نحن ممتنون لLIHONG يين للمساعدة التقنية. NVD هو حاصل على جائزة NARSAD يونغ الباحث ومدعومة أيضا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (5 MH095825-02 K99). ويدعم البحوث في المختبر Fishell من قبل المعهد الوطني للصحة، والمعهد الوطني للصحة العقلية (5 MH095147-02 R01، R01 MH071679-09 5)، المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (5 R01 NS081297-02، 1 P01 NS074972 -01A1) ومؤسسة سيمونز.

تم علاج جميع الحيوانات وفقا للأنظمة والمبادئ التوجيهية للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من كلية الطب بجامعة نيويورك. الماوس سلالات تم استخدام الفئران الإناث وبستر السويسرية التي تقدمها تاكونيك لهذه التجارب. من أجل استهداف تحديدا interneurons طبقة سطحية، واستخدمت الأجنة E15.5. ملاحظة: البلازميد المستخدمة في هذا العمل (Dlx5 / 6.eGFP بلازميد 3 ميكروغرام / ميكرولتر) تم إنشاؤها باستخدام تقنيات الاستنساخ القياسية. تم استنساخ EGFP [كدنا] إلى Dlx5 / 6 Pmin-بوليا بلازميد. هذا البلازميد هو متاح عند الطلب (demarn02@nyumc.org). 1. إعداد حقن مكروي الماصات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين مجتذب الحرارة # 2-860. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع وتأمين الزجاج الشعرية بالقرب من خيوط. تأكد من أن القطر الخارجي (OD) من ماصة هو ما يقرب من 30 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر &quot;سحب&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشعرية بعناية. الجزء السفلي هو الإبرة. تجاهل الجزء العلوي. </li></ol> 2. التخدير الداخلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غرفة تحتوي على الأيزوفلورين. ملاحظة: الأيزوفلورين هو المخدر المفضل بسبب عملها السريع وتدني نسبة الآثار الجانبية. بنتوباربيتال هو خيار آخر؛ ومع ذلك، والتسامح من هذا الدواء هو متغير ويمكن أن يؤدي إلى معدل وفيات أعلى من الأيزوفلورين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط تدفق الأيزوفلورين إلى 4-5٪ في 0.5-1 لتر / دقيقة O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن صمام للغرفة مفتوحة في حين يتم إغلاق صمام لمحول الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس حاملا في الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح الماوس للذهاب تحت تأثير التخدير. هذا وسوف يستغرق حوالي 2-3 دقائق. تحقق من معدل التنفس. إذا كان الماوس يبدأ اللهاث، وانخفاض جرعة من الأيزوفلورين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مخدرة الماوس، وإزالة فورا أنه من الغرفة. وضعه الجانب بطني حتى على لوحة التدفئة وأناnsert رأسه في قناع التي سوف تستمر في تزويد الأيزوفلورين طوال الجراحة. تأكد من التبديل تدفق الأيزوفلورين من غرفة إلى أنابيب يربط قطعة محول الرأس. وضع قطرة من زيوت التشحيم العين في كل عين وإغلاق العينين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين سادة التدفئة إلى 36 ° C درجة للحد من انخفاض حرارة الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من عدم وجود ذيل القدم وردود الفعل من قبل معسر الكفوف الخلفية والذيل. </li></ol> 3. جراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير الجلد الذي يغطي البطن مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لسحب الجلد لأعلى. بعد كل جراحة، وغسل جميع الصكوك مع المنظفات والماء، وتعقيمها عند 72 درجة CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق عمودي صغير (حوالي 2 سم) على طول خط الوسط ابتداء من منتصف المسافة بين أزواج الثالثة والرابعة من الغدد الثديية. استخدام مقص الجراحة الدقيقة. الحرص على عدم تلف جدار البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل بلطف الجلد من الصفاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور الشرايينوالأوردة على جدار البطن. جعل شق آخر 2 سم الرأسي من خلال الصفاق (تجنب السفن) لفضح تجويف البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المشبك الجلد وجدار البطن على كل جانب تجنب تحامل الشرايين. ملاحظة: إذا تم ثقب الشرايين عن طريق الخطأ، تضحية الحيوان فورا عن طريق إجراء خلع عنق الرحم أو جرعة زائدة الأيزوفلورين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تدفئة