אנו מודים לLihong יין לקבלת סיוע טכני. NVD הוא נמען פרס חוקר צעיר NARSAD של ונתמך גם על ידי מענקים מNIH (5 K99 MH095825-02). מחקר במעבדה Fishell נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות, המכון הלאומי לבריאות הנפש (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), מכון לאומי להפרעות ושבץ (5 R01 NS081297-02 נוירולוגיות, 1 P01 NS074972 -01A1) וסימונס הקרן.

טופלו כל בעלי החיים בהתאם לתקנות וההנחיות של ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של בית הספר באוניברסיטת ניו יורק לרפואה. זני עכבר נקבות עכברים שוויצריים וובסטר הניתנים על ידי Taconic שמשו לניסויים אלה. על מנת למקד ספציפית interneurons שכבה שטחי, עוברי E15.5 היו בשימוש. הערה: פלסמיד המשמש בעבודה זו (Dlx5 / 3 מיקרוגרם / μl פלסמיד 6.eGFP) נוצרה תוך שימוש בטכניקות שיבוט סטנדרטיים. EGFP cDNA שובט לתוך פלסמיד / 6-Pmin-הפולה Dlx5. פלסמיד זו זמין על פי בקשה (demarn02@nyumc.org). .1 הכנת Microinjection מטפטף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את חום חולץ # 2-860. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ולאבטח את נימי הזכוכית ליד נימה. בדוק שהקוטר החיצוני (OD) של פיפטה הוא בערך 30 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן &quot;למשוך&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הנימים. החלק התחתון הוא המחט. מחק את החלק העליון. </li></ol> .2 הרדמה נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא isoflurane מכיל. הערה: Isoflurane היא ההרדמה המועדפת בשל הפעולה מהירה שלה ושכיחות נמוכה של תופעות לוואי. Pentobarbital אפשרות נוספת; עם זאת, סובלנות של תרופה זו היא משתנה ועלולה להוביל לשיעור תמותה גבוה יותר מisoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את זרימת isoflurane ל4-5% ב0.5-1 L O / 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שסתום לתא פתוח ואילו שסתום למתאם הראש סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר בהריון בתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר העכבר כדי ללכת תחת השפעת ההרדמה. זה ייקח בערך 2-3 דק &#39;. בדוק את קצב הנשימה. אם העכבר מתחיל נשימת יתר, להוריד את המינון של isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי העכבר מורדם, מייד להסיר אותו מהחדר. מניחים בצד גחונו על כרית החימום ואניnsert הראש במסכה שתמשיך לספק isoflurane לאורך כל הניתוח. הקפד להחליף את זרימת isoflurane מהתא עד לצינורות המחברים את חתיכת מתאם הראש. שים טיפה של חומר סיכה עין בכל עין ולסגור את העיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את כרית החימום ל36 ° מעלות צלזיוס כדי למזער היפותרמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגעה להיעדר רפלקסים רגל וזנב על ידי צובט את רגליו האחוריות וזנב. </li></ol> .3 ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות את העור המכסה את הבטן עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי למשוך את העור כלפי מעלה. לאחר כל ניתוח, לשטוף את כל הכלים עם חומר ניקוי ומים, ומעוקר ב72 ° CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן אנכי (כ -2 ס&quot;מ) לאורך קו האמצע מתחיל באמצע הדרך בין הזוגות שלישיים והרביעי של בלוטות החלב. השתמש במספרי ניתוח עדינים. יש להיזהר שלא לפגוע בקיר הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפריד את העור מהצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את העורקיםוורידים על קיר הבטן. לעשות עוד חתך אנכי 2 סנטימטר דרך הצפק (הימנעות כלי) כדי לחשוף את חלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את העור ודופן בטן בכל צד הימנעות כיווץ העורקים. הערה: אם העורקים ניקבו בטעות, להקריב בעלי החיים באופן מיידי על ידי ביצוע נקע בצוואר הרחם או ממנת יתר isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מראש לחמם את PBS סטרילי ל37 מעלות צלזיוס. כסה את ווי התלייה עם PBS הלח קים מגבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחות בחלל הבטן החשופה עם PBS. חזור על פעולה זו מספר פעמים בעת ביצוע הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים עגולים, משוך בעדינות את השרשרת העוברית (E15.5) מהחלל. תן את שאר השרשרת במגבונים לחים. התחל על ידי חשיפת מחצית מהרחם ראשונה. ברגע שעובר בו הם electroporated, להביא אותו חזרה פנימה, ואז לעבוד על המחצית השנייה. </li></ol> .4 Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך להשתמש במלקחיים עגולים כדי לתפעל את העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ויsualize חדרים לרוחב. החדרים לרוחב לרוץ לאורך קו האמצע (איור 1b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ירוקים (צילומים: 10% w / v) מהיר לפתרון DNA לתערובת 01:20 לדמיין אותו במהלך ההזרקה. הכן את פתרון DNA על ידי המסת גלולה המתקבלת מפרוטוקול טיהור maxi-prep סטנדרטי במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש micropipettes מראש משך עם בוכנה להזרקה 1 מ&quot;ל של תמיסת DNA (Dlx5 / 6-eGFP, 3 מיקרוגרם / μl) עם גרין המהיר. חותך את קצה micropipette עם מלקחיים # קנס 5 (דומון) לעזוב מ&quot;מ אורך 6 מתחילת הכתף אל הקצה של הקצה של המחט לפני טעינת פיפטה. החזק את ראשו של העובר עם פינצטה העגולה. הזן את המוח עם פיפטה ב45 ° זווית מכוונת לרוחב החדר ממוקם בסמוך לקו האמצע. אם המחט חודרת דרך החדר, לחזור לאט פיפטה כפי שאתה משתמש הבוכנה להזריק DNA. החדר צריך להפוך ירוק כאשרפתרון מתחיל למלא אותו. בשלב זה, מפסיק לנוע פיפטה ולהזריק 1 מ&quot;ל של DNA. בעדינות, למשוך את פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את electroporator CUY21 לחמישה 45V פולסים של 50 אלפיות שניים במרווחים על ידי 950 אלפיות שניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אלקטרודות ההנעה 5 מ&quot;מ לעוברי E15.5. טובלים את האלקטרודות בPBS כדי להבטיח העברת נוכחית יעילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את משוטי אלקטרודה סביב ראשו של העובר עם ההנעה החיובית על החדר המכיל את פתרון DNA. מעט נמוך יותר ההנעה החיובית עם בגין שלילי אחד כדי ליצור נוכחי הגחון דרך הוד ganglionic. מניפולציה זה תהיה למזער ביטוי מחוץ לרחם בתאים פירמידליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהניח את האלקטרודות, לספק דופק על ידי לחיצה על דוושת רגל פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את אלקטרודות ולנגב אותם נקי. חזור על שלבים 4.6-4.9 עם כל עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , לאחר electroporating כל העוברים לשפוך 3 מ&quot;ל של PBS לתוך חלל הבטן ולהחזיר אותם לחלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">התפר ראשון דופן הבטן עם מחט מעוקלת ו5-0 תפר משי ולאחר מכן העור. החל לידוקאין (4%) על הפצע. לנהל 120 מ&quot;ג / קילוגרם של הצפק התוך האספירין לשיכוך כאבים. הערה: כל ההליך צריכה להתבצע ב20 דקות או פחות. מומלץ כי מתחילים electroporate רק כמה עוברים כדי לשמור על זמן פעולה קצר. ניתוחים ממושכים יקטינו את שיעור ההישרדות של העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיה מצינורות ההרדמה ולאפשר התאוששות בכרית החימום על נייר לנגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור חיה לכלוב, לשמור אותו על כרית החימום על 37 מעלות צלזיוס ולנטר את מצב הבריאות. בעלי החיים בדרך כלל לסבול את הניתוח היטב ומתחילים לנוע באיטיות זמן קצר לאחר שהם הוסרו מצינורות ההרדמה. אם דימום או עייפות מוגזם הוא ציין, להקריב בעלי החיים באופן מיידי על ידי ביצוע IACUC אישר נהלי המתת חסד כגון נקע בצוואר הרחם או ממנת יתר הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור כלוב לvivarium. הנקבות ללדת באופן טבעי. </li></ol>

