Der Spezialdünger Products Company (SFP) ist für die Bereitstellung der erforderlichen Mittel für diese Studie bestätigt.

1. Vorbereitung von Proben <ol><li> Herstellung von 2 ml Enzymlösung und 0,5 ml der Substratlösung für jede Versuchsreihe. Konzentriertes Stammlösungen von Enzym und Substrat in Pufferlösungen mit identischer Zusammensetzung, um die Wärme der Verdünnung und Durchmischung während der Substratzugabe zu minimieren. <ol><li> Wählen Sie die Pufferbedingungen, die ausreichend sind, um pH-Änderung während Experiment zu verhindern. Zum Beispiel ist 20 mM HEPES pH 7 ausreichend für Messungen bei neutralem pH-Wert. HINWEIS: Wenn Protonenaustausch beteiligt ist, muss die Protonierung Enthalpien der verwendeten Puffer betrachtet werden, da sie die gemessene &amp;Dgr; H der Reaktion beeinflussen. Möglichen spezifischen Auswirkungen der Puffer oder Zusatzstoffe Moleküle auf dem System unter Analyse berücksichtigt werden. Werden organische Lösungsmittel (z. B. DMSO) werden in der Enzymlösung enthalten, fügen sie in genau der gleichen Konzentration in der Substratlösung. </li><li> Für die M1 Experiment startenmit Enzym-Konzentration im nM-Bereich (beispielsweise 1 nM) und mit einer Substratkonzentration von mindestens drei Größenordnungen höher ist als die Enzymkonzentration und oberhalb der K M. </li><li> Für das Experiment M2, beginnen Sie mit der Enzymkonzentration in der pM-nM-Bereich (zB 15 Uhr). Substratkonzentration in der Spritze ist im mm-Bereich (z. B. 400 mm). HINWEIS: In der einzigen Injektion M1 Versuch sollten die Konzentrationen ausreichend sein, um die Gesamtsubstratumwandlung in das Produkt über die Versuchszeit zu erreichen. Daher ist die Konzentration des Enzyms hängt von dem Enzym ab: wenn Enzyme mit niedrigem k cat werden noch untersucht, höhere Enzymkonzentrationen (bis zu 10 &amp;mgr; M) verwendet werden. Andererseits muss Enzymkonzentrationen in der M2-Experiment verwendet sicherzustellen, daß die eingespritzte Substrat nur geringfügig (weniger als 5%) verbraucht wird und daß die Enzymreaktion schreitet im stationären Zustand. Aus diesem Grund wird, je höher dieEnzymeffizienz, desto geringer ist die benötigte Enzymkonzentration. Am Ende des Experiments sollte der Substratkonzentration in der Probenzelle über K M sein. </li></ol></li><li> Sorgfältig zu prüfen, Enzym-und Substratkonzentrationen mit einem geeigneten Analyseverfahren (zB Absorption bei 280 nm, kolorimetrisch, BCA-Assays 11. Dies ist erforderlich, um genaue und zuverlässige Berechnung der thermodynamischen und kinetischen Parameter zu erhalten. </li><li> Der pH-Wert der Lösung und sicherzustellen, dass der pH-Fehlanpassung sowohl dem Enzym und dem Substrat Lösungen minimal ist unter den Versuchsbedingungen (± 0,05 pH-Einheiten). </li></ol> 2. Durchführung des Experiments HINWEIS: Das gleiche Verfahren ist sowohl für die M1-und M2-Experiment, das einen nach dem anderen durchgeführt werden, angewandt werden. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Probenzelle und die Injektionsspritze sind nach der Hersteller gereinigtAnweisungen. Füllen Sie die Spritze mit der Be-Messgerät mit destilliertem Wasser vorgesehen ist, vorsichtig die Nadel in der Probenzelle, füllen Sie die Zelle aus und entfernen Sie die Flüssigkeit mit der gleichen Spritze. Mit dieser Methode, wäscht den Probenzelle zweimal mit destilliertem Wasser und zweimal mit dem Puffer. </li><li> Laden der Probenzelle mit 2 ml einer Enzymlösung mit der zu ladende Spritze sorgfältig vermeidet die Bildung von Luftblasen. Langsam spritzen die Lösung in die Zelle, bis sie heraus schwappt die Oberseite der Zelle Stamm. Produzieren Sie ein Spurt von ca. 0,25 ml Lösung in die Zelle. Zweimal wiederholen. Dieser Schritt entfernt von Luftblasen in der Probenzelle eingeschlossen. </li><li> Setzen Sie die Nadel der Spritze Laden auf der Leiste zwischen der Zelle und dem Zellstamm Port und entfernen überschüssige Lösung. </li><li> Starten des VP-Viewer-Programm und von der Computerschnittstelle, die ITC äquilibrieren