برنامج تلفزيوني العقيمة إلى 37 درجة مئوية. تغطية المشابك مع PBS رطبة كيم مناديل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترطيب تجويف البطن يتعرض مع برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة عدة مرات أثناء أداء الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط مستديرة، برفق سلسلة الجنينية (E15.5) بعيدا عن تجويف. السماح للبقية السلسلة على مناديل مبللة. تبدأ من خلال فضح نصف الرحم أولا. بمجرد electroporated الأجنة في ذلك، إعادته في الداخل، ثم العمل على الشوط الثاني. </li></ol> 4. Electroporation لل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستمرار في استخدام ملقط مستديرة لمعالجة الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السادسsualize البطينات الجانبية. البطينات الجانبية تشغيل على طول خط الوسط (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة سريع الأخضر (الأوراق المالية: 10٪ ث / ت) في حل DNA ل01:20 الخليط إلى تصور أنه خلال الحقن. تحضير محلول الحمض النووي عن طريق إذابة بيليه الحصول عليها من معيار ماكسي الإعدادية البروتوكول في تنقية الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام بال micropipettes قبل سحبها مع المكبس لحقن 1 مل من محلول الحمض النووي (Dlx5 / 6-EGFP، 3 ميكروغرام / ميكرولتر) مع الأخضر السريع. قطع غيض من micropipette مع غرامة forcep رقم 5 (دومون) لمغادرة 6 ملم طول من بداية الكتف إلى نهاية رأس الإبرة قبل تحميل ماصة. عقد رأس الجنين مع ملاقط الجولة. أدخل الدماغ مع ماصة في زاوية 45 درجة تهدف للبطين الجانبي تقع بالقرب من خط الوسط. إذا تخترق إبرة من خلال البطين، يتراجع ببطء ماصة كما يمكنك استخدام المكبس لحقن الحمض النووي. البطين يجب أن يتحول إلى اللون الأخضر عندماالحل يبدأ لملئه. عند هذه النقطة، يتوقف عن الحركة ماصة وحقن 1 مل من الحمض النووي. بلطف، وسحب ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين electroporator CUY21 إلى خمس 45V البقول من 50 ميللي ثانية متباعدة من قبل 950 ميللي ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 5 مم أقطاب مجداف للأجنة E15.5. تراجع الأقطاب في برنامج تلفزيوني لضمان انتقال الحالي كفاءة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المجاذيف القطب حول رأس الجنين مع مجداف إيجابي على البطين تحتوي على محلول الحمض النووي. انخفاض طفيف مجداف الإيجابي مع احترام الآخر سلبي لخلق تيار البطني من خلال الفضيلة العقدية. وهذا التلاعب تقليل التعبير خارج الرحم في الخلايا الهرمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد وضع الأقطاب، وتقديم نبضه عن طريق الضغط على دواسة القدم مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأقطاب والقضاء عليها نظيفة. كرر الخطوات من 4،6-4،9 مع كل جنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد electroporating جميع الأجنة، صب 3 مل من برنامج تلفزيوني في تجويف البطن وإعادتها إلى تجويف البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">خياطة أول جدار البطن مع إبرة منحنية و5-0 خياطة الحرير ثم الجلد. تطبيق يدوكائين (4٪) على الجرح. إدارة 120 ملغم / كغم من الأسبرين داخل الغشاء البريتوني للتسكين. ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ الإجراء بأكمله في 20 دقيقة أو أقل. فإنه من المستحسن أن electroporate مبتدئين فقط بضع الأجنة للحفاظ على وقت العملية باختصار. سوف العمليات الجراحية لفترات طويلة يقلل من معدل بقاء الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحيوان من أنابيب التخدير والسماح الاسترداد على وسادة التدفئة على ورقة يمسح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة الحيوان إلى القفص، والحفاظ على وسادة التدفئة على 37 درجة مئوية ورصد الوضع الصحي. الحيوانات يتسامح عموما الجراحة بشكل جيد وتبدأ في التحرك ببطء قريبا بعد أن يتم إزالتها من أنابيب التخدير. إذا لاحظت النزيف المفرط أو الخمول، وتضحية الحيوان فورا عن طريق إجراء الموافقة IACUC إجراءات القتل الرحيم مثل خلع عنق الرحم أو التخدير جرعة زائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة إلى قفص فيفاRIUM. سوف الإناث تلد بشكل طبيعي. </li></ol>