<ol>
	<li>Fishell, G., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+inhibition+within+the+telencephalon:+&amp;#34;where+the+wild+things+are&amp;#34;.">Mechanisms of inhibition within the telencephalon: &amp;#34;where the wild things are&amp;#34;.</a> Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).</li><li>Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+distinct+progenitor+populations+in+the+lateral+ganglionic+eminence:+implications+for+striatal+and+olfactory+bulb+neurogenesis.">Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis.</a> J Neurosci. 23, 167-174 (2003).</li><li>Eisenstat, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLX-1,+DLX-2,+and+DLX-5+expression+define+distinct+stages+of+basal+forebrain+differentiation.">DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation.</a> J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).</li><li>Batista-Brito, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+integration+of+cortical+interneurons+into+a+functional+network.">The developmental integration of cortical interneurons into a functional network.</a> Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).</li><li>Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiologically+distinct+temporal+cohorts+of+cortical+interneurons+arise+from+telencephalic+Olig2-expressing+precursors.">Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors.</a> J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).</li><li>Miyoshi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+fate+mapping+reveals+that+the+caudal+ganglionic+eminence+produces+a+large+and+diverse+population+of+superficial+cortical+interneurons.">Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons.</a> J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).</li><li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+Dlx-2+(Tes-1)+gene+is+expressed+in+spatially+restricted+domains+of+the+forebrain,+face+and+limbs+in+midgestation+mouse+embryos.">The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos.</a> Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).</li><li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+expression+of+Dlx-1,+Dlx-2+(Tes-1),+Gbx-2,+and+Wnt-3+in+the+embryonic+day+12.5+mouse+forebrain+defines+potential+transverse+and+longitudinal+segmental+boundaries.">Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries.</a> J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).</li><li>Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+expression+of+a+member+of+a+new+family+of+murine+Distal-less+homeobox+genes+in+the+developing+forebrain.">Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain.</a> The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).</li><li>Close, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satb1+is+an+activity-modulated+transcription+factor+required+for+the+terminal+differentiation+and+connectivity+of+medial+ganglionic+eminence-derived+cortical+interneurons.">Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons.</a> J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).</li><li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes.">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472, 351-355 (2011).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