Instrument auf eine Temperatur 3 ° C unter die gewünschte Versuchstemperatur. Dies ist erforderlich, um Gleichgewichtseinstellung zu vermeiden langPerioden vor dem Experiment durch die passive Kühleinrichtung instrumental. </li><li> Füllen Sie die Referenzzelle mit destilliertem Wasser mit dem gleichen Verfahren oben. Wenn Puffer mit hoher Ionenstärke oder hohe Osmolalität in der Probenlösung, sollte derselbe Puffer als Referenzlösung verwendet werden. </li><li> Verknüpfen einer Plastikspritze auf die Einfüllöffnung der Injektionsspritze, mit einem dünnen Silikonschlauch. Füllen der Injektionsspritze Platzierung der Nadelspitze in Wasser und Erstellung, bis Wasser aus dem oberen Einfüllöffnung, die anzeigt, dass die Injektionsspritze voll ist. Dann bewegen Sie die Spitze der Spritze aus dem Wasser und stellt Luft, um die Injektionsspritze zu entleeren. Mit diesem Verfahren, waschen Sie die Injektionsspritze mit Puffer und saugen Luft durch das System. Anschließend legen Sie die Injektionsnadel in einem engen Röhrchen mit 0,5 ml Substratlösung, sorgfältig auszuarbeiten und der Injektionsspritze vollständig zu füllen, so dass kleine Menge der Lösung an der Unterseite des Rohres. </li><li> Von derComputer-Schnittstelle, drücken Sie auf &quot;Schließen Einfüllöffnung&quot;. Entfernen Sie die Silizium Laderohr. Drücken Sie auf &quot;Purge und Refill&quot;-Taste, damit der Injektionsspritze, um Luftblasen zu entfernen und sie zurück in die Groß Lösung zu vertreiben. Zweimal wiederholen. </li><li> Bewegen Sie die Injektionsspritze, wischen an den Seiten, alle Tropfen zu entfernen und die Nadel der Injektionsspritze in die Probenzelle. </li><li> Auf dem Computer, legen Sie die entsprechenden Betriebsparameter. Die experimentelle Enzym und Substratkonzentrationen angegeben werden. <ol><li> In der M1-Experiment, müssen Sie mindestens zwei Zugänge (5-30 ul) Substrat, um die Reproduzierbarkeit zu überprüfen. Die Abstandszeit zwischen jeder Injektion (z. B. 1000 s) groß genug ist, um sicherzustellen, dass die Wärmesignal wieder auf die Grundlinie vor der nächsten Zugabe. </li><li> In der M2 Experiment, setzen mehrere (z. B. 15 x 10.5 ul)-Injektionen. Das Intervall zwischen den Injektionen (z. B. 180 Sek.), so dass das System stabilize die Wärmeversorgung des neuen Baseline nach jeder Injektion. HINWEIS: Der Zeitabstand zwischen den Injektionen in der M2 Experiment sollte kurz genug sein, um die Umwandlung einer bedeutenden Menge des Substrats zu vermeiden, so dass die Messungen unter stationären Bedingungen durchgeführt werden. </li><li> In der M2-Experiment verwendet kleine Mengen (z. B. 2 &amp;mgr; l) für die erste Injektion, deren entsprechender Wert während der anschließenden Datenanalyse verworfen. Tatsächlich stellt es oft Artefakte aufgrund der anfänglichen Substratdiffusion durch die Spritzenspitze und das Vorhandensein von Luftblasen in der Spritze Nadel gefangen. </li><li> Stellen Sie die Referenzleistung, die ungefähre Ebene, in der die Grundlinie wird vor der Umsetzung gelegt werden beginnt, bei einem Wert von 20. Dann definieren Sie die experimentelle Enzym-und Substratkonzentrationen und wählte einen Namen für das Experiment. </li><li> Bestimmen die Versuchstemperatur, typischerweise bei 25 ° C. ITC ermöglicht Arbeitstemperaturen zwischen 2<html> ° C und 80 ° C. Das Experiment ist bereit für den Betrieb. Drücken Sie &quot;Start&quot;-Taste, um das Experiment zu starten. </li></ol></li><li> Nachdem das Experiment beendet ist, reinigen Sie die Probenzelle und die Spritze entsprechend den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Wiederholen Sie das Experiment, zumindest ein oder zwei Mal, um die Reproduzierbarkeit der Daten zu überprüfen. </li></ol> 3. Datenanalyse <ol><li> Aus der Analyse-Programm, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Daten lesen&quot;, und navigieren Sie zu dem Ordner, in dem die. Itc-Datei des Experiments durchgeführt M2 befindet. Klicken Sie auf den Pfeil nach unten scrollen der &quot;Dateityp&quot; und wählen Sie &quot;Enzym-Assay (es?)