<ol>
	<li>Fishell, G., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+inhibition+within+the+telencephalon:+&amp;#34;where+the+wild+things+are&amp;#34;.">Mechanisms of inhibition within the telencephalon: &amp;#34;where the wild things are&amp;#34;.</a> Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).</li><li>Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+distinct+progenitor+populations+in+the+lateral+ganglionic+eminence:+implications+for+striatal+and+olfactory+bulb+neurogenesis.">Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis.</a> J Neurosci. 23, 167-174 (2003).</li><li>Eisenstat, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLX-1,+DLX-2,+and+DLX-5+expression+define+distinct+stages+of+basal+forebrain+differentiation.">DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation.</a> J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).</li><li>Batista-Brito, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+integration+of+cortical+interneurons+into+a+functional+network.">The developmental integration of cortical interneurons into a functional network.</a> Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).</li><li>Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiologically+distinct+temporal+cohorts+of+cortical+interneurons+arise+from+telencephalic+Olig2-expressing+precursors.">Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors.</a> J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).</li><li>Miyoshi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+fate+mapping+reveals+that+the+caudal+ganglionic+eminence+produces+a+large+and+diverse+population+of+superficial+cortical+interneurons.">Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons.</a> J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).</li><li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+Dlx-2+(Tes-1)+gene+is+expressed+in+spatially+restricted+domains+of+the+forebrain,+face+and+limbs+in+midgestation+mouse+embryos.">The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos.</a> Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).</li><li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+expression+of+Dlx-1,+Dlx-2+(Tes-1),+Gbx-2,+and+Wnt-3+in+the+embryonic+day+12.5+mouse+forebrain+defines+potential+transverse+and+longitudinal+segmental+boundaries.">Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries.</a> J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).</li><li>Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+expression+of+a+member+of+a+new+family+of+murine+Distal-less+homeobox+genes+in+the+developing+forebrain.">Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain.</a> The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).</li><li>Close, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satb1+is+an+activity-modulated+transcription+factor+required+for+the+terminal+differentiation+and+connectivity+of+medial+ganglionic+eminence-derived+cortical+interneurons.">Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons.</a> J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).</li><li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes.">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472, 351-355 (2011).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

قيود تقنية في حين أن هذا الأسلوب يسمح للخلية التحليل المستقل للعمليات الخلية، فإنه ليست مناسبة لتحليل السكان. وelectroporations هم متفرق جدا مع أقل من ألف خلايا electroporated في الدماغ. ونتيجة لذلك، هذه التقنية لا يمكن استخدامها لتقييم العواق...

