עבודה זו נתמכה על ידי (DFG), ברצוננו להודות Ayele Tsedeke Taddese לקבלת תמיכה טכנית.

1. הכנת מחטי הזכוכית (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנימי זכוכית בקוטר 0.75 מ&quot;מ להכין מחטי הזרקה (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את נימי הזכוכית לתוך חולץ מחט ולמשוך את המחט עם הפרמטר הבא: ערך מחזור חימום: 463; משיכת ערך מחזור: 230; מהירות: 150 אלפיות השניים; זמן: 150 אלפיות שני (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את זכוכית משך נימים עם פינצטה שען כדי לייצר מחט בקוטר 20 מיקרומטר תחת stereoscope עם עינית מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מחרטה עם גלגל מסתובב גומי רטוב כדי לחדד את המחט ולייצר 20 מיקרומטר הטיה (1C דמויות ו1D). הערה: שארפ, מחטים משופעות לשפר את הקלות של כניסה לתוך החדר ובכך למזער את הנזק לרקמות ולאפשר לשרירים המחוררים כדי לחתום מחדש לאחר הסרת המחט (איורים 1E-G). </li></ol> 2. Preparע פתרון morpholino <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מניית morpholino ידי המסת morpholino lyophilized ב1x פוספט שנאגר מלוח (PBS) לריכוז סופי של 7.5 מ&quot;מ. [ראה את הוראות יצרן לפרטים (טבלת חומרים)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון הזרקת morpholino על ידי ערבוב של פתרון מניות morpholino 2.5 μl (7.5 מ&quot;מ) עם פתרון 2.8 μl Endo-פורטר המניה (1 מ&quot;מ) (ראה טבלת חומרים) לריכוז סופי של 3.5 morpholino מ&quot;מ ו0.5 מ&quot;מ Endo-פורטר. </li></ol> 3. הכנת הזרקת morpholino (איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מחט זכוכית המשופעת עם 5 μl של פתרון זה באמצעות micropipette עם קצה פיפטה microloader 10 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מחט הזכוכית לתוך מחזיק המחט של micromanipulator מחובר למשאבת פיק פנאומטי (איורים 2A-C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את בעל המחט ליד מיקרוסקופ כך מחט הצרכים רקכדי להתרגש בכיוון מישוריים אחד להכניס אותו לתוך חדר הלב של הזחל (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את הזווית לזריקות ב-45 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ערכי microinjector כדלקמן: לחץ אחיזה: 20 פאונד לאינץ&#39; המרובע (psi); לחץ פליטה: 15 psi; 100 מגוון אלפיות של gating, ערך תקופה של 1.9 (מתאים ל10.9 אלפית שני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס agarose ב 1x PBS באמצעות מיקרוגל סטנדרטי לייצר 20 מיליליטר של 1.5% (w / v) ג&#39;ל. יוצקים ג&#39;ל נמס לתוך צלחת פטרי 10 סנטימטר. הנח צורת הזרקת מחורץ לagarose החם, כך שפעם אחת קשוח, agarose יהיה תלמים שבזחל המסוממים יוצב 11 (2D דמויות ו2E). </li></ol> 4. זריקות (איור 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי זחל במי אקווריום 100 מיליליטר עם 20 tricaine מ&quot;ג / ליטר (sulfonate L-אתיל-M-אמינו-נזואט מתאן), עד שהם יפסיקו להגיב למגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipett פסטר מפלסטיקדואר להעביר בזהירות את הזחל מסומם לתוך חריץ של עובש agarose הרטוב, כך שהצד הגחוני פונה אל קיר agarose האנכי של הגרוב (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת agarose תחת סטראו כך שהחדר הוא מול מן מחט הזריקה (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את המחט להכניס אותו לתוך חדר הלב. הכנס את המחט רק 1-2 מיקרומטר לתוך החדר נזהר שלא להכניס את המחט עמוקה מדי (3B דמויות ו3 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמחט מוחדרת, להזריק את פתרון morpholino לתוך החדר עם 4-6 קטניות, כל 3 NL אספקת של הפתרון, עם מחכה מרווחים כדי לאפשר סליקה של הלב (3D דמויות ו3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקה, להוציא את המחט (במקביל למישור של הכנסה) ולאחר מכן להעביר בזהירות את הזחל בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק מלא בbac הבינוני E3k לתוך צלחת פטרי המכילה בינוני E3 טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המחט לתוך צלחת פטרי המכילה 1x PBS כדי למנוע הייבוש של המחט בעת העברת הזחל המוזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.1-4.6 כל שעה 12-24 לתקופת הניסוי. הערה: חזרה על הזריקות מבטיחה הספיגה ותחזוקה של morpholino