&quot;. Anschließend klicken Sie auf und öffnen Sie die. Itc-Datei des M2-Experiment. </li><li> Besorgen Sie sich die AH der Reaktion aus der Integration der Kurve der M1 Versuch gemäß Gleichung 5. &quot;Breite =&quot; 126 &quot;/&gt; (5) <ol><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Daten lesen&quot;, und wählen Sie die Datei. Itc der durchgeführten Experiment M1. Mit Origin, teilen Sie die Kurve in verschiedenen Teilen enthalten jeweils einen Spitzenwert und speichern Sie jede Spitzen als. Opj Datei. Öffnen der Datei entsprechend dem ersten Peak Abweichung von der Grundlinie im Thermogramm der einzelnen Injektion M1 Experiment integrieren und verteilen die erhaltene Fläche resultierende Wert, ausgedrückt in μcal, durch die endgültige Substratkonzentration in der Probenzelle, ausgedrückt in uM, und durch die Zellenvolumen in Litern, Bestimmen, gemäß Gleichung 5, die &amp;Dgr; H der Reaktion. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang für den zweiten Höhepunkt der M1 Experiment und einen durchschnittlichen Wert für die beiden AH-Messungen zu erhalten. </li></ol></li><li> Bestimmen dQ / dt von der M2 Experiment Messen der Differenz zwischen der ursprünglichen und der neuen Basisgrundlinie nach der jeder Injektion. Konvertieren Sie die Experimental Daten an Reaktionsgeschwindigkeiten nach Gleichung 4, mit dem in der M1-Experiment erhalten Enthalpie-Wert und passen die Daten an die Michaelis-Menten-Gleichung. <ol><li> Aus der Analyse-Programm, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Daten lesen&quot;, und wählen Sie die Datei. Itc der durchgeführten Experiment M2. Klicken Sie auf den Pfeil nach unten scrollen der &quot;Dateityp&quot; und wählen Sie &quot;Enzym-Assay (es?)&quot;. </li><li> Das Dialogfeld Enzymassay öffnet, so dass die Auswahl einer der vier Modelle. Wählen Sie &quot;Methode 2 - nur Erde&quot; aus dem Fenster. </li><li> In der AH-Fenster, geben Sie den Wert von AH in Schritt 4.2 erhalten. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;Konzentration&quot;, um die Konzentrationswerte zu überprüfen, um in der Anpassungsprozedur verwendet werden. Klicken Sie auf den &quot;Durchschnittszeit (P)&quot;-Taste. Das Dialogfeld geöffnet, so dass die Möglichkeit zu ändern oder den Standardwert. Dieser Wert steht für die Zeit vor jeder spritzenIonen in der das Instrument mittelt das Leistungssignal an den Leistungspegel bei jeder Substratkonzentration zu bestimmen. Klicken Sie auf OK, um den Standardwert zu bestätigen. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Zero-Y-Achse&quot;. Der Cursor verwandelt sich in ein Fadenkreuz so dass ein Doppelklick auf einen Punkt, bei y = 0 setzen. Doppelklicken Sie kurz vor dem ersten Einspritzstelle. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche Rate berechnen. Betrag ist gegenüber der Substratkonzentration, durch Teilung der während der Titration der Probe Zellvolumen (unter Berücksichtigung von Verwässerungseffekten) aufgenommen Substrat abgeleitet aufgetragen. Diese Operation gibt eine typische Michaelis-Menten-Plot, ausgestattet können bis K und M k cat erhalten. </li><li> Wenn einige Punkte sollten gelöscht werden, wählen Sie die Schaltfläche &quot;Truncate Daten&quot;. Verschieben Sie die Daten Marker, um die schlechten Datenpunkte und klicken Sie doppelt auf eine der Markierungen oder drücken Sie die Eingabetaste auszuschließen. </li><li> Mit der Funktion &quot;Fit zu modellieren&quot;, um die Kurve zu passen underhalten die kinetischen Konstanten. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Bedeutung der ITC, um die enzymatische Aktivität gegenüber bestehenden Methoden zu studieren Zusätzlich zu den klassischen Anwendungen, verbindliche Gleichgewichte zu untersuchen, bietet isothermen Titrationskalorimetrie eine zuverlässige und schnelle Methode, um enzymatische Reaktionen in Lösung charakterisieren, mit der Reaktionswärme als Sonde, ohne Systemänderung oder die Kennzeichnung erfordern. Die kinetischen Parameter k cat und K M...

