התמחות מוצרי חברת דשנים (SFP) הוא הודה למתן את הכספים הדרושים למחקר זה.

1. דוגמאות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 2 מיליליטר של תמיסת אנזים ו0.5 מיליליטר של תמיסת מצע עבור כל ניסיון ריצה. לדלל פתרונות מניות מרוכזים של אנזים ומצע בפתרונות חיץ שהרכב זהה ללמזער את החום של דילול וערבוב בתוספת המצע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את תנאי חיץ שמספיקים כדי למנוע שינוי pH במהלך ניסוי. לדוגמא, 20 pH HEPES מ&quot;מ 7 הוא נאות למדידות ב-pH הניטרלי. הערה: אם חילופי פרוטון הוא מעורבים, enthalpies protonation של המאגרים בשימוש יש לקחת בחשבון, כי הם משפיעים על ΔH הנמדד של התגובה. השפעות ספציפיות אפשריות של החיץ או מולקולות תוספים על המערכת תחת ניתוח חייבת להילקח בחשבון. אם ממסים אורגניים (למשל DMSO) נכללים בפתרון האנזים, להוסיף אותם בדיוק באותו הריכוז לתוך תמיסת המצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניסוי M1, להתחילעם ריכוז אנזים בטווח ננומטר (למשל 1 ננומטר) ועם ריכוז מצע גבוה יותר לפחות שלושה סדרי גודל מריכוז האנזים ומעל K M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניסוי M2, להתחיל עם ריכוז אנזים בטווח PM-ננומטר (למשל 15 PM). ריכוז מצע במזרק הוא בטווח מ&quot;מ (למשל 400 מ&quot;מ). הערה: בניסוי M1 זריקה אחת, ריכוזים צריכים להיות מספיק כדי להשיג את המרת המצע הכוללת לתוך המוצר לאורך זמן הניסוי. לכן, הריכוז של האנזים תלוי בשיעור האנזים: אם אנזימים עם k חתול נמוך נמצאים תחת מחקר, ריכוזים גבוהים יותר אנזים (עד 10 מיקרומטר) חייבים להיות בשימוש. מצד השני, ריכוזי אנזים המשמשים בניסוי M2 חייבים להבטיח כי המצע שהוחדר הוא שולי בלבד (פחות מ -5%) צרך וכי תגובת האנזים ממשיכה במצב היציב. מסיבה זו, גבוהה יותריעילות אנזים, נמוך יותר ריכוז האנזים הנדרש. בסוף הניסוי, ריכוז מצע בתא המדגם צריך להיות גבוה יותר מאשר K M. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדוק היטב אנזים וריכוזי מצע עם הליך מתאים אנליטיים (למשל הספיגה ב 280 ננומטר, מבחני 11 colorimetric, BCA. זה נדרש כדי לקבל חישוב מדויק ומהימן של הפרמטרים תרמודינמיים וקינטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ה-pH של הפתרונות ולוודא שחוסר ההתאמה ה-pH של שני אנזימים ואת פתרונות שהמצע הוא מינימאלית בתנאי הניסוי (± 0.05 יחידות pH). </li></ol> 2. ביצוע הניסוי הערה: באותו ההליך חייב להיות מיושם גם עבור M1 ו-M2 הניסוי, המבוצעים אחד אחרי השני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהתא המדגם ומזרק ההזרקה ניקו על פי היצרן שלהוראות. מלא את מזרק הטעינה מסופק עם המכשיר במים מזוקקים, בעדינות להכניס את המחט בתא המדגם, למלא את התא ולהסיר את הנוזל תוך שימוש באותו המזרק. באמצעות שיטה זו, לשטוף את התא המדגם פעמיים עם מים מזוקקים ופעמים עם החיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את התא המדגם עם 2 מיליליטר של תמיסת אנזים באמצעות מזרק הטעינה, הימנעות היווצרות של בועות אוויר בזהירות. לאט לאט להזריק את הפתרון לתוך התא עד שנשפך החוצה העליון של תאי הגזע. לייצר פרץ של CA. 0.25 מיליליטר של תמיסה אל תוך התא. חזור על פעולה פעמיים. צעד זה מסיר בועות אוויר שנלכדו בתא המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המחט של מזרק הטעינה על המדף בין תאי הגזע ונמל התא ולהסיר כל פתרון עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תכנית VP-Viewer ו, מממשק המחשב, לאזן את מכשיר ITC לטמפרטורת 3 מעלות צלזיוס מתחת לטמפרטורת הניסוי הרצויה. זה נדרש כדי למנוע איזון ארוךתקופות שלפני הניסוי, בשל מכשיר קירור אינסטרומנטלי הפסיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את תא ההתייחסות עם מים מזוקקים עם אותו ההליך מתואר לעיל. כאשר מאגרים עם כוח היוני גבוה או גבוהים osmolality נמצאים בפתרון לדוגמא, יש להשתמש באותו החיץ כפתרון התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קישור מזרק פלסטיק לנמל המילוי של מזרק ההזרקה, באמצעות צינור סיליקון דק. מלא את המזרק להזרקת הצבת קצה המחט לתוך מים ועריכה, עד שמים שיוצאים מנמל המילוי העליון, המציינים את המזרק להזרקה הוא מלא. לאחר מכן להעביר את קצה המזרק ממים ולמשוך את אוויר, לרוקן את המזרק להזרקה. עם הליך זה, לשטוף את המזרק להזרקה עם חיץ, ולצייר באוויר דרך המערכת. בהמשך לכך, הנח את מחט הזריקה בצינור צר המכיל 0.5 מיליליטר של תמיסת מצע, בזהירות להכין ולמלא את המזרק להזרקה לחלוטין, ומשאיר כמות קטנה של פתרון בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מממשק מחשב, &quot;נמל לסגור מילוי&quot; לעיתונות. הסר את צינור טעינת סיליקון. &quot;טיהור ולמלא&quot; לחץ על לחצן כדי לאפשר את המזרק להזרקה כדי לסלק בועות אוויר ולגרש אותם בחזרה לפתרון בתפזורת. חזור על פעולה פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את מזרק ההזרקה, לנגב בצדדים כדי להסיר טיפות שום ומניח את המחט של מזרק ההזרקה לתוך התא המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במחשב, להגדיר את הפרמטרים הריצה המתאימים. יכולים להיות מצויינים האנזים הניסיוני וריכוזי מצע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסוי M1, לקבוע לפחות שתי תוספות (5-30 μl) של מצע כדי לאמת את שחזור. קבע את הזמן המרווח בין כל הזרקה (למשל 1,000 שניות) גדולות מספיק כדי להבטיח כי תשואות אות חום לנקודת ההתחלה לפני התוספת הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסוי M2, להגדיר מספר (למשל 15 x 5-10 μl) זריקות. הגדר את המרווח בין הזריקות (למשל 180 שניות) המאפשרות למערכת של לtabilize כוח התרמיות לנקודת ההתחלה החדשה אחרי כל זריקה. הערה: בפעם המרווח בין זריקות בניסוי M2 צריכה להיות קצרה מספיק כדי למנוע את ההמרה של כמות משמעותית של מצע, המאפשר מדידות