בתאים. </li></ol> 5. ניתוח של זריקות (איור 4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הדגים באקווריום של מים 100 מיליליטר עם 20 tricaine מ&quot;ג / ליטר עד שהם יפסיקו להגיב למגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הזחל רוחבי על 1.5% רטובים שטוחים (w / v) agarose צלחת מכוסה במדיום E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זחלי תמונה באמצעות סטראו עם brightfield ודימות פלואורסצנטי. הערה: כפי שהזחלים הם שקופים, morpholino מתויג והעמסת צריך להיות גלוי כמו ירוק ניאון בכלי דם בכל בעלי החיים באופן ישיר לאחר הזרקה. הקרינה זו תתפזר יותר לתוך רקמות vascularized ידי15 דקות (איורים 4 א-4C). </li></ol> 6. הערכת הרגנרציה תולדה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך תמונות שנתפסו באמצעות תוכנת פיג&#39;י תמונת J בחינם (http://fiji.sc/Fiji). לחקירת התחדשות, השתמש בכלי מעקב אונליין כדי לקבוע את הכמות של צמיחת התחדשות שחלה על שליטה וזחל הזריק morpholino. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל תמונות, פתח את אחד קבצי תמונה המקוריים בפיג&#39;י על ידי גרירה ושחרור של הקובץ לתוך חלון פיג&#39;י הראשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את קנה המידה לכל התמונות הבאות, ללכת על &quot;נתח&quot; בתפריט הראשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפתח לחץ על תפריט &quot;סולם הגדר&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון זה, להפעיל את האפשרות &quot;הגלובלית&quot; על ידי לחיצה על תיבת הסימון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו לפתוח את התמונה כדי למדוד את הכמות של צמיחת משובי שוב על ידי גרירה ושחרור (ראה שלב 6.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;בחירות חופשי&quot; בסרגל הכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקיף את האזור כדי להימדד (Figures 4J-4L). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על Ctrl + M. הפעולה זו תפתח חלון חדש &quot;תוצאות&quot; המציג את ערכו של השטח מוקף בפיקסלים מרובעים. </li></ol>

<ol>
	<li>Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li><li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish.">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nature Protocols. 6, 2011 (1998).</li><li>Skromne, I., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+in+zebrafish+reverse+genetics:+moving+forward.">Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward.</a> Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).</li><li>Zu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALEN-mediated+precise+genome+modification+by+homologous+recombination+in+zebrafish.">TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish.</a> Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system.">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491, 114-118 (2012).</li><li>Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+gene+expression+in+the+adult+zebrafish+brain+using+cerebroventricular+microinjection+of+morpholino+oligonucleotides.">Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides.</a> J Vis Exp. , (2013).</li><li>Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin.">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+adult+zebrafish+retina.">In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots+are+powerful+multipurose+vital+labeling+agents+in+zebrafish+embryos.">Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).</li><li>Madhavan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Pax-6+in+lens+regeneration.">The role of Pax-6 in lens regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).</li><li>Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: a practical approach. 261, 121-143 (2000).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+morpholino+experiments:+don't+stop+making+antisense.">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135, 1735-1743 (2008).