الجزء الأكبر من interneurons GABAergic القشرية تنشأ من هيكلين الجنينية عابرة اسمه الفضيلة العقدية سطي والذيلية (MGE وفريق الخبراء الاستشاري على التوالي) 4. Parvalbumin والسوماتوستاتين معربا عن interneurons تنشأ في MGE حين Calretinin (CR)، Vasointestinal الببتيد (VIP) وريلين reelin (إعادة) معربا عن interneurons تنشأ من فريق الخبراء الاستشاري. هذه الأنواع الفرعية عصبون يمكن تمييزها من تواريخ ميلاد لهم. يولدون MGE فرعية مستمدة بين يوم الجنينية 9.5 (E9.5) وe16.5 5،6. في المقابل، يولدون interneurons فريق الخبراء الاستشاري المستمدة من E12.5 من خلال e18.5 مع إنتاجها تبلغ ذروتها في E15.5 6. استهداف الجيني لهذه الفئة من السكان ولدوا في وقت متأخر، ومع ذلك، لا يزال بعيد المنال. يتم التعبير عن الفئران القاصي-أقل (DLX) حصرا الجينات في الدماغ الأمامي البطني تطوير 3. interneurons GABAergic الخلايا العصبية الإسقاط والجسم المخطط ولكن الخلايا الهرمية لا القشرية التعبير عن Dlx1، 2،5، و 6 الجينات في مراحل النمو المبكرة 3. في الواقع، يتم التعبير عن الجينات DLX في منطقة MGE وفريق الخبراء الاستشاري subventricular (SVZ) في جميع الأسلاف GABAergic. التعبير عن هذه الجينات يصبح يقتصر على تحديد الأنواع الفرعية في مراحل تالية للتفتل 7-9. أظهر الأدلة التجريبية السابق أن العنصر محسن Dlx5 / 6 يسمح للالاستهداف الانتقائي الأنساب GABAergic في نماذج الفئران المعدلة وراثيا 2. اختبرنا استخدام واحدة من هذه العناصر محسن في سياق episomal التعبير في مخ الفأر النامية. نحن الفرعية المستنسخة عنصر محسن Dlx5 / 6 جنبا إلى جنب مع الحد الأدنى من المروج وتعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) في bluescript (BS) العمود الفقري بلازميد (الشكل 1). قدمنا ​​البلازميد عن طريق Electroporation للفي الرحم في E15.5 لاستهداف انتقائي CR-، وكبار الشخصيات والمعاودة النوع الفرعي 3،8،10. لدينا تقنية تسمح ل electroporation متفرق، مما يسهلإعادة إعمار الميزات المورفولوجية الخلايا سفعة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مستويات مرتفعة بشكل استثنائي في التعبير الجيني في الخلايا العصبية GABAergic القشرية تسمح للدراسات وظيفية. أجرينا الخسارة والربح من الدراسات الدالة باستخدام العديد من نوع البرية والجينات السلبية المسيطرة 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1106">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:436px;">Electroporator&#160; with pedal</td>
			<td style="width:227px;">Protech International</td>
			<td style="width:164px;">CUY21</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5mm paddle electrodes&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Protech International</td>
			<td style="width:164px;">CUY650P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating pad&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Kent Scientific</td>
			<td>DCT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:436px;">Sutter Instruments P30 Puller&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>3282322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluovac Anesthesia Systems</td>
			<td>&#160;Harvard Apparatus</td>
			<td>726425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delicate Operating Scissors 4.75&#34; Straight Sharp/Sharp</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>&#160;RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-0 Silk Black Braid 18&#34; C-1 Box 36&#160;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>SUT-1073-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Clip Applying Forceps 5.5&#34;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>&#160;RS-5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 Clamp scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>&#160;RC-4894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Holding forceps&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11031-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary tubing&#160;</td>
			<td>&#160;FHC</td>
			<td>27-30-0</td>
			<td>Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subtype-selective electroporation of cortical interneurons

تعتمد دراسة الجهاز العصبي المركزي (CNS) على نضوج استهداف الجيني للسكان العصبية. ومع ذلك، فقد أثبتت مهمة تقييد التعبير عن الجينات التي تهم فرعية العصبية محددة صعبة بشكل ملحوظ بسبب الندرة النسبية للعناصر المروج محددة. interneurons GABAergic يشكل السكان الخلايا العصبية مع التنوع الجيني والمورفولوجي واسعة النطاق. في الواقع، تم التعرف على أكثر من 11 أنواع فرعية مختلفة من interneurons GABAergic في القشرة الماوس 1. هنا نقدم بروتوكول تكييفها لاستهداف انتقائي للسكان GABAergic. حققنا النوع الفرعي الاستهداف الانتقائي للinterneurons GABAergic باستخدام عنصر محسن من النسخ homeobox العوامل Dlx5 وDlx6، المتماثلات من ذبابة الفاكهة البعيدة أقل (دلل) الجينات 2،3، لدفع التعبير عن جينات محددة من خلال Electroporation للفي الرحم.