שיש לבצע בתנאי מצב יציבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסוי M2, השתמשו בנפחים קטנים (למשל 2 μl) לזריקה הראשונה, שמקבילה ערך נמחק במהלך ניתוח נתונים שלאחר מכן. אכן, לעתים קרובות מציג חפצים בשל דיפוזיה המצע הראשונית ועד קצה המזרק, ואת קיומו של בועות אוויר שנלכדו במחט המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את כוח ההתייחסות, ברמה המשוערת שבו הבסיס יוצב לפני התגובה מתחילה, לפי שווי של 20. ואז להגדיר את האנזים הניסויי וריכוזי מצע ובחר שם עבור הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הטמפרטורה הניסיונית, בדרך כלל ב25 ° C. ITC מאפשר טמפרטורות עבודה בין 2<html> מעלות צלזיוס ו80 ° C. הניסוי הוא מוכן להפעלה. לחץ על לחצן &quot;התחל&quot; כדי להתחיל את הניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהניסוי הסתיים, לנקות את התא המדגם והמזרק בהתאם להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הניסוי לפחות אחד או שתיים יותר פעמים כדי לבדוק את שחזור של נתונים. </li></ol> 3. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניתוח התכנית, לחץ על הכפתור &quot;קראו נתונים&quot;, ולנווט לתיקייה שבה קובץ ITC. של הניסוי שבוצע M2 ממוקם. לחץ על החץ למטה גלילה של &quot;הקבצים מסוג&quot; ובחר &quot;האנזים Assay (זה?)&quot;. בהמשך לכך, לחץ ולפתוח את קובץ ITC. של ניסוי M2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את ΔH של התגובה משילוב העקומה של ניסוי M1 פי משוואה 5. &quot;Width =&quot; 126 &quot;/&gt; (5) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;קראו נתונים&quot;, ובחר את הקובץ. ITC של ניסוי M1 שבוצע. שימוש במקור, לחלק את העקבות בחלקים שונים המכילים שיא אחד אחד ולשמור כל שיא כקובץ opj.. פתח את הקובץ המתאים לשיא הראשון, וכתוצאה מסטייה בסיסית בthermogram של הניסוי הבודד הזרקת M1, לשלב אותו ולחלק את ערך השטח שהושג, באו לידי ביטוי בμcal, על ידי ריכוז המצע הסופי בתא המדגם, המתבטא במיקרומטר, ועל ידי נפח התא מתבטא בליטרים, קביעה, על פי משוואה 5, ΔH של התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על אותו ההליך לשיא השני של ניסוי M1 ולקבל ערך ממוצע עבור שתי מדידות ΔH. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע DQ / dt מניסוי M2 מדידת ההבדל בין הבסיס המקורי והבסיס החדש לאחר כל זריקה. להמיר את הדוארנתוני xperimental לשיעורי תגובה לפי משוואת 4, באמצעות ערך אנתלפיה שהושג בניסוי M1 ולהתאים את הנתונים למשוואת מיכאליס-מנטן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניתוח התכנית, לחץ על הכפתור &quot;קראו נתונים&quot;, ובחר את הקובץ. ITC של ניסוי M2 שבוצע. לחץ על החץ למטה גלילה של &quot;הקבצים מסוג&quot; ובחר &quot;האנזים Assay (זה?)&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיבת הדו שיח האנזים Assay נפתחה, המאפשרת בחירה באחת מארבעת הדגמים. בחר &quot;שיטה 2 - מצע רק&quot; מהחלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון ΔH, כדי להצביע על שווי ΔH שהושג בשלב 4.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן &quot;ריכוז&quot; כדי לבדוק את ערכי הריכוז כדי לשמש בהליך המתאים. לחץ על הכפתור &quot;זמן הממוצע (P)&quot;. תיבת שיח נפתחת נותנת ההזדמנות לשנות או לקבל את ערך ברירת המחדל. ערך זה מייצג את הזמן לפני כל להזריקיון שבממוצעי מכשיר אות הכוח לקבוע את רמת הכוח בכל ריכוז מצע. לחץ על אישור כדי לאשר את ערך ברירת המחדל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הלחצן &quot;אפס Y הציר&quot;. הסמן הופך לשיער צולב המאפשר להכפיל לחץ על נקודה, למקום בy = 0. לחץ לחיצה כפולה ממש לפני נקודת הזריקה הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן לחשב את השיעור. שיעור הוא להתוות לעומת ריכוז המצע, נגזר על ידי חלוקת המצע הוסיף במהלך טיטרציה למדגם נפח התא (תוך לקיחה בחשבון השפעות דילול). פעולה זו מעניקה לעלילת מיכאליס-מנטן טיפוסי שיכול להיות מצוידת כדי להשיג K M ו-k חתול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש למחוק כמה נקודות, בחר בלחצן &quot;חתוכים נתונים&quot;. הזז את סמני נתונים להוציא נקודות נתונים רעות ולחץ לחיצה כפולה על אחד מהסמנים או לחצו על Enter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפונקצית &quot;התאמה למודל&quot; כדי להתאים את העקומה וללהשיג קבועים קינטית. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Leavitt, S., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+protein+binding+energetics+by+isothermal+titration+calorimetry.">Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 560-566 (2001).</li><li>Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+the+biological+sciences:+things+are+heating+up!+BioTechniques.">Application of isothermal titration calorimetry in the biological sciences: things are heating up! BioTechniques.</a> 37, 885-887 (2004).</li><li>Zambelli, B., Bellucci, M., Danielli, A., Scarlato, V., Ciurli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ni2++binding+properties+of+Helicobacter+pylori+NikR.">The Ni2+ binding properties of Helicobacter pylori NikR.</a> Chem. Commun. , 3649-3651 (2007).</li><li>Zambelli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+Ni2++binding+selectively+promotes+binding+of+Helicobacter+pylori+NikR+to+its+target+urease+promoter.">High-affinity Ni2+ binding selectively promotes binding of Helicobacter pylori NikR to its target urease promoter.</a> J. Mol. Biol. 383, 1129-1143 (2008).