mGluRs del Grupo I con DHPG, los astrocitos espontánea Ca 2 + actividad también se ve afectada significativamente por esta manipulación. Observamosda aumento de 2,26 veces en el porcentaje de astrocitos espontáneamente activos se incubaron en TTX versus control. Este es un aumento de sólo el 12,9% de los astrocitos de control que exhiben actividad espontánea en el soma al 42,1% en el TTX incubado astrocitos (Figura 3E). Debido a que se sabe que la actividad GPCR exposición &quot;intrínseca&quot; o constitutiva en ausencia de agonista 21, 26, 28, y que el nivel de este intrínsecas aumenta la actividad con el aumento de los niveles de expresión del receptor, estos datos sugieren que la densidad de astrocíticos aumenta Gq GPCRs después de la reducción a largo plazo en la acción neuronal potencial de fuego. Al igual que en las respuestas agonistas evocados, los tiempos de subida de los espontáneos Ca 2 + elevaciones también se incrementaron (Figura 3E). Los datos representativos que utilizan el segundo protocolo, la incubación en potasio extracelular elevado (5,0 mM), se representa en la Figura 4. Un aumento en K + extracelular de resultados 2,5-5,0 mM en un aumento significativo en la acción de las neuronas CA3 basal potencial de la frecuencia 15. Mayores concentraciones de DHPG (30 M y 50 M) son necesarios con el fin de evocar el grupo I mGluR Ca 2 + respuestas de los astrocitos incubadas en niveles altos de potasio (Figuras 4A y 4B). Esto es coherente con un nivel reducido de grupo de respuesta I mGluR en astrocitos después de un aumento a largo plazo en los potenciales de acción neuronales. Además, el patrón de respuesta evocada a una concentración fija de DHPG se desplaza de respuestas-meseta como a las respuestas de un solo pico más débiles (Figura 4B). Examinando el porcentaje de astrocitos espontáneamente activos en las dos condiciones de potasio revela que un menor número de astrocitos se incubaron en alta K + son espontáneamente activa en comparación con la condición de control (Figura 4C). Este efecto es en el opposite dirección de la condición de TTX en la que se incrementa el porcentaje de astrocitos que exhiben espontáneas Ca 2 + elevaciones. Por último, tanto evocada y espontánea Ca 2 + elevaciones tienen tiempos de subida más lento en los astrocitos incubadas en alto K + en comparación con el grupo de control (Figuras 4C y 4D). En general, estos datos sugieren que los niveles de expresión Gq GPCR astrocytic escala de cuotas de forma bidireccional, dependiendo del nivel de la acción neuronal potencial actividad durante un período de tiempo prolongado. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Fabricación cámara de incubación Slice y configurar. (A) La porción del cajón de un contenedor de almacenamiento pipeta Brinkmann junto con su tapa hermética se utiliza para construir la cámara de incubación rebanada. (B) Driachuelo de un agujero en el lado del recipiente de aproximadamente 1 ¼ desde la parte superior y ¼ desde el lado. Colocar en un trozo de tubo flexible. (C) Conecte el aparato microloader colector al extremo interior del tubo flexible. Nota de corte para el montaje de puntas de pipeta 200 l naturales (flecha blanca). (D) Seis 20 l microloaders Eppendorf se cortan-to-fit a un colector de la línea de uno a seis para crear un aparato de microloader múltiples. (E) Haga dos pequeños agujeros en la tapa. (F) Un Rack burbuja flotante para hacer que el titular de la rebanada. (G) Las &quot;piernas&quot; parte inferior del bastidor burbuja flotante se eliminan de manera que una pieza de material de malla de nylon se pueden pegar a la parte inferior. (H) Llenar la cámara de incubación con una cantidad suficiente de ACSF para que las carrozas titular rebanada. Ajuste la longitud de la tubería de modo que las puntas de las microloaders pueden descansar en un rincón del piso de la cámara. Al colocar la cámara de incubación enel baño de agua, el nivel del agua en el baño debe estar al mismo nivel que la ACSF en la cámara. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Estimación de la salud rebanada. (A) Una rebanada del hipocampo de aspecto saludable mediante contraste de interferencia diferencial (DIC) óptica. Rodajas sanos tienen una apariencia aterciopelada y un alto porcentaje de las neuronas piramidales CA1 saludables. Tenga en cuenta las dendritas apicales que se proyectan dentro estrato radiado. Patch-clamp de las neuronas que se parecen a los que se muestran aquí revelan un potencial de membrana de reposo baja (-61 a -62 mV) en la norma 2.5 mM K + ACSF con unos potenciales de acción espontáneos. Las tasas de potencial de membrana y de cocción variarán en función de la exextracelular de K + (Xie et al. 15). Las flechas apuntan a los astrocitos putativo. Abreviaturas: sr, estrato radiado; s.py., estrato piramidal. La barra de escala, 10 micras. (B) las rebanadas no saludables tienen un alto porcentaje de las neuronas piramidales CA1 muertos, que tienen el aspecto de huevos fritos (flechas blancas señalan núcleos de neuronas muertas - la &quot;yema&quot; del huevo frito). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Grabación amplificada actividad de GPCR y Gq grupo I mGluR evocado Ca 2 + respuestas después de la inhibición a largo plazo de los puntos de acceso neuronales por incubación en TTX. (A) Imágenes representativas de células en el campo de la grabación incubaron en Control condiciones (paneles superiores) o en TTX (paneles inferiores) que han tomado Oregon Green BAPTA-01 a.m. Ca 2 + colorante indicador (paneles de la izquierda) y SR-101 (paneles centrales). La barra de escala es de 10 micras. Superposición de ambas señales (&quot;merge&quot;) indica que los astrocitos de carga con Ca 2 + indicador. Las cajas son dibujadas sobre soma de astrocitos individuo para registrar la intensidad de fluorescencia con el tiempo en el canal verde para supervisar Ca 2 + actividad en astrocitos. (B) restos de muestra de las cajas registradoras en A) de Ca 2 + en la actividad de los astrocitos. Los astrocitos incubadas en TTX muestran mayor actividad espontánea y evocada grupo más sólido I mGluR Ca 2 + respuestas según lo evidenciado por los cambios en el patrón de respuesta. Ejemplos de pico simple (círculo), multipeak (rectángulo), y la meseta (rectángulo de puntos) se muestran Ca 2 + transitorios. (C) Los cambios en los patrones de respuesta son especialmente evidentes utilizando diferentes concentraciones del grupo I agonista mGluR DHPG. Más multipeak y meseta respuestas son evidentes después de la incubación en TTX comparación con el control a una concentración de agonista dada. (D) Rise tiempos de Ca 2 + respuestas evocadas por DHPG son más rápidos en los astrocitos incubadas en TTX en comparación con el control (panel superior), mientras que las amplitudes no cambian (panel inferior), indicativo de &quot;todo o nada&quot; amplitud de la respuesta, una vez se ha alcanzado el umbral para responder. (E) Aumento tiempos de astrocito espontánea Ca 2 + transitorios son también más rápido en TTX incubado frente a control incubada astrocitos (panel superior), mientras que el porcentaje de los astrocitos en la población exhibiendo espontáneas Gq GPCR Ca 2 + aumenta la actividad (panel inferior). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width = &quot;6 pulgadas&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 4. Grabación astrocítica disminuida actividad Gq GPCR y de grupo I mGluR evocado Ca 2 + respuestas siguientes aumento a largo plazo en los puntos de acceso neuronales mediante incubación en potasio elevado extracelular. (A) trazas representativas de astrocitos Ca 2 + grabaciones de rebanadas incubadas en 5,0 mM K + ACSF para despolarizar las neuronas y aumentar su tasa de disparo basal en comparación con el control de ACSF (2,5 mM K + ACSF). Astrocitos incubadas con 5,0 mM de K + ACSF exhiben menos espontáneas somáticas Ca 2 + transitorios y más débiles DHPG respuestas evocadas en comparación con los astrocitos incubadas en ACSF control. (B) La comparación de los patrones de las respuestas evocadas a varias concentraciones de DHPG revela tipos de respuesta más débiles después de aumento a largo plazo en los puntos de acceso neuronales. (C) Una reducción en el porcentaje de los astrocitos en el POblación exhibiendo espontánea Ca 2 + actividad se observó después de la incubación a largo plazo en elevada K + en comparación con el control de ACSF (panel superior), mientras que los tiempos de subida de la actividad espontánea se vuelven más lentas (panel inferior). (D) Aumento tiempos de astrocito evocó Ca 2 + respuestas a diferentes concentraciones de DHPG ralentizarse tras 5,0 mM K + tratamiento en comparación con los astrocitos incubadas en ACSF control. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates at JoVE.com