Quantitative Bestimmung von biochemischen Reaktionen Einblicke in die biologischen Prozesse auf der Grundlage des Lebens. Kalorimetrie bietet eine markierungsfreie Methode zur quantitativen Charakterisierung praktisch jede chemische Reaktion in Lösung. Dieses Verfahren misst die Wärme freigegeben oder im Laufe der Zeit absorbiert wird, und ist daher eine universelle Erfassungssystem und eine sehr bequeme Methode, um die Menge der reagierenden Moleküle (dh Bindung Thermodynamik), als auch die Reaktionsgeschwindigkeit (dh Kinetik) messen zu quantifizieren. Insbesondere hat isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) als Methode der Wahl, um die Thermodynamik der biomolekularen Gleichgewichte zu charakterisieren, mit Protein-Ligand-Protein-Protein, Protein-Metallionen und Protein-DNA-Wechselwirkungen 6.1 verabschiedet. Darüber hinaus ist die Fähigkeit des ITC, um kinetische Informationen ist es ein sehr leistungsfähiges System zur Enzymkatalyse zu messen, obwohl das Potenzial dieser Anwendung ist nochunterschätzt 09.07. Die Michaelis-Menten-Gleichung 10 ist eine quantitative Beschreibung von enzymatischen Reaktionen, da es eine Beziehung zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der Substratkonzentration, in Abhängigkeit von zwei kinetischen Parameter: die Michaelis-Konstante (K M) und die katalytische Geschwindigkeitskonstante (k cat) . Die k cat / K M-Verhältnis ist als das katalytische Effizienz eines Enzyms bezeichnet. In der Praxis Bestimmung von K M und k cat für eine bestimmte Reaktion eine vollständige Beschreibung der Katalyse. In einem typischen Enzymreaktion (Abb. 1), einem Substrat (S) mit dem Enzym (E) die Enzym-Substrat-(ES)-Komplex gebildet wird, der anschließend in den Übergangszustand aktiviert wird (ES *). Letzteres wird in das Enzym-Produkt (EP)-Komplex dissoziiert, die schließlich umgewandelt. Diese Schritts werden durch die folgende Reaktion beschrieben. <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq1.jpg" width="197" /> (1) k 1 die Geschwindigkeitskonstante für die Bildung des Komplexes ES, k-1 die Geschwindigkeitskonstante für die Dissoziation des Komplexes ES, während k cat ist die katalytische Geschwindigkeitskonstante oder Umsatzzahl. : Gemäß der Michaelis-Menten-Gleichung 10 kann die Geschwindigkeit der Reaktion berechnet werden <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq2.jpg" width="144" /> (2) wobei K = M (k-1 + k cat) / k 1 und k cat = v max / [E], wobei V max die maximale Geschwindigkeit erreicht, wenn alle Enzyms an das Substrat gebunden. Die isotherme Titrationskalorimeter ist das Instrument in dieser Studie verwendet, um die enzymatische Hydrolyse von Harnstoff zu charakterisieren. Dieses Instrument besteht aus einem adiabatischen Abschirmung, die zwei geprägte förmigen Zellen (Fig. 1) hergestellt. Diese sind nach außen mit schmalen Zugang Rohren verbunden. Die Probenzelle (ca. 1,4 ml) wird mit der Enzymlösung beladen, und die Referenzzelle wird in der Regel mit Wasser oder mit der für die Analyse verwendeten Lösungsmittel gefüllt. Eine rotierende Spritze mit langer Nadel und einem Rührstäbchen Paddel befestigt ist, die gewöhnlich ca. 0,3 ml Substratlösung wird auf die Probenzelle montiert. Eine thermoelektrische Vorrichtung mißt die Temperaturdifferenz zwischen der Probe und der Referenzzelle und mit einem &quot;Zellrückkopplungsnetzwerk&quot;, behält er diese Differenz auf Null durch Addieren oder Subtrahieren Wärme. Während des Experiments wird das Substrat in der Enzymlösung bei einem konstanten gewählten Temperatur eingespritzt. Wenn die enenzymatische Reaktion stattfindet, die Menge an Wärme freigesetzt oder absorbiert wird, ist proportional zu der Anzahl von Substratmolekülen, die in Produktmoleküle umgewandelt werden. Darüber hinaus ist die Wärmestromrate direkt mit der Geschwindigkeit der Reaktion stehen. Die gemessenen Daten, wie eine Abweichung der Spur von der ersten Wärmegrundlinie (Fig. 1) erscheinen, (μcal / sec) durch das Instrument auf die Probenzelle, die proportional zu der in der Probenzelle auftretenden Wärmestrom versorgt sind der thermische Leistungs über die Zeit. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" width="500" /> Fig. 1 ist. Schematische Darstellung der isothermen Titrationskalorimeter um enzymatische Reaktionen zu untersuchen. Einer enzymatischen Reaktion bei der Titration des Substrats (in der Injektionsspritze) auftritt in die Enzymlösung (in der Probenzelle) zu einer Änderung der thermoFehlleistung durch das Kalorimeter, notwendig, um die Temperaturdifferenz zwischen der Probenzelle und der Referenzzelle konstant zu halten veröffentlicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> Insgesamt ist die Wärmeänderung (Q) proportional zum molaren Enthalpie der Reaktion (AH) und der Anzahl von Molen des Produkts erzeugt (n), die wiederum durch den Gesamtvolumen-fache der Konzentration gegeben: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq3.jpg" width="200" /> (3) Die Produktbildung über die Zeit (dP / dt), die die Reaktionsgeschwindigkeit entspricht, kann somit der Wärmemenge über die gleiche Zeit (dQ / dt) durch die Beziehung erzeugt verwandt sind: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq4.jpg" width="150" /> (4) Nach dieser Gleichung um eine Michaelis-Menten-Plot zu erhalten ist es notwendig, zu messen i) die Gesamtstoff Enthalpie AH, und ii) der Wärmestrom dQ / dt bei verschiedenen Substratkonzentrationen. Gewöhnlich wird dies auf zwei verschiedene Experimente durchgeführt: Im ersten Versuch (Methode 1, M1), wird das Substrat in der Enzymlösung injiziert und die Wärme zur vollständigen Substratumsatz gemessen wird; in dem zweiten Experiment (Methode 2, M2), werden mehrere Injektionen des Substrats durchgeführt und die Rate der Wärmeerzeugung bei verschiedenen Substratkonzentrationen gemessen. Diese zwei Sätze von Daten ausreichend sind, um die kinetischen Parameter K m und k cat abzuleiten. Im vorliegenden Artikel wird eine allgemeine Protokoll, um die kinetischen Parameter für enzymatische Reaktionen unter Verwendung von ITC bestimmen beschrieben. Wir wendeten die Methode zur Harnstoff-Hydrolyse durch Canavalia ensiformis Harnstoffse als Bezugssystem. Die gute Übereinstimmung zwischen den mit dieser Methode erzielten Ergebnisse sowie die in der Literatur berichtet Daten zeigen die Zuverlässigkeit dieses Ansatzes.