</li><li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010.">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li><li>Todd, M. J., Gomez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+kinetics+determined+using+calorimetry:+a+general+assay+for+enzyme+activity.">Enzyme kinetics determined using calorimetry: a general assay for enzyme activity.</a> Anal. Biochem. 296, 179-187 (2001).</li><li>Bianconi, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorimetry+of+enzyme-catalyzed+reactions.">Calorimetry of enzyme-catalyzed reactions.</a> Biophys. Chem. 126, 59-64 (2007).</li><li>Demarse, N. A., Killian, M. C., Hansen, L. D., Quinn, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+enzyme+kinetics+via+isothermal+titration+calorimetry.">Determining enzyme kinetics via isothermal titration calorimetry.</a> Methods Mol. Biol. 978, 21-30 (2013).</li><li>Michaelis, L., Menten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+kinetik+der+invertinwirkung.">Die kinetik der invertinwirkung.</a> Biochem. Z. 49, 333-369 (1913).</li><li>Walker, J., Wilson, K., Walker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principle and techniques of practical biochemistry. , 312-356 (2000).</li><li>Ciurli, S., Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nickel and its surprising impact in nature. 2, 241-278 (2007).</li><li>Zambelli, B., Musiani, F., Benini, S., Ciurli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+Ni2++in+urease:+sensing,+trafficking,+and+catalysis.">Chemistry of Ni2+ in urease: sensing, trafficking, and catalysis.</a> Acc. Chem. Res. 44, 520-530 (2011).</li><li>Zonia, L. E., Stebbins, N. E., Polacco, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+urease+in+germination+of+nitrogen-limited+Arabidopsis+thaliana+seeds.">Essential role of urease in germination of nitrogen-limited Arabidopsis thaliana seeds.</a> Plant Physiol. 107, 1097-1103 (1995).</li><li>Follmer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+and+structure+of+plant+ureases.">Insights into the role and structure of plant ureases.</a> Phytochemistry. 69, 18-28 (2008).</li><li>Sumner, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+crystallization+of+the+enzyme+urease.">The isolation and crystallization of the enzyme urease.</a> J. Biol. Chem. 69, 435-441 (1926).</li><li>Krajewska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureases+I.+Functional,+catalytic+and+kinetic+properties:+A+review.">Ureases I. Functional, catalytic and kinetic properties: A review.</a> J. Mol. Cat. B. 59, 9-21 (2009).</li><li>Callahan, B. P., Yuan, Y., Wolfenden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+borne+by+urease.">The burden borne by urease.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 10828-10829 (2005).</li><li>Krajewska, B., van Eldik, R., Brindell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-+and+pressure-dependent+stopped-flow+kinetic+studies+of+jack+bean+urease.+Implications+for+the+catalytic+mechanism.">Temperature- and pressure-dependent stopped-flow kinetic studies of jack bean urease. Implications for the catalytic mechanism.</a> J. Biol. Inorg. Chem. 17, 1123-1134 (2012).</li><li>Hausinger, R. P., Karplus, P. A., Huber, R., Poulos, T., Wieghardt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Metalloproteins. , 867-879 (2001).</li><li>Goldberg, R., Kishore, N., Lennen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+quantities+for+the+ionization+reactions+of+buffers.">Thermodynamic quantities for the ionization reactions of buffers.</a> J. Phys. Chem. Ref. Data. 31, 231-370 (2002).</li><li>Baumann, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+isothermal+titration+calorimetry+for+xylanase+kinetics+in+comparison+to+chemical-reducing-end+assays.">Advantages of isothermal titration calorimetry for xylanase kinetics in comparison to chemical-reducing-end assays.</a> Anal. Biochem. 410, 19-26 (2011).</li><li>Noske, R., Cornelius, F., Clarke, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+enzymatic+activity+of+the+Na+,K+-ATPase+via+isothermal+titration+microcalorimetry.">Investigation of the enzymatic activity of the Na+,K+-ATPase via isothermal titration microcalorimetry.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797, 1540-1545 (2010).</li><li>Harmon, K. M., Niemann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+competitive+inhibition+of+the+urease-catalyzed+hydrolysis+of+urea+by+phosphate.">The competitive inhibition of the urease-catalyzed hydrolysis of urea by phosphate.</a> J. Biol. Chem. 177, 601-605 (1949).</li><li>Benini, S., Rypniewski, W. R., Wilson, K. S., Ciurli, S., Mangani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+rationalization+of+urease+inhibition+by+phosphate:+novel+insights+into+the+enzyme+mechanism.">Structure-based rationalization of urease inhibition by phosphate: novel insights into the enzyme mechanism.</a> J. Biol. Inorg. Chem. 6, 778-790 (2001).</li><li>Segel, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme kinetics: behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme systems. , (1993).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