نحن تكييف Electroporation للتقنية في الرحم لتحقيق نوع من الخلايا استهداف محدد من الخلايا العصبية التي تستحق. لدفع التعبير عن EGFP في interneurons فريق الخبراء الاستشاري المشتقة، استخدمنا عنصر محسن Dlx5 / 6 والمقيدة الحقن جهدنا لE15.5، المرحلة التي يتم إنشاؤها غالبية interneurons فر?...

Watch this Scientific Journal Video about Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons at JoVE.com

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

-النوع الفرعي انتقائية Electroporation للمن القشرية Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

subtype-selective-electroporation-of-cortical-interneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Views.  New York University School of Medicine. This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Video: Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

في الرحم بعد Electroporation للثقافة متعلق بالخلايا العصبية الأولية لدراسة وظائف الجينات في مجموعة فرعية من العصبونات القشرية

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

العزلة وثقافة الخلايا النجمية الماوس القشرية

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

الوليد الصعق الكهربائي المنطقة Subventricular

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

بحكم الرحم الصعق الكهربائي وإإكسبلنتس نصف الكرة المجموع: طريقة بسيطة للدراسات التجريبية التنمية القشرية في وقت مبكر

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Neonatal Pial Surface Electroporation

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and gliogenesis, including after injury. However, methods for genetically interrogating these progenitor populations and tracking their lineages had been limited owing to a lack of specificity or time consuming production of viruses. Thus, progress in this region has been relatively slow with only a handful of investigations of this location. Electroporation has been used for over a decade to study neural stem cell properties in the embryo, and more recently in the postnatal brain. Here we describe an efficient, rapid, and simple technique for the genetic manipulation of pial surface progenitors based on an adapted electroporation approach. Pial surface electroporation allows for facile genetic labeling and manipulation of these progenitors, thus representing a time-saving and economical approach for studying these cells.

The pial surface is a unique progenitor zone in the CNS that is receiving increasing attention. Herein, we detail a method for rapid genetic manipulation of this progenitor zone using a modified electroporation method. This procedure can be used for cellular and molecular investigations of cell lineages and signaling pathways involved in cell differentiation and to elucidate the fate and properties of daughter cells.

حديثي الولادة حنوني التثقيب الكهربائي السطحية

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

خلية كاملة تسجيلات التصحيح، المشبك من Morphologically- وحددت Neurochemically-الحصين Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

دليل ل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; تسجيل وحدة واحدة من التي تم تحديدها Optogenetically القشرية التثبيطي Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

الطريقة الكهربية لالردود تسجيل بين الخلايا الجهد ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء وInterneurons إلى النور المحفزات<em&gt; في فيفو</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and can be delineated by certain histochemical and immunohistochemical methods. In this study, we highlight a method to isolate the cortex from mammalian brains and flatten them to obtain sections parallel to the cortical sheet. We further highlight selected histochemical and immunohistochemical methods to process these flattened tangential sections to visualize cortical modules. In the somatosensory cortex of various mammals, we perform cytochrome oxidase histochemistry to reveal body maps or cortical modules representing different parts of the body of the animal. In the medial entorhinal cortex, an area where grid cells are generated, we utilize immunohistochemical methods to highlight modules of genetically determined neurons which are arranged in a grid-pattern in the cortical sheet across several species. Overall, we provide a framework to isolate and prepare layer-wise flattened cortical sections, and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods in a wide variety of mammalian brains.

This article describes a detailed methodology to obtain flattened tangential sections from mammalian cortices and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods.

التصور للوحدات القشرية في الأرض كورتيسيس الثدييات

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

-النوع الفرعي انتقائية Electroporation للمن القشرية Interneurons

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video