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			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td style="width:323px;">dissolving in water and adjusting pH with NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">TRIZMA-Base</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td>dissolving in water and adjusting pH with HCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:111px;">Riedel-de-Haen</td>
			<td style="width:119px;">4270</td>
			<td>dissolving in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:111px;">Riedel-de-Haen</td>
			<td style="width:119px;">30427</td>
			<td>dissolving in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Urea</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U4128</td>
			<td>dissolving in water at 40 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Canavalia ensiformis urease (type C-3)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U0251</td>
			<td>dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">VP-ITC on Origin 7.0</td>
			<td style="width:111px;">MicroCal (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">SYS13901</td>
			<td>instrument&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0</td>
			<td style="width:111px;">MicroCal (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>data acquisition software supplied with the instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hot biological catalysis: isothermal titration calorimetry to characterize enzymatic reactions

Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ist eine gut beschriebene Technik, die die Wärme freigesetzt oder während einer chemischen Reaktion aufgenommen, sie als eine intrinsische Sonde zur Charakterisierung praktisch jeden chemischen Prozess misst. Heutzutage wird dieses Verfahren weitgehend angewendet, um thermodynamische Parameter des biomolekularen Bindungsgleichgewichte bestimmen. Zusätzlich ITC wurde gezeigt, können direkt zu messen Kinetik und thermodynamischen Parameter (k cat, K M, &amp;Dgr; H) von enzymatischen Reaktionen, obwohl diese Anwendung noch unzureichend genutzt werden. Als Wärme Änderungen spontan während der enzymatischen Katalyse kommen, die jedoch ITC keine Änderung oder die Kennzeichnung des Systems unter Analyse bedürfen und kann in Lösung durchgeführt werden. Darüber hinaus muss das Verfahren wenig Materialmenge. Diese Eigenschaften machen ITC eine unschätzbare, leistungsstarke und einzigartige Werkzeug zur Enzymkinetik in mehreren Anwendungen, wie zum Beispiel, Arzneimittelforschung studieren. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; In dieser Arbeit eine experimentelle ITK-basierte Methode zur Kinetik und Thermodynamik enzymatischer Reaktionen zu quantifizieren, wird gründlich beschrieben. Dieses Verfahren wird angewendet, um zu bestimmen, k cat und K M der enzymatischen Hydrolyse von Harnstoff durch Canavalia ensiformis (jack bean) Urease. Berechnung der intrinsischen molare Enthalpie (&amp;Dgr; H int) der Reaktion durchgeführt. Die so erhaltenen Werte sind konsistent mit früheren Daten in der Literatur berichtet, was die Zuverlässigkeit der Methode.

Urease (EC 3.5.1.5; amidohydrolase Harnstoff) ist ein Multiunternickelhaltige Enzym in Archaea, Bakterien, einzelligen Eukaryoten und Pflanzen gefunden. Dieses Protein wirkt in der letzten Stufe von organischen Stickstoffmineralisierung und katalysiert die Hydrolyse von Harnstoff zu Ammoniak und Carbamat, das spontan zerfällt, um ein zweites Molekül Ammoniak und Bicarbonat (Gleichung 6) 12 zu ergeben. <img fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51487/51487...

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Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Isotherme Titrationskalorimetrie Maßnahmen Wärmestrom freigegeben oder in chemischen Reaktionen absorbiert. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Enzym-Katalyse zu quantifizieren. In diesem Papier, das Protokoll für die Instrumental Setup-Experiment läuft, und Datenanalyse wird allgemein beschrieben, und der Charakterisierung der enzymatischen Hydrolyse von Harnstoff Bohne Urease aufgebracht.

Hot Biologische Katalyse: Isotherme Titrationskalorimetrie zu Enzymreaktionen Charakterisieren

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

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20.4K Aufrufe.  University of Bologna.  Isotherme Titrationskalorimetrie Maßnahmen Wärmestrom freigegeben oder in chemischen Reaktionen absorbiert. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Enzym-Katalyse zu quantifizieren. In diesem Papier, das Protokoll für die Instrumental Setup-Experiment läuft, und Datenanalyse wird allgemein beschrieben, und der Charakterisierung der enzymatischen Hydrolyse von Harnstoff Bohne Urease aufgebracht. 

Serie: Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Preparation of Silica Nanoparticles Through Microwave-assisted Acid-catalysis

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle diameters ranging from 30-250 nm by varying the reaction conditions. Through the selection of a microwave compatible solvent, silicic acid precursor, catalyst, and microwave irradiation time, these microwave-assisted methods were capable of overcoming the previously reported shortcomings associated with synthesis of silica nanoparticles using microwave reactors. The siloxane precursor was hydrolyzed using the acid catalyst, HCl. Acetone, a low-tan &#948; solvent, mediates the condensation reactions and has minimal interaction with the electromagnetic field. Condensation reactions begin when the silicic acid precursor couples with the microwave radiation, leading to silica nanoparticle sol formation. The silica nanoparticles were characterized by dynamic light scattering data and scanning electron microscopy, which show the materials&#39; morphology and size to be dependent on the reaction conditions. Microwave-assisted reactions produce silica nanoparticles with roughened textured surfaces that are atypical for silica sols produced by St&#246;ber&#39;s methods, which have smooth surfaces.