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Aquí se describe una adaptación de los protocolos utilizados para inducir la plasticidad homeostática en las neuronas para el estudio de la plasticidad de los receptores acoplados a proteínas G astrocíticos. Recientemente se utiliza para examinar los cambios en el grupo I mGluRs astrocítica en ratones jóvenes, el método se puede aplicar para medir la escala de varios GPCRs astrocitos, en el tejido de los ratones adultos in situ e in vivo, y para obtener una mejor apreciación de la sensibilidad de los receptores de los astrocitos a los cambios en la actividad neuronal.

La inducción de la plasticidad de astrocítico Receptores por manipulación de Neuronales cocción Precios

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

inducing-plasticity-astrocytic-receptors-manipulation-neuronal-firing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K vistas.  University of California Riverside.  Aquí se describe una adaptación de los protocolos utilizados para inducir la plasticidad homeostática en las neuronas para el estudio de la plasticidad de los receptores acoplados a proteínas G astrocíticos. Recientemente se utiliza para examinar los cambios en el grupo I mGluRs astrocítica en ratones jóvenes, el método se puede aplicar para medir la escala de varios GPCRs astrocitos, en el tejido de los ratones adultos in situ e in vivo, y para...

Video: Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Preparación de oligómeros β-amiloide 1-42 Y la inducción del deterioro de plasticidad sináptica en rodajas de hipocampo

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Investigación

Neurociencias

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into diverse subtypes based on their immunochemical, morphological, and physiological properties1-4. Although previous research has revealed much about intrinsic properties of individual types of inhibitory neurons, knowledge about their local circuit connections is still relatively limited3,5,6. Given that each individual neuron's function is shaped by its excitatory and inhibitory synaptic input within cortical circuits, we have been using laser scanning photostimulation (LSPS) to map local circuit connections to specific inhibitory cell types. Compared to conventional electrical stimulation or glutamate puff stimulation, LSPS has unique advantages allowing for extensive mapping and quantitative analysis of local functional inputs to individually recorded neurons3,7-9. Laser photostimulation via glutamate uncaging selectively activates neurons perisomatically, without activating axons of passage or distal dendrites, which ensures a sub-laminar mapping resolution. The sensitivity and efficiency of LSPS for mapping inputs from many stimulation sites over a large region are well suited for cortical circuit analysis.
Here we introduce the technique of LSPS combined with whole-cell patch clamping for local inhibitory circuit mapping. Targeted recordings of specific inhibitory cell types are facilitated by use of transgenic mice expressing green fluorescent proteins (GFP) in limited inhibitory neuron populations in the cortex3,10, which enables consistent sampling of the targeted cell types and unambiguous identification of the cell types recorded. As for LSPS mapping, we outline the system instrumentation, describe the experimental procedure and data acquisition, and present examples of circuit mapping in mouse primary somatosensory cortex. As illustrated in our experiments, caged glutamate is activated in a spatially restricted region of the brain slice by UV laser photolysis; simultaneous voltage-clamp recordings allow detection of photostimulation-evoked synaptic responses. Maps of either excitatory or inhibitory synaptic input to the targeted neuron are generated by scanning the laser beam to stimulate hundreds of potential presynaptic sites. Thus, LSPS enables the construction of detailed maps of synaptic inputs impinging onto specific types of inhibitory neurons through repeated experiments. Taken together, the photostimulation-based technique offers neuroscientists a powerful tool for determining the functional organization of local cortical circuits.