מגבלות של הטכניקה בעוד טכניקה זו מאפשרת ניתוח אוטונומי תא של תהליכים בתא, זה לא מתאים לניתוח אוכלוסייה. Electroporations מאוד דליל עם פחות מאלף תאים electroporated לכל מוח. כתוצאה מכך, הטכניקה לא ניתן להשתמש כדי להעריך את השלכות התנהגות הנובעות ...

את חלק הארי של interneurons GABAergic קליפת המוח מקורן שני מבנים עובריים חולפים בשם הוד ganglionic המדיאלי וזנב (MGE וCGE בהתאמה) 4. Parvalbumin וinterneurons סומטוסטטין להביע מקורן בMGE ואילו Calretinin (Cr), Vasointestinal פפטיד (VIP) וReelin (Re) להביע interneurons מקורן CGE. ניתן להבחין תת interneuron אלה על ידי תאריכי הלידה שלהם. תת נגזר MGE נולדים בין יום העוברי 9.5 (E9.5) וE16.5 5,6. בניגוד לכך, interneurons CGE נגזר נולד מE12.5 דרך E18.5 עם הייצור שלהם הגיע לשיא של E15.5 6. המיקוד הגנטי של אוכלוסייה בסוף נולד זה, עם זאת, נותר חמקמק. גנים העכבריים דיסטלי פחות (DLX) באים לידי ביטוי אך ורק במוח הקדמי הגחון פיתוח 3. interneurons GABAergic ונוירונים הקרנת striatal אבל תאים פירמידליים לא בקליפת המוח לבטא Dlx1, 2,5, ו -6 גנים בשלבי התפתחותיים מוקדמים 3. ואכן, גני DLX באים לידי ביטוי באזור subventricular MGE וCGE (SVZ) בכל אבות GABAergic. ביטוי של גנים אלה הופך מוגבל כדי לבחור תת בשלבי postmitotic 7-9. ראיות ניסיוניות קודמות הראו כי האלמנט משפר Dlx5 / 6 מאפשר למיקוד סלקטיבי של שושלות GABAergic במודלים של עכברים מהונדסים 2. אנחנו בדקנו את השימוש באחד מהאלמנטים משפר אלה בהקשר של ביטוי episomal במוח העכבר המתפתח. אנו תת משובטים האלמנט משפר Dlx5 / 6 יחד עם אמרגן מינימאלי והחלבון המשופר הירוק הניאון (eGFP) בפלסמיד עמוד השדרה bluescript (BS) (איור 1). אנחנו הצגנו את הפלסמיד באמצעות ברחם electroporation בE15.5 למקד Cr-, VIP באופן סלקטיבי והוא זכר תת 3,8,10. הטכניקה שלנו מאפשרת לelectroporation הדליל, המאפשרהבנייה מחדש של תכונות מורפולוגיות של תאים לחרוך. בנוסף, הרמות גבוהות במיוחד של ביטוי גנים בתאי עצב בקליפת המוח GABAergic מאפשרת ללימודים פונקציונליים. בצענו הפסד ורווח של מחקרים לתפקד באמצעות מספר סוג בר והגנים שליליים דומיננטיים 11.