משמעות של ITC ללמוד פעילות האנזימטית ביחס לשיטות קיימות בנוסף ליישומים הקלאסיים שלה ללמוד שיווי משקל מחייב, calorimetry טיטרציה בידוד התרמי מספק שיטה מהירה ואמינה לאפיון תגובות אנזימטיות בפתרון באמצעות החום של תגובה כמו בדיק...

קביעת כמותית של תגובות ביוכימיות מספקת תובנות לגבי התהליכים הביולוגיים העומדת בבסיס של חיים. Calorimetry מציע מתודולוגיה ללא תווית לאפיין כמעט בכל תגובה כימית בפתרון כמותית. טכניקה זו מודדת את החום שמשתחרר או נספג לאורך זמן, ולכן מערכת זיהוי אוניברסלית ומתודולוגיה נוחה מאוד לכמת את כמות המולקולות מגיבים (כלומר תרמודינמיקה מחייבת), כמו גם על מנת למדוד את קצב התגובה (כלומר קינטיקה). בפרט, calorimetry טיטרציה בידוד התרמי (ITC) כבר אימץ כשיטת בחירה לאפיין את התרמודינאמיקה של שיווי משקל biomolecular, הכולל חלבון ליגנד, חלבונים, יוני חלבון מתכת ואינטראקציות החלבון-DNA 1-6. בנוסף, היכולת של ITC לספק מידע הקינטית הופכת אותו למערכת חזקה מאוד למדוד קטליזה אנזים, למרות שהפוטנציאל של יישום זה הוא עדייןלזלזל 7-9. משוואת מיכאליס מנטן-10 היא תיאור כמותי של תגובות אנזימטיות, כפי שהוא מספק קשר בין קצב התגובה וריכוז המצע, תלוי בשני פרמטרים הקינטית: קבוע מיכאליס (K M) ושיעור קבוע קטליטי (k חתול) . K החתול / יחס K M הוא כאמור את היעילות הקטליטית של אנזים. בפועל, קביעת K M ו-k חתול לתגובה ספציפית מספק תיאור של קטליזה מלאה. בתגובה האנזימטית טיפוסית (איור 1), מצע (S) אינטראקציה עם האנזים (E) ויוצר מורכבות אנזים-מצע (ES), שמופעל בהמשך למצב המעבר (ES *). זה האחרון הופך למורכב אנזים תוצר הלוואי (EP) שסופו של הדבר dissociates. צעד הבאיםים מתוארים על ידי התגובה הבאה. <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq1.jpg" width="197" /> (1) כאשר k 1 הוא השיעור קבוע להקמת קומפלקס ES, k -1 הוא שיעור קבוע לדיסוציאציה של קומפלקס ES, בעוד k החתול הוא שיעור קבוע קטליטי או מספר מחזור. לפי משוואת מיכאליס מנטן-10, שיעור התגובה יכול להיות מחושב כ: <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq2.jpg" width="144" /> (2) שבו חתול K = M (k -1 + K חתול) / k 1 ו-k = מקסימום v / [E], עם מקסימום v להיות המהירות המקסימלי הגיעה כאשר כל האנזים קשור למצע. Calorimeter טיטרציה הבידוד התרמית היא הכלי המשמש במחקר זה כדי לאפיין את הידרוליזה אנזימטית של אוריאה. מכשיר זה עשוי ממגן adiabatic המכיל שני תאים בצורת שטבע (איור 1). אלה מחוברים לחלק החיצוני עם צינורות גישה צרים. התא המדגם (בערך 1.4 מיליליטר) טעון עם פתרון האנזים, ואילו תא ההתייחסות הוא בדרך כלל מלא במים או בממסים המשמשים לניתוח. מזרק מסתובב עם מחט ארוכה והנעת מערבבים המצורפות, המכיל בדרך כלל CA. 0.3 מיליליטר של תמיסת מצע, הוא רכוב על התא המדגם. מכשיר תרמואלקטרי מודד את ההבדל בטמפרטורה בין המדגם ותא ההתייחסות ו, באמצעות &quot;רשת משוב סלולרי&quot;, הוא שומר על ההבדל הזה באפס על ידי הוספה או הפחתת חום. במהלך הניסוי, המצע מוזרק לתוך תמיסת האנזים בטמפרטורה שנבחרה קבועה. כאשר enתגובת zymatic מתרחשת, כמות החום שמשתחררת או נספגת היא פרופורציונלית למספר מולקולות מצע, שהומרו למולקולות מוצר. בנוסף, שיעור זרימת חום קשור באופן ישיר לשיעור של התגובה. נתונים שנמדדו, המופיע כסטייה של עקבות חום מנקודת ההתחלה ראשונית (איור 1), מייצגים את כוח התרמיות (μcal / sec) המסופק על ידי המכשיר הסלולרי המדגם, שהוא פרופורציונאלי לזרימת החום המתרחשת בתא המדגם לאורך זמן. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. ייצוג סכמטי של calorimeter טיטרציה בידוד התרמית ללמוד תגובות אנזימטיות. תגובה האנזימטית מתרחשת על טיטרציה של המצע (במזרק להזרקה) לתוך תמיסת האנזים (בתא המדגם) גורם לשינוי של יסכוח mal שפורסם על ידי calorimeter, דרוש כדי לשמור על הפער של טמפרטורה בין תא דגימה וקבוע תא התייחסות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> בסך הכל, השינוי בחום (Q) הוא פרופורציונאלי לאנתלפיה הטוחנות של התגובה (ΔH) ומספר השומות של מוצר שנוצר (n), אשר בתורו ניתן על ידי בסך הכל הפעמים נפח הריכוז: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq3.jpg" width="200" /> (3) היווצרות המוצר לאורך זמן (DP / DT), אשר תואם את קצב התגובה, ולכן יכול להיות קשור לכמות החום שנוצר על אותו הזמן (DQ / dt) דרך היחס: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq4.jpg" width="150" /> (4) על פי משוואה זו, על מנת לקבל מיכאליס-מנטן עלילה יש צורך למדוד i) סך ΔH אנתלפיה טוחנת, וii) את זרימת DQ / dt החום בריכוזים מצע שונים. בדרך כלל, זה מתבצע בשני ניסויים שונים: בניסוי הראשון (שיטת 1, M1), המצע מוזרק לתוך תמיסת האנזים והחום לגיור מצע שלם נמדד; בניסוי השני (השיטה 2, M2), זריקות מרובות של מצע מבוצעות וקצב ייצור חום נמדד בריכוזים מצע שונים. שתי מערכות אלו של נתונים מספיקות כדי לגזור את הפרמטרים הקינטית K M ו-k חתול. במאמר הנוכחי, פרוטוקול כללי כדי לקבוע את הפרמטרים הקינטית לתגובות אנזימטיות בוצעו באמצעות ITC מתואר. אנחנו יישמנו את השיטה להידרוליזה אוריאה על ידי האוריאה ensiformis Canavaliase, כמערכת התייחסות. ההסכם הטוב בין התוצאות שהתקבלו בשיטה זו ונתונים שדווחו בספרות מדגים את האמינות של גישה זו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="796">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td style="width:323px;">dissolving in water and adjusting pH with NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">TRIZMA-Base</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td>dissolving in water and adjusting pH with HCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:111px;">Riedel-de-Haen</td>
			<td style="width:119px;">4270</td>
			<td>dissolving in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:111px;">Riedel-de-Haen</td>
			<td style="width:119px;">30427</td>
			<td>dissolving in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Urea</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U4128</td>
			<td>dissolving in water at 40 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Canavalia ensiformis urease (type C-3)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U0251</td>
			<td>dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">VP-ITC on Origin 7.0</td>
			<td style="width:111px;">MicroCal (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">SYS13901</td>
			<td>instrument&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0</td>
			<td style="width:111px;">MicroCal (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>data acquisition software supplied with the instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hot biological catalysis: isothermal titration calorimetry to characterize enzymatic reactions