Silica nanoparticles were prepared using acid-catalysis of a siloxane precursor and microwave-assisted synthetic techniques resulting in the controlled growth of nanomaterials ranging from 30-250 nm in diameter. The growth dynamics can be controlled by varying the initial silicic acid concentration, time of the reaction, and temperature of reaction.

Herstellung von Silica-Nanopartikeln durch Mikrowellen-unterstützte Säure-Katalyse

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle ...

Forschung

Chemie

Retropinacol/Cross-pinacol Coupling Reactions - A Catalytic Access to 1,2-Unsymmetrical Diols

Unsymmetrical 1,2-diols are hardly accessible by reductive pinacol coupling processes. A successful execution of such a transformation is bound to a clear recognition and strict differentiation of two similar carbonyl compounds (aldehydes &#8594; secondary 1,2-diols or ketones &#8594; tertiary 1,2-diols). This fine-tuning is still a challenge and an unsolved problem for an organic chemist. There exist several reports on successful execution of this transformation but they cannot be generalized. Herein we describe a catalytic direct pinacol coupling process which proceeds via a retropinacol/cross-pinacol coupling sequence. Thus, unsymmetrical substituted 1,2-diols can be accessed with almost quantitative yields by means of an&#160;operationally simple performance under very mild conditions. Artificial techniques, such as syringe-pump techniques or delayed additions of reactants are not necessary. The procedure we describe provides a very rapid access to cross-pinacol products (1,2-diols, vicinal diols). A further extension of this new process, e.g. an enantioselective performance could provide a very useful tool for the synthesis of unsymmetrical chiral 1,2-diols.

A novel account for the synthesis of unsymmetrical 1,2-diols based on a retropinacol/cross-pinacol coupling mechanism is described. Due to the catalytic execution of this reaction a considerable improvement compared to conventional cross-pinacol couplings is achieved.

Retropinacol / Quer Pinakol-Kupplungen - Ein katalytischer Zugang zu 1,2-Diole unsymmetrische

Unsymmetrical 1,2-diols are hardly accessible by reductive pinacol coupling processes. A successful execution of such a transformation is bound to a clear ...

Mizoroki-Heck Cross-coupling Reactions Catalyzed by Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium Under Mild Reaction Conditions

Dichloro-bis(aminophosphine) complexes of palladium with the general formula of [(P{(NC5H10)3-n(C6H11)n})2Pd(Cl)2] (where n = 0-2), belong to a new family of easy accessible, very cheap, and air stable, but highly active and universally applicable C-C cross-coupling catalysts with an excellent functional group tolerance. Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium [(P(NC5H10)3)2Pd(Cl)2] (1), the least stable complex within this series towards protons; e.g. in the form of water, allows an eased nanoparticle formation and hence, proved to be the most active Heck catalyst within this series at 100 &#176;C and is a very rare example of an effective and versatile catalyst system that efficiently operates under mild reaction conditions. Rapid and complete catalyst degradation under work-up conditions into phosphonates, piperidinium salts and other, palladium-containing decomposition products assure an easy separation of the coupling products from catalyst and ligands. The facile, cheap, and rapid synthesis of 1,1',1"-(phosphinetriyl)tripiperidine and 1 respectively, the simple and convenient use as well as its excellent catalytic performance in the Heck reaction at 100 &#176;C make 1 to one of the most attractive and greenest Heck catalysts available.
We provide here the visualized protocols for the ligand and catalyst syntheses as well as the reaction protocol for Heck reactions performed at 10 mmol scale at 100 &#176;C and show that this catalyst is suitable for its use in organic syntheses.

Mizoroki-Heck Cross-coupling Reactions Catalyzed by Dichloro{bis[1,1&#039;,1&#039;&#039;-phosphinetriyltripiperidine]}palladium Under Mild Reaction Conditions

Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium [(P(NC5H10)3)2Pd(Cl)2] (1) is an easy accessible, cheap, and air stable, but highly active Heck catalyst with an excellent functional group tolerance that efficiently operates under mild reaction conditions to give the coupling products in very high yields.

Mizoroki-Heck-Kreuzkupplungsreaktionen von Dichloro {bis [1,1 &#39;, 1&#39;&#39; - (phosphinetriyl) tripiperidine]} katalysierte Palladium unter milden Reaktionsbedingungen

Dichloro-bis(aminophosphine) complexes of palladium with the general formula of [(P{(NC5H10)3-n(C6H11)n})2Pd(Cl)2] (where n = 0-2), belong to a new family ...