</li><li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish.">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li><li>Hyatt, T. M., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+and+techniques+for+ectopic+gene+expression+in+zebrafish.">Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).</li><li>Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+controlled+site-specific+recombination+in+zebrafish.">Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Liu, S., D, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+cancer.">Zebrafish models for cancer.</a> Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).</li><li>Stoick-Cooper, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Wnt+signaling+pathways+have+opposing+roles+in+appendage+regeneration.">Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration.</a> Development. 134, 479-489 (2007).</li><li>Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+targets+of+the+Sox+domain+proteins+Dichaete+in+the+Drosophila+CNS+via+targeted+expression+of+dominant+negative+proteins.">Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins.</a> BMC Dev. Biol. 13, (2013).</li><li>McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legless,+a+novel+mutation+found+in+PHT1-1+transgenic+mice.">Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice.</a> Science. 241, 837-839 (1988).</li><li>Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D'Eustachio, P., Mintz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+DNA+rearrangements+and+early+developmental+arrest+caused+by+DNA+insertion+in+transgenic+mouse+embryos.">Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

ההזרקה תוך חדרי מספקת שיטת הערכה מהירה ואמינה לבדיקת תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות או של הומאוסטזיס גוף מבלי להשפיע על תפקוד הגן בעובר. כדי להבטיח את ההצלחה של טכניקה זו, אחד צריכה להיות מודע לארבע נקודות קריטיות: 1) גודל מחט,) ייבוש 2 מ המחט, 3) צמצום נפח, ו4) זמן חשיפה מינימאלית בפתרון הרגעה. מחטים כי הם קטנים מדי תסתומנה לעתים קרובות, בעוד מחטים כי הם גדולים מדי יפגעו בחדר ולגרום לדימום יתר. בעוד 20 מיקרומטר מומלץ, המחט אף פעם לא צריכה להיות יותר מחמישית בגודל של החדר של החדר. נקודה קריטית שנייה היא לשמור את המחט מהתייבשות וסתימה. גדליו הקטנים של המחט וההפסקות התכופות בלתי נמנעות לשקטה ורגועה, והעברת עמדת הזחל יכולים לספק מספיק זמן כדי לאפשר morpholino בקצה המחט להתייבש ולסתום את המחט. כדי למנועזה, אפשר לטבול את המחט בצלחת פטרי של 1x PBS. נקודה קריטית שלישית היא למזער נפיחות של החדר על ידי גבוה מדי של עוצמת קול. אם המינון הוא מוגבל על ידי הגודל של המחט, ולאחר מכן להגדיל את מספר הזריקות הוא תמיד עדיף על הגדלת הנפח: נפחים גדולים יותר יכולים לגרום לפציעת מתיחה ללב. נקודה קריטית רביעית היא המידה של הרגעה. זמן הרגעה מבוסס על משך הזמן הדרוש להליך. זחלים יכולים להישאר בפתרון הרגעה ולהישאר מסומם במשך כמה דקות, בגלל שהם לא חזקים ולהחיות די בקלות. עם זאת, שמירה על הדגים יותר מדי זמן בהרדמה תפגע בהתאוששות שלה או קצר מדי יגרום להם להחיות במהלך ההזרקה. לכן, יש להרדים רק את המספר של זחל שאפשר להזריק תוך פרק 4 דקות. מגבלה אחת של השיטה הנוכחית היא שmorpholino אינו מכוון את תפקוד גן ברקמותספציפי לאופן. שני שינויים שונים יכולים לספק סגוליות רקמה: שינוי אחד הוא להשתמש morpholinos בכלוב. לאחר הפעלה על ידי אור הלייזר ממיקרוסקופ confocal, morpholinos אלה מעכב את יעד הגן שלהם, חשיפת confocal כך מתוזמן יכולה לספק שליטה של ​​זמן ומרחב לפעילות morpholino. morpholinos בכלוב היה בשימוש למקד גנים במהלך ההתפתחות מוקדמת לאחר ההזרקה לתוך העובר אחד התאים. בעוד מסירה בשלב תא בודד יכולה לעבוד למקד גנים בעובר, הריכוז של morpholino צפוי להיות נמוך מדי בשלבי זחל מאוחר יותר בשל מספר חלוקות תא רצופים כפיתוח מתקדם לשלב זחל 13. כמות morpholino אחד יכול להזריק באחד התאים בשלב מוגבל גם על ידי רעילות 13-15. שינוי אפשרי שני הוא להזריק ישירות morpholino לתוך האיבר או הרקמה להיחקר כאשר גודל והדמיה מאפשרים. זחל דג הזברה הוא שקוף, כך שחודש צפייהt איברים פנימיים אחרי שהם פיתחו לא צריך