<html> calorimetry טיטרציה Isothermal (ITC) הוא טכניקה שתוארה היטב שמודדת את החום שמשתחרר או נספג במהלך תגובה כימית, שימוש בו כבדיקה פנימית כדי לאפיין כמעט כל תהליך כימי. כיום, טכניקה זו מיושמת באופן נרחב כדי לקבוע פרמטרים תרמודינמיים של שיווי משקל מחייב biomolecular. בנוסף, ITC הודגם להיות מסוגל ישירות מדידת קינטיקה ופרמטרים תרמודינמיים (k חתול, K M, ΔH) של תגובות אנזימטיות, למרות שהיישום הזה הוא עדיין underexploited. כמו שינויים בחום באופן ספונטני להתרחש במהלך קטליזה האנזימטית, ITC אינו דורש כל שינוי או תיוג של המערכת תחת ניתוח וניתן לבצעו בתמיסה. יתר על כן, השיטה זקוקה לכמות קטנה של חומר. תכונות אלו הופכות את ITC כלי רב ערך, רב עוצמה והייחודית ללמוד קינטיקה אנזים במספר יישומים, כגון, למשל, גילוי תרופות. ילדה = &quot;jove_content&quot;&gt; בעבודה זו שיטה המבוססת על ITC ניסיוני לכמת קינטיקה ותרמודינאמיקה של תגובות אנזימטיות מתוארת ביסודיות. שיטה זו מיושמת על מנת לקבוע k חתול וK M של הידרוליזה אנזימטית של אוריאה על ידי ensiformis Canavalia urease (שעועית שקע). חישוב של אנתלפיה הפנימית טוחנת (int ΔH) של התגובה מתבצע. הערכים וכך השיגו עולים בקנה אחד עם נתונים קודמים שדווחו בספרות, הוכיחו את האמינות של המתודולוגיה.

Urease (EC 3.5.1.5; amidohydrolase אוריאה) הוא אנזים המכיל ניקל multisubunit מצא בarchea, חיידקים, אאוקריוטים וצמחים חד תאיים. מעשי חלבון זה בשלב האחרון של מינרליזציה חנקן האורגנית, מזרזות הידרוליזה של אוריאה לאמוניה וcarbamate, אשר מתפרק באופן ספונטני לתת מולקולה שנייה של אמוניה וביקרבונט (...

Watch this Scientific Journal Video about Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions at JoVE.com

Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

זרימת חום אמצעי calorimetry טיטרציה Isothermal שוחררה או נספגת בתגובות כימיות. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לכמת אנזים-קטליזה. במאמר זה, הפרוטוקול להתקנה אינסטרומנטלית, ניתוח ניסוי ריצה, ונתונים מתוארים בדרך כלל, ופנה לאפיון של הידרוליזה אוריאה האנזימטית של urease שעועית שקע.