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. Recycling of the electron donors NADH or NADPH requires the use of additional enzymes and sacrificial substrates. Interestingly, several oxidoreductases accept hydrogen peroxide as electron donor. While being inexpensive, this reagent often reduces the stability of enzymes. A solution to this problem is the in situ generation of the cofactor. The continuous supply of the cofactor at low concentration drives the reaction without impairing enzyme stability. This paper demonstrates a method for the light-catalyzed in situ generation of hydrogen peroxide with the example of the heme-dependent fatty acid decarboxylase OleTJE. The fatty acid decarboxylase OleTJE was discovered due to its unique ability to produce long-chain 1-alkenes from fatty acids, a hitherto unknown enzymatic reaction. 1-alkenes are widely used additives for plasticizers and lubricants. OleTJE has been shown to accept electrons from hydrogen peroxide for the oxidative decarboxylation. While addition of hydrogen peroxide damages the enzyme and results in low yields, in situ generation of the cofactor circumvents this problem. The photobiocatalytic system shows clear advantages regarding enzyme activity and yield, resulting in a simple and efficient system for fatty acid decarboxylation.

We describe a protocol for the light-catalyzed generation of hydrogen peroxide &#8212; a cofactor for oxidative transformations.

Lichtgetriebene enzymatische Decarboxylierung

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of metabolic transformations. Hyperpolarization via dissolution DNP circumvents part of the sensitivity issues thanks to the large out-of-equilibrium nuclear magnetization stemming from the electron-to-nucleus spin polarization transfer. The high NMR signal obtained can be used to monitor chemical reactions in real time. The downside of hyperpolarized NMR resides in the limited time window available for signal acquisition, which is usually on the order of the nuclear spin longitudinal relaxation time constant, T1, or, in favorable cases, on the order of the relaxation time constant associated with the singlet-state of coupled nuclei, TLLS. Cellular uptake of endogenous molecules and metabolic rates can provide essential information on tumor development and drug response. Numerous previous hyperpolarized NMR studies have demonstrated the relevancy of pyruvate as a metabolic substrate for monitoring enzymatic activity in vivo. This work provides a detailed description of the experimental setup and methods required for the study of enzymatic reactions, in particular the pyruvate-to-lactate conversion rate in presence of lactate dehydrogenase (LDH), by hyperpolarized NMR.

The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

Die Auflösung dynamische Kernpolarisation Besetzung für Echtzeit-enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit Messungen von NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

A Protocol for Safe Lithiation Reactions Using Organolithium Reagents

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents warrants proper technique, thorough training, and proper personal protective equipment. To aid in the training of researchers using organolithium reagents, a thorough, step-by-step protocol for the safe and effective use of tert-butyllithium on an inert gas line or within a glovebox is described. As a model reaction, preparation of lithium tert-butyl amide by the reaction of tert-butyl amine with one equivalent of tert-butyl lithium is presented.

The safe and proper use of organolithium reagents is described.

Ein Protokoll für sichere Lithiierungen Mit Organolithiumreagentien

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. Their synthesis by conventional organic chemistry often requires tedious multi-step synthesis processes, with difficult control of the stereochemical outcome. We present a protocol to enzymatically synthetize amino alcohols starting from the readily available L-lysine in 48 h. This protocol combines two chemical reactions that are very difficult to conduct by conventional organic synthesis. In the first step, the regio- and diastereoselective oxidation of an unactivated C-H bond of the lysine side-chain is catalyzed by a dioxygenase; a second regio- and diastereoselective oxidation catalyzed by a regiodivergent dioxygenase can lead to the formation of the 1,2-diols. In the last step, the carboxylic group of the alpha amino acid is cleaved by a pyridoxal-phosphate (PLP) decarboxylase (DC). This decarboxylative step only affects the alpha carbon of the amino acid, retaining the hydroxy-substituted stereogenic center in a beta/gamma position. The resulting amino alcohols are therefore optically enriched. The protocol was successfully applied to the semipreparative-scale synthesis of four amino alcohols. Monitoring of the reactions was conducted by high performance liquid chromatography (HPLC) after derivatization by 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Straightforward purification by solid-phase extraction (SPE) afforded the amino alcohols with excellent yields (93% to &#62;95%).

Chiral amino alcohols are versatile molecules for use as scaffolds in organic synthesis. Starting from L-lysine, we synthesize amino alcohols by an enzymatic cascade reaction combining diastereoselective C-H oxidation catalyzed by dioxygenase followed by cleavage of the carboxylic acid moiety of the corresponding hydroxyl amino acid by a decarboxylase.

Enzymatische Kaskade Reaktionen für die Synthese von chirale Alkohole Aminosäure L-Lysin

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Employing Pressurized Hot Water Extraction (PHWE) to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory

A recently developed pressurized hot water extraction (PHWE) method which utilizes an unmodified household espresso machine to facilitate natural products research has also found applications as an effective teaching tool. Specifically, this technique has been used to introduce second- and third-year undergraduates to aspects of natural products chemistry in the laboratory. In this report, two experiments are presented: the PHWE of eugenol and acetyleugenol from cloves and the PHWE of seselin and (+)-epoxysuberosin from the endemic Australian plant species Correa reflexa. By employing PHWE in these experiments, the crude clove extract, enriched in eugenol and acetyleugenol, was obtained in 4-9% w/w from cloves by second-year undergraduates and seselin and (+)-epoxysuberosin were isolated in yields of up to 1.1% w/w and 0.9% w/w from C. reflexa by third-year students. The former exercise was developed as a replacement for the traditional steam distillation experiment providing an introduction to extraction and separation techniques, while the latter activity featured guided-inquiry teaching methods in an effort to simulate natural products bioprospecting. This primarily derives from the rapid nature of this PHWE technique relative to traditional extraction methods that are often incompatible with the time constraints associated with undergraduate laboratory experiments. This rapid and practical PHWE method can be used to efficiently isolate various classes of organic molecules from a range of plant species. The complementary nature of this technique relative to more traditional methods has also been demonstrated previously.