להיות בעיה. Morpholinos מתויג והעמסת לעבוד עם פרוטוקול זה; לכן, הקרינה יכולה לשמש כדי לעקוב אחר ההפצה ולוקליזציה רקמות הספציפיות של morpholino. השילוב של morpholino מתויג והעמסת לתאי רקמה דורש הנוכחות של מגיב Endo-פורטר, ולכן שינוי נוסף יהיה להגביל את הפריסה המרחבית של מגיב Endo-פורטר על ידי הזרקתו בכמויות נמוכות ישירות לתוך רקמת המטרה. לפיכך, ברזולוציה מרחבית צריכה להיות אפשרית עם טכניקה זו. ישנן שיטות ביטוי יתר מהונדסים המספקות לבקרת זמן ומרחב של ביטוי גנים אקסוגניים על ידי שילוב של יזמים רקמות ספציפיות עם חום הלם או מקדמי טמוקסיפן מושרה המאפשר הניתוח של תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות או ברקמות מסוימות באמצעות רקמה יזמים ספציפיים 16-19. זה כולל את transgeביטוי NIC של מבנים דומיננטיים שליליים שנועדו ליצור מוצר שיכול לגבור על גן אנדוגני. אסטרטגית מציאה זו היא רגישה להשפעות מחוץ היעד כאשר transgene מייצר רמות ביטוי לא פרופורציונליות של מוצר מהונדס שרוכש השפעות 20 לזכות-of-פונקציה, או כשהוא משתלב בגן ומשבש את תפקודו של הגן אנדוגני 21, 22. בעוד morpholinos גם יכול ליצור השפעות מחוץ היעד, אפשר בקלות רבה יותר לשלוט ולהגביל את ההשפעות אלה על ידי שימוש בmorpholinos שליטת חוסר התאמה עם רצפי היעד דומים אך שונים מעט, שאינו מחייבים את ה-mRNA היעד, באמצעות morpholinos antisense מרובה כי יעד רצפים שונים בתוך אותו mRNA ועל ידי בדיקת ריכוזי morpholino שונים 13-15. יתר על כן, ניתן לייצר morpholinos ונבדק מהר יותר והרבה יותר זול מאשר בעיצוב, העלאה ובדיקת קווים מהונדסים דומיננטיים שליליים שונים. לכן, בהזרקת traventricular של morpholinos מספקת כלי שימושי למציאת גנים בשלבים מאוחר יותר של התפתחות, כאשר transgenesis הדומיננטית שלילית אינה אפשרית. כאשר אסטרטגיה מהונדס דומיננטית שלילית אפשרית, הזרקת morpholino תוך חדרי היא גישה חלופית כדי לאשר את הספציפיות של transgene הדומיננטי שלילי ביטוי היתר. סביר להניח כי ריכוזים יעילים בין morpholinos שונה ישתנו, כפי שהם עושים כאשר משתמשים בהם למציאת גן בעובר 13, 15. לגן הממוקד במחקר זה, אנו לא צופים השפעה על התחדשות במינונים נמוכים יותר מאשר 3.5 מ&quot;מ, ותופעות בלתי ספציפיות לא נצפו בחוסר התאמה שולט עם ריכוז morpholino זה. הזרקה תוך חדרי מאפשרת ההפצה של מולקולות קטנות כדי להעריך את הפעילות ויעילות במערכת חיה כולה בזמן אמת, כאשר יעילות מוגבלת על ידי penetלקצוב דרך מערכת עיכול העור או או על ידי הכמויות של מתחם הזמינות. זה גם מאפשר מיקוד של רקמות כשהם לא יכולים להיות ממוקדים על ידי הזרקות ישירות, כמו במקרה של לfinfold. שיטה זו אינה רק לספק כלי ללמוד תפקוד גן במהלך רגנרציה של סנפיר בשלבי זחל. מאז morpholino משתלב finfold הזחל הכולל תאי mesenchymal והאפידרמיס, זה יכול גם לספק טכניקה מתאימה כדי לחקור את תפקידם של גנים שמשחקים תפקיד בתהליך של ריפוי פצע או ההתרחשות של סרטן העור. ההזרקה של morpholino יחד עם Endo-פורטר יכולה להיות מיושמת גם כדי למקד את האיברים או רקמות בדג זברה מבוגר, שהן ניתנות לניתוח וקווי דג הזברה המבוגר שקופים זמינים. יתר על כן, שיטה זו אינה מוגבלת לדג זברה; פיזור על ידי הזרקה תוך חדרי ניתן להשתמש במודלים של בעלי חוליות אחרים, כמו גם, במיוחד בדגמים אלה שעדיין חסרי שיטות גן רצסיבי יעילותכגון Xenopus, האמביסטומה וסלמנדרה, שהם גם דגמים חשובים למחקרי התחדשות. כך, הזרקה תוך חדרי בדג הזברה מציעה את היכולת לשלוט temporally ביטוי גנים בפרוטוקול מהיר יחסית למקד רקמות רבות, ואת הרבגוניות של שיטה זו מאפשרת את השימוש בו עם קווים מהונדסים דג הזברה, כמו גם לאורגניזמים אחרים שחסרים transgenesis או תפקודיות אסטרטגיות נוקאאוט הגן.

התחדשות של איברים ואיברים חשובה ביסודו להישרדות ולכושר; עם זאת, כמה בעלי חוליות, כולל אדם יש יכולת מוגבלת רגנרטיבית. בעוד כמה מודלים של בעלי החיים קיימים שיש להם יכולת התחדשות נרחבת, להפוך טכניקות גנטיות על מנת להעריך את תפקוד גן באיברים והתחדשות סרח יישאר מוגבל מאוד או לא קיימים. לכן, גישות חדשות נדרשות כדי לנתח את הביולוגיה המולקולרית של התחדשות באורגניזמים המודל הבאים. דג הזברה היא מודל מבוסס היטב להבנת התא וביולוגיה מולקולרית של איבר ואיבר התחדשות 1, לא רק בגלל היכולת שלו המשמעותית להתחדש איברים מרובים, רקמות ואיברים, אלא גם משום שכמה קווי דגים מהונדסים קיימים כדי