הביולוגי קטליזה חמה: Isothermal טיטרציה Calorimetry לאפיין תגובות אנזימטיות

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

hot-biological-catalysis-isothermal-titration-calorimetry-to

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Organic Chemistry

Chemistry

Unit 1

Thermochemistry

Thermodynamics and Chemical Kinetics

SCIENTISTS IN ACTION

20.4K Views.  University of Bologna.  זרימת חום אמצעי calorimetry טיטרציה Isothermal שוחררה או נספגת בתגובות כימיות. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לכמת אנזים-קטליזה. במאמר זה, הפרוטוקול להתקנה אינסטרומנטלית, ניתוח ניסוי ריצה, ונתונים מתוארים בדרך כלל, ופנה לאפיון של הידרוליזה אוריאה האנזימטי...

Video: Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Preparation of Silica Nanoparticles Through Microwave-assisted Acid-catalysis

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle diameters ranging from 30-250 nm by varying the reaction conditions. Through the selection of a microwave compatible solvent, silicic acid precursor, catalyst, and microwave irradiation time, these microwave-assisted methods were capable of overcoming the previously reported shortcomings associated with synthesis of silica nanoparticles using microwave reactors. The siloxane precursor was hydrolyzed using the acid catalyst, HCl. Acetone, a low-tan &#948; solvent, mediates the condensation reactions and has minimal interaction with the electromagnetic field. Condensation reactions begin when the silicic acid precursor couples with the microwave radiation, leading to silica nanoparticle sol formation. The silica nanoparticles were characterized by dynamic light scattering data and scanning electron microscopy, which show the materials&#39; morphology and size to be dependent on the reaction conditions. Microwave-assisted reactions produce silica nanoparticles with roughened textured surfaces that are atypical for silica sols produced by St&#246;ber&#39;s methods, which have smooth surfaces.

Silica nanoparticles were prepared using acid-catalysis of a siloxane precursor and microwave-assisted synthetic techniques resulting in the controlled growth of nanomaterials ranging from 30-250 nm in diameter. The growth dynamics can be controlled by varying the initial silicic acid concentration, time of the reaction, and temperature of reaction.

הכנה של חלקיקי סיליקה באמצעות חומצה קטליזה בסיוע מיקרוגל

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle ...

Retropinacol/Cross-pinacol Coupling Reactions - A Catalytic Access to 1,2-Unsymmetrical Diols

Unsymmetrical 1,2-diols are hardly accessible by reductive pinacol coupling processes. A successful execution of such a transformation is bound to a clear recognition and strict differentiation of two similar carbonyl compounds (aldehydes &#8594; secondary 1,2-diols or ketones &#8594; tertiary 1,2-diols). This fine-tuning is still a challenge and an unsolved problem for an organic chemist. There exist several reports on successful execution of this transformation but they cannot be generalized. Herein we describe a catalytic direct pinacol coupling process which proceeds via a retropinacol/cross-pinacol coupling sequence. Thus, unsymmetrical substituted 1,2-diols can be accessed with almost quantitative yields by means of an&#160;operationally simple performance under very mild conditions. Artificial techniques, such as syringe-pump techniques or delayed additions of reactants are not necessary. The procedure we describe provides a very rapid access to cross-pinacol products (1,2-diols, vicinal diols). A further extension of this new process, e.g. an enantioselective performance could provide a very useful tool for the synthesis of unsymmetrical chiral 1,2-diols.

A novel account for the synthesis of unsymmetrical 1,2-diols based on a retropinacol/cross-pinacol coupling mechanism is described. Due to the catalytic execution of this reaction a considerable improvement compared to conventional cross-pinacol couplings is achieved.

Retropinacol תגובות צימוד / חוצת pinacol - גישה קטליטי לdiols 1,2-הסימטרי

Unsymmetrical 1,2-diols are hardly accessible by reductive pinacol coupling processes. A successful execution of such a transformation is bound to a clear ...

Mizoroki-Heck Cross-coupling Reactions Catalyzed by Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium Under Mild Reaction Conditions

Dichloro-bis(aminophosphine) complexes of palladium with the general formula of [(P{(NC5H10)3-n(C6H11)n})2Pd(Cl)2] (where n = 0-2), belong to a new family of easy accessible, very cheap, and air stable, but highly active and universally applicable C-C cross-coupling catalysts with an excellent functional group tolerance. Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium [(P(NC5H10)3)2Pd(Cl)2] (1), the least stable complex within this series towards protons; e.g. in the form of water, allows an eased nanoparticle formation and hence, proved to be the most active Heck catalyst within this series at 100 &#176;C and is a very rare example of an effective and versatile catalyst system that efficiently operates under mild reaction conditions. Rapid and complete catalyst degradation under work-up conditions into phosphonates, piperidinium salts and other, palladium-containing decomposition products assure an easy separation of the coupling products from catalyst and ligands. The facile, cheap, and rapid synthesis of 1,1',1"-(phosphinetriyl)tripiperidine and 1 respectively, the simple and convenient use as well as its excellent catalytic performance in the Heck reaction at 100 &#176;C make 1 to one of the most attractive and greenest Heck catalysts available.
We provide here the visualized protocols for the ligand and catalyst syntheses as well as the reaction protocol for Heck reactions performed at 10 mmol scale at 100 &#176;C and show that this catalyst is suitable for its use in organic syntheses.