Employing Pressurized Hot Water Extraction PHWE to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory

Here, we employ a pressurized hot water extraction (PHWE) method, which utilizes an unmodified household espresso machine to introduce undergraduates to natural products chemistry in the laboratory. Two experiments are presented: PHWE of eugenol and acetyleugenol from cloves and PHWE of seselin and (+)-epoxysuberosin from the Australian plant Correa reflexa.

Einsatz von unter Druck stehenden Heißwasserextraktion (PHWE), Naturstoffchemie im Grundstudium Labor zu erkunden

A recently developed pressurized hot water extraction (PHWE) method which utilizes an unmodified household espresso machine to facilitate natural products ...

Imine Metathesis by Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared according to the methodology developed by surface organometallic chemistry (SOMC). In this framework, catalytic cycles can be determined by isolating crucial intermediates. All air-sensitive materials are handled under inert atmosphere (using gloveboxes or a Schlenk line) or high vacuum lines (HVLs, &#60;10-5 mbar). The preparation of SiO2-700 (silica dehydroxylated at 700 &#176;C) and subsequent applications (the grafting of complexes and catalytic runs) requires the use of HVLs and double-Schlenk techniques. Several well-known characterization methods are used, such as Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), elemental microanalysis, solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy (SSNMR), and state-of-the-art dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy (DNP-SENS). FTIR and elemental microanalysis permit scientists to establish the grafting and its stoichiometry. 1H and 13C SSNMR allows the structural determination of the hydrocarbon ligands coordination sphere. DNP SENS is an emerging powerful technique in solid characterization for the detection of poorly sensitive nuclei (15N, in our case). SiO2-700 is treated with about one equivalent of the metal precursor compared to the amount of surface silanol (0.30 mmol&#183;g-1) in pentane at room temperature. Then, volatiles are removed, and the powder samples are dried under dynamic high vacuum to afford the desired materials [(&#8801;Si-O-)Hf(&#951;2&#960;-MeNCH2)(&#951;1-NMe2)(&#951;1-HNMe2)]. After a thermal treatment under high vacuum, the grafted complex is converted into metal imido silica complex [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)]. [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] effectively promotes the metathesis of imines, using the combination of two imine substrates, N-(4-phenylbenzylidene)benzylamine, or N-(4-fluorobenzylidene)-4-fluoroaniline, with N-benzylidenetert-butylamine as substrates. A significantly lower conversion is observed with the blank runs; thus, the presence of the imido group in [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is correlated to the catalytic performance.

A new group IV metal catalyst for imine metathesis is prepared by grafting amine metal complex onto dehydroxylated silica. Surface metal fragments are characterized using FT-IR, elemental microanalysis, and solid-state NMR spectroscopy. Further dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy experiments complement the determination of the coordination sphere.

Imine Metathesis von Silica-unterstützten Katalysatoren mit der Methodik der Oberflächenorganometallischen Chemie

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared ...

A Microwave-Assisted Direct Heteroarylation of Ketones Using Transition Metal Catalysis

Heteroarylation introduces heteroaryl fragments to organic molecules. Despite the numerous available reactions reported for arylation via transition metal catalysis, the literature on direct heteroarylation is scarce. The presence of heteroatoms such as nitrogen, sulfur and oxygen often make heteroarylation a challenging research field due to catalyst poisoning, product decomposition and the rest. This protocol details a highly efficient direct &#945;-C(sp3) heteroarylation of ketones under microwave irradiation. Key factors for successful heteroarylation include the use of XPhos Palladacycle Gen. 4 Catalyst, excess base to suppress side reactions and the high temperature and pressure achieved in a sealed reaction vial under microwave irradiation. The heteroarylation compounds prepared by this method were fully characterized by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H NMR), carbon nuclear magnetic resonance spectroscopy (13C NMR) and high-resolution mass spectrometry (HRMS). This methodology has several advantages over literature precedents including broad substrate scope, rapid reaction time, greener procedure and operational simplicity by eliminating the preparation of intermediates such as silyl enol ether. Possible applications for this protocol include, but are not limited to, diversity-oriented synthesis for the discovery of biologically active small molecules, domino synthesis for the preparation of natural products and ligand development for new transition metal catalytic systems.

Heteroaryl compounds are important molecules utilized in organic synthesis, medicinal and biological chemistry. A microwave-assisted heteroarylation using palladium catalysis provides a rapid and efficient method to attach heteroaryl moieties directly to ketone substrates.

Eine Mikrowellen-unterstützte direkte Heteroarylation von Ketonen mit Übergangsmetallkatalyse

Heteroarylation introduces heteroaryl fragments to organic molecules. Despite the numerous available reactions reported for arylation via transition metal ...