This paper introduces an approach of combining laser scanning photostimulation with whole cell recordings in transgenic mice expressing GFP in limited inhibitory neuron populations. The technique allows for extensive mapping and quantitative analysis of local synaptic circuits of specific inhibitory cortical neurons.

Mapeo de los circuitos neuronales inhibitorios por Laser Scanning fotoestimulación

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Difusión lateral y exocitosis de proteínas de membrana en neuronas cultivadas evaluó a través de la recuperación de fluorescencia y la pérdida de fluorescencia photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Derivado de la evolución temporal de la Liquidación glutamato con un análisis de deconvolución de Corrientes Transporter astrocíticos

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Mouse Adulto Preparación músculo-nervio para estudiar las propiedades de cocción de los aferentes musculares

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high dose, whereas sequential injections of a subconvulsive dose have been used for the development of chemical kindling, an epilepsy model. A single low-dose injection of PTZ induces a mild seizure without convulsion. However, repetitive low-dose injections of PTZ decrease the threshold to evoke a convulsive seizure. Finally, continuous low-dose administration of PTZ induces a severe tonic-clonic seizure. This method is simple and widely applicable to investigate the pathophysiology of epilepsy, which is defined as a chronic disease that involves repetitive seizures. This chemical kindling protocol causes repetitive seizures in animals. With this method, vulnerability to PTZ-mediated seizures or the degree of aggravation of epileptic seizures was estimated. These advantages have led to the use of this method for screening anti-epileptic drugs and epilepsy-related genes. In addition, this method has been used to investigate neuronal damage after epileptic seizures because the histological changes observed in the brains of epileptic patients also appear in the brains of chemical-kindled animals. Thus, this protocol is useful for conveniently producing animal models of epilepsy.

This protocol describes a method of chemical kindling with pentylenetetrazole and provides a mouse model of epilepsy. This protocol can also be used to investigate vulnerability to seizure induction and pathogenesis after epileptic seizures in mice.

Modelo murino de inflamación inducida por Pentylenetetrazole

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADDs) have become the most popular chemogenetic approach used in modern neuroscience. Most studies deliver the ligand clozapine-N-oxide (CNO) using a single intraperitoneal injection, which is suitable for the acute activation/inhibition of the targeted neuronal population. There are, however, only a few examples of strategies for chronic modulation of DREADD-controlled neurons, the majority of which rely on the use of delivery systems that require surgical intervention. Here, we expand on two non-invasive strategies for delivering the ligand CNO to chronically manipulate neural population in mice. CNO was administered either by using repetitive (daily) eye-drops, or chronically through the animal&#39;s drinking water. These non-invasive paradigms result in robust activation of the designer receptors that persisted throughout the CNO treatments. The methods described here offer alternatives for the chronic DREADD-mediated control of neuronal activity and may be useful for experiments designed to evaluate behavior in freely moving animals, focusing on less-invasive CNO delivery methods.

Here we describe two non-invasive methods to chronically control neuronal activity using chemogenetics in mice. Eye-drops were used to deliver clozapine-N-oxide (CNO) daily. We also describe two methods for prolonged administration of CNO in drinking water. These strategies for chronic neuronal control require minimal intervention reducing animals&#8217; stress.

Estrategias no invasivas para la manipulación crónica de la actividad neuronal controlada por DREADD

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...