Mizoroki-Heck Cross-coupling Reactions Catalyzed by Dichloro{bis[1,1&#039;,1&#039;&#039;-phosphinetriyltripiperidine]}palladium Under Mild Reaction Conditions

Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium [(P(NC5H10)3)2Pd(Cl)2] (1) is an easy accessible, cheap, and air stable, but highly active Heck catalyst with an excellent functional group tolerance that efficiently operates under mild reaction conditions to give the coupling products in very high yields.

תגובות חוצה צימוד Mizoroki-לעזאזל האיצו ידי dichloro {bis [1,1 &#39;, 1&#39;&#39; - tripiperidine (phosphinetriyl)]} פלדיום בתנאי תגובה מתון

Dichloro-bis(aminophosphine) complexes of palladium with the general formula of [(P{(NC5H10)3-n(C6H11)n})2Pd(Cl)2] (where n = 0-2), belong to a new family ...

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. Recycling of the electron donors NADH or NADPH requires the use of additional enzymes and sacrificial substrates. Interestingly, several oxidoreductases accept hydrogen peroxide as electron donor. While being inexpensive, this reagent often reduces the stability of enzymes. A solution to this problem is the in situ generation of the cofactor. The continuous supply of the cofactor at low concentration drives the reaction without impairing enzyme stability. This paper demonstrates a method for the light-catalyzed in situ generation of hydrogen peroxide with the example of the heme-dependent fatty acid decarboxylase OleTJE. The fatty acid decarboxylase OleTJE was discovered due to its unique ability to produce long-chain 1-alkenes from fatty acids, a hitherto unknown enzymatic reaction. 1-alkenes are widely used additives for plasticizers and lubricants. OleTJE has been shown to accept electrons from hydrogen peroxide for the oxidative decarboxylation. While addition of hydrogen peroxide damages the enzyme and results in low yields, in situ generation of the cofactor circumvents this problem. The photobiocatalytic system shows clear advantages regarding enzyme activity and yield, resulting in a simple and efficient system for fatty acid decarboxylation.

We describe a protocol for the light-catalyzed generation of hydrogen peroxide &#8212; a cofactor for oxidative transformations.

אור מונחה אנזימתי Decarboxylation

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of metabolic transformations. Hyperpolarization via dissolution DNP circumvents part of the sensitivity issues thanks to the large out-of-equilibrium nuclear magnetization stemming from the electron-to-nucleus spin polarization transfer. The high NMR signal obtained can be used to monitor chemical reactions in real time. The downside of hyperpolarized NMR resides in the limited time window available for signal acquisition, which is usually on the order of the nuclear spin longitudinal relaxation time constant, T1, or, in favorable cases, on the order of the relaxation time constant associated with the singlet-state of coupled nuclei, TLLS. Cellular uptake of endogenous molecules and metabolic rates can provide essential information on tumor development and drug response. Numerous previous hyperpolarized NMR studies have demonstrated the relevancy of pyruvate as a metabolic substrate for monitoring enzymatic activity in vivo. This work provides a detailed description of the experimental setup and methods required for the study of enzymatic reactions, in particular the pyruvate-to-lactate conversion rate in presence of lactate dehydrogenase (LDH), by hyperpolarized NMR.

The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

פירוק דינמי גרעיני קיטוב Instrumentation מדידות קצב התגובה האנזימטית בזמן אמת על ידי התמ&quot;ג

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

A Protocol for Safe Lithiation Reactions Using Organolithium Reagents

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents warrants proper technique, thorough training, and proper personal protective equipment. To aid in the training of researchers using organolithium reagents, a thorough, step-by-step protocol for the safe and effective use of tert-butyllithium on an inert gas line or within a glovebox is described. As a model reaction, preparation of lithium tert-butyl amide by the reaction of tert-butyl amine with one equivalent of tert-butyl lithium is presented.

The safe and proper use of organolithium reagents is described.

פרוטוקול תגובות בטוח Lithiation באמצעות ריאגנטים Organolithium

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. Their synthesis by conventional organic chemistry often requires tedious multi-step synthesis processes, with difficult control of the stereochemical outcome. We present a protocol to enzymatically synthetize amino alcohols starting from the readily available L-lysine in 48 h. This protocol combines two chemical reactions that are very difficult to conduct by conventional organic synthesis. In the first step, the regio- and diastereoselective oxidation of an unactivated C-H bond of the lysine side-chain is catalyzed by a dioxygenase; a second regio- and diastereoselective oxidation catalyzed by a regiodivergent dioxygenase can lead to the formation of the 1,2-diols. In the last step, the carboxylic group of the alpha amino acid is cleaved by a pyridoxal-phosphate (PLP) decarboxylase (DC). This decarboxylative step only affects the alpha carbon of the amino acid, retaining the hydroxy-substituted stereogenic center in a beta/gamma position. The resulting amino alcohols are therefore optically enriched. The protocol was successfully applied to the semipreparative-scale synthesis of four amino alcohols. Monitoring of the reactions was conducted by high performance liquid chromatography (HPLC) after derivatization by 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Straightforward purification by solid-phase extraction (SPE) afforded the amino alcohols with excellent yields (93% to &#62;95%).

Chiral amino alcohols are versatile molecules for use as scaffolds in organic synthesis. Starting from L-lysine, we synthesize amino alcohols by an enzymatic cascade reaction combining diastereoselective C-H oxidation catalyzed by dioxygenase followed by cleavage of the carboxylic acid moiety of the corresponding hydroxyl amino acid by a decarboxylase.