<table><tbody><tr><td>Electroporator&amp;nbsp; with pedal</td><td>Protech International</td><td>CUY21</td><td></td></tr><tr><td>5 mm paddle electrodes&amp;nbsp;</td><td>Protech International</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Heating pad&amp;nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>DCT-15</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Instruments P30 Puller&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>3282322</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac Anesthesia Systems</td><td>Harvard Apparatus</td><td>726425</td><td></td></tr><tr><td>Delicate Operating Scissors 4.75&quot; Straight Sharp/Sharp</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Silk Black Braid 18&quot; C-1 Box 36&amp;nbsp;</td><td>Roboz</td><td>SUT-1073-21</td><td></td></tr><tr><td>Micro Clip Applying Forceps 5.5&quot;</td><td>Roboz</td><td>RS-5410</td><td></td></tr><tr><td>2 Clamp scissors</td><td>Roboz</td><td>RC-4894</td><td></td></tr><tr><td>Holding forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11031-15</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary tubing&amp;nbsp;</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td>Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile PBS</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr></tbody></table>

subtype-selective electroporation of cortical interneurons

המחקר של התבגרות מערכת עצבים מרכזית (CNS) מסתמך על מיקוד גנטי של אוכלוסיות נוירונים. עם זאת, המשימה של הגבלת הביטוי של גנים המעניינים את תת עצביים ספציפיים הוכיחה להפליא מאתגרת בשל המחסור היחסי של אלמנטי אמרגן ספציפיים. interneurons GABAergic מהווה אוכלוסייה עצבית עם מגוון גנטי ומורפולוגיים נרחבים. ואכן, יותר מ -11 תת שונה של interneurons GABAergic מתאפיינים בקליפת העכבר 1. כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם למיקוד סלקטיבי של אוכלוסיות GABAergic. השגנו מיקוד סלקטיבי תת סוג של interneurons GABAergic על ידי שימוש באלמנט משפר של שעתוק homeobox גורמי Dlx5 וDlx6, homologues של גן דיסטלי פחות דרוזופילה (DLL) 2,3, לנהוג הביטוי של גנים ספציפיים באמצעות electroporation ברחם.

אנחנו התאמנו את טכניקת electroporation ברחם כדי להשיג מיקוד ספציפי סוג התא של תאי עצב התבגרות. לנהוג הביטוי של eGFP בinterneurons נגזר CGE, השתמשנו באלמנט משפר Dlx5 / 6 ומוגבלים הזריקות שלנו לE15.5, השלב שבו רוב interneurons נגזר CGE נוצרים. אנחנו ביצענו את הניתוח בP8 וP15 11 (איורי?...

Watch this Scientific Journal Video about Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons at JoVE.com

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Electroporation תת סוג סלקטיבי של בקליפת המוח interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

subtype-selective-electroporation-of-cortical-interneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Views.  New York University School of Medicine. This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Video: Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Neonatal Pial Surface Electroporation

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and gliogenesis, including after injury. However, methods for genetically interrogating these progenitor populations and tracking their lineages had been limited owing to a lack of specificity or time consuming production of viruses. Thus, progress in this region has been relatively slow with only a handful of investigations of this location. Electroporation has been used for over a decade to study neural stem cell properties in the embryo, and more recently in the postnatal brain. Here we describe an efficient, rapid, and simple technique for the genetic manipulation of pial surface progenitors based on an adapted electroporation approach. Pial surface electroporation allows for facile genetic labeling and manipulation of these progenitors, thus representing a time-saving and economical approach for studying these cells.

The pial surface is a unique progenitor zone in the CNS that is receiving increasing attention. Herein, we detail a method for rapid genetic manipulation of this progenitor zone using a modified electroporation method. This procedure can be used for cellular and molecular investigations of cell lineages and signaling pathways involved in cell differentiation and to elucidate the fate and properties of daughter cells.

Electroporation שטח pial ילודים

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

מדריך ל<em&gt; בשנת vivo</em&gt; הקלטה חד-יחידה מקליפת המוח המעכבת interneurons המזוהות Optogenetically

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

<meta charset="utf8"></head><body>נוקאאוט גנטי CRISPR/Cas9 באורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים באמצעות אלקטרופורציה

Electroporation of Sliced Human Cortical Organoids for Studies of Gene Function

Human cortical organoids have become important tools for studying human brain development, neurodevelopmental disorders, and human brain evolution. Studies analyzing gene function by overexpression or knockout have been instrumental in animal models to provide mechanistic insights into the regulation of neocortex development. Here, we present a detailed protocol for CRISPR/Cas9-mediated acute gene knockout by electroporation of sliced human cortical organoids. The slicing of cortical organoids aids the identification of ventricle-like structures for injection and subsequent electroporation, making this a particularly well-suited model for acute genetic manipulation during human cortical development. We describe the design of guide RNAs and the validation of targeting efficiency in vitro and in cortical organoids. Electroporation of cortical organoids is performed at mid-neurogenic stages, enabling the targeting of most major cell classes in the developing neocortex, including apical radial glia, basal progenitor cells, and neurons. Taken together, the electroporation of sliced human cortical organoids represents a powerful technique to investigate gene function, gene regulation, and cell morphology during cortical development.

<meta charset="utf8"></head><body>אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים לחקר תפקוד גנים

Here, we present the acute genetic manipulation of sliced human cortical organoids by electroporation. These cortical organoid models are particularly amenable to injection as ventricle-like structures can be readily identified after slicing, enabling the functional investigation of human cortical development, neurodevelopmental disorders, and cortical evolution.

אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים לחקר תפקוד גנים

Human cortical organoids have become important tools for studying human brain development, neurodevelopmental disorders, and human brain evolution. ...

Developmental Biology

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian corticogenesis. This procedure takes advantage of the brain ventricles to allow the introduction of DNA of interest and uses a pair of electrodes to direct the entrance of the genetic material into the cells lining the ventricle, the neural stem cells. This method allows researchers to label the desired cells and/or manipulate the expression of genes of interest in those cells. It has multiple applications, including assays targeting neuronal migration, lineage tracing, and axonal pathfinding. An important feature of this method is its temporal and regional control, allowing circumvention of potential problems related with embryonic lethality or the lack of specific CRE driver mice. Another relevant aspect of this technique is that it helps to considerably reduce the economic and temporal limitations that involve the generation of new mouse lines, which become particularly important in the study of interactions between cell types that originate in distant areas of the brain at different developmental ages. Here we describe a double electroporation strategy that enables targeting of cell populations that are spatially and temporally separated. With this approach we can label different subtypes of cells in different locations with selected fluorescent proteins to visualize them, and/or we can manipulate genes of interest expressed by these different cells at the appropriate times. This strategy enhances the potential of in utero electroporation and provides a powerful tool to study the behavior of temporally and spatially separated cell populations that migrate to establish close contacts, as well as long-range interactions through axonal projections, reducing temporal and economic costs.

Double in utero electroporation allows targeting cell populations that are spatially and temporally separated. This technique is useful to visualize interactions between those cell populations using fluorescent proteins in normal conditions but also after functional experiments to perturb genes of interest.

כפול ברחם באמצעות אלקטרופורציה ועד לאוכלוסיית היעד באופן זמני ולאוכלוסיות שאינן מופרדות

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian development. In utero electroporation is a key technique for the manipulation of gene expression in the embryonic mammalian brain in vivo. A protocol for in utero electroporation of the embryonic neocortex of ferrets, a small carnivore, is presented here. The ferret is increasingly being used as a model for neocortex development, because its neocortex exhibits a series of anatomical, histological, cellular, and molecular features that are also present in human and nonhuman primates, but absent in rodent models, such as mouse or rat. In utero electroporation was performed at embryonic day (E) 33, a midneurogenesis stage in ferret. In utero electroporation targets neural progenitor cells lining the lateral ventricles of the brain. During neurogenesis, these progenitor cells give rise to all other neural cell types. This work shows representative results and analyses at E37, postnatal day (P) 1, and P16, corresponding to 4, 9, and 24 days after in utero electroporation, respectively. At earlier stages, the progeny of targeted cells consists mainly of various neural progenitor subtypes, whereas at later stages most labeled cells are postmitotic neurons. Thus, in utero electroporation enables the study of the effect of genetic manipulation on the cellular and molecular features of various types of neural cells. Through its effect on various cell populations, in utero electroporation can also be used for the manipulation of histological and anatomical features of the ferret neocortex. Importantly, all these effects are acute and are performed with a spatiotemporal specificity determined by the user.

Presented here is a protocol to perform genetic manipulation in the embryonic ferret brain using in utero electroporation. This method allows for targeting of neural progenitor cells in the neocortex in vivo.

ב Vivo מיקוד של תאי הצבי העצבי Neocortex חמוס על ידי באלקטרופורציה ברחם

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

Electroporation תת סוג סלקטיבי של בקליפת המוח interneurons

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג'ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

Electroporation שטח pial ילודים

מדריך ל

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים לחקר תפקוד גנים

אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים לחקר תפקוד גנים

אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים לחקר תפקוד גנים

השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל

כפול ברחם באמצעות אלקטרופורציה ועד לאוכלוסיית היעד באופן זמני ולאוכלוסיות שאינן מופרדות

ב Vivo מיקוד של תאי הצבי העצבי Neocortex חמוס על ידי באלקטרופורציה ברחם