תגובות אנזימטיות אשד לסינתזה של כהלים אמינו כיראלי מ L-ליזין

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Employing Pressurized Hot Water Extraction (PHWE) to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory

A recently developed pressurized hot water extraction (PHWE) method which utilizes an unmodified household espresso machine to facilitate natural products research has also found applications as an effective teaching tool. Specifically, this technique has been used to introduce second- and third-year undergraduates to aspects of natural products chemistry in the laboratory. In this report, two experiments are presented: the PHWE of eugenol and acetyleugenol from cloves and the PHWE of seselin and (+)-epoxysuberosin from the endemic Australian plant species Correa reflexa. By employing PHWE in these experiments, the crude clove extract, enriched in eugenol and acetyleugenol, was obtained in 4-9% w/w from cloves by second-year undergraduates and seselin and (+)-epoxysuberosin were isolated in yields of up to 1.1% w/w and 0.9% w/w from C. reflexa by third-year students. The former exercise was developed as a replacement for the traditional steam distillation experiment providing an introduction to extraction and separation techniques, while the latter activity featured guided-inquiry teaching methods in an effort to simulate natural products bioprospecting. This primarily derives from the rapid nature of this PHWE technique relative to traditional extraction methods that are often incompatible with the time constraints associated with undergraduate laboratory experiments. This rapid and practical PHWE method can be used to efficiently isolate various classes of organic molecules from a range of plant species. The complementary nature of this technique relative to more traditional methods has also been demonstrated previously.

Employing Pressurized Hot Water Extraction PHWE to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory

Here, we employ a pressurized hot water extraction (PHWE) method, which utilizes an unmodified household espresso machine to introduce undergraduates to natural products chemistry in the laboratory. Two experiments are presented: PHWE of eugenol and acetyleugenol from cloves and PHWE of seselin and (+)-epoxysuberosin from the Australian plant Correa reflexa.

העסקת החילוץ בלחץ מים חמים (PHWE) לחקור מוצרים טבעיים כימיה במעבדה לתואר ראשון

A recently developed pressurized hot water extraction (PHWE) method which utilizes an unmodified household espresso machine to facilitate natural products ...

Imine Metathesis by Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared according to the methodology developed by surface organometallic chemistry (SOMC). In this framework, catalytic cycles can be determined by isolating crucial intermediates. All air-sensitive materials are handled under inert atmosphere (using gloveboxes or a Schlenk line) or high vacuum lines (HVLs, &#60;10-5 mbar). The preparation of SiO2-700 (silica dehydroxylated at 700 &#176;C) and subsequent applications (the grafting of complexes and catalytic runs) requires the use of HVLs and double-Schlenk techniques. Several well-known characterization methods are used, such as Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), elemental microanalysis, solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy (SSNMR), and state-of-the-art dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy (DNP-SENS). FTIR and elemental microanalysis permit scientists to establish the grafting and its stoichiometry. 1H and 13C SSNMR allows the structural determination of the hydrocarbon ligands coordination sphere. DNP SENS is an emerging powerful technique in solid characterization for the detection of poorly sensitive nuclei (15N, in our case). SiO2-700 is treated with about one equivalent of the metal precursor compared to the amount of surface silanol (0.30 mmol&#183;g-1) in pentane at room temperature. Then, volatiles are removed, and the powder samples are dried under dynamic high vacuum to afford the desired materials [(&#8801;Si-O-)Hf(&#951;2&#960;-MeNCH2)(&#951;1-NMe2)(&#951;1-HNMe2)]. After a thermal treatment under high vacuum, the grafted complex is converted into metal imido silica complex [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)]. [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] effectively promotes the metathesis of imines, using the combination of two imine substrates, N-(4-phenylbenzylidene)benzylamine, or N-(4-fluorobenzylidene)-4-fluoroaniline, with N-benzylidenetert-butylamine as substrates. A significantly lower conversion is observed with the blank runs; thus, the presence of the imido group in [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is correlated to the catalytic performance.

A new group IV metal catalyst for imine metathesis is prepared by grafting amine metal complex onto dehydroxylated silica. Surface metal fragments are characterized using FT-IR, elemental microanalysis, and solid-state NMR spectroscopy. Further dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy experiments complement the determination of the coordination sphere.

Imine מטאפיתזה על ידי הזרזים התומכים בסיליקה באמצעות מתודולוגיה של כימיה אורגנומתכתית של פני השטח

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared ...

A Microwave-Assisted Direct Heteroarylation of Ketones Using Transition Metal Catalysis

Heteroarylation introduces heteroaryl fragments to organic molecules. Despite the numerous available reactions reported for arylation via transition metal catalysis, the literature on direct heteroarylation is scarce. The presence of heteroatoms such as nitrogen, sulfur and oxygen often make heteroarylation a challenging research field due to catalyst poisoning, product decomposition and the rest. This protocol details a highly efficient direct &#945;-C(sp3) heteroarylation of ketones under microwave irradiation. Key factors for successful heteroarylation include the use of XPhos Palladacycle Gen. 4 Catalyst, excess base to suppress side reactions and the high temperature and pressure achieved in a sealed reaction vial under microwave irradiation. The heteroarylation compounds prepared by this method were fully characterized by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H NMR), carbon nuclear magnetic resonance spectroscopy (13C NMR) and high-resolution mass spectrometry (HRMS). This methodology has several advantages over literature precedents including broad substrate scope, rapid reaction time, greener procedure and operational simplicity by eliminating the preparation of intermediates such as silyl enol ether. Possible applications for this protocol include, but are not limited to, diversity-oriented synthesis for the discovery of biologically active small molecules, domino synthesis for the preparation of natural products and ligand development for new transition metal catalytic systems.

Heteroaryl compounds are important molecules utilized in organic synthesis, medicinal and biological chemistry. A microwave-assisted heteroarylation using palladium catalysis provides a rapid and efficient method to attach heteroaryl moieties directly to ketone substrates.

מיקרוגל בסיוע ישיר הטרולציה של Ketones באמצעות מתכת מעבר זרז

Heteroarylation introduces heteroaryl fragments to organic molecules. Despite the numerous available reactions reported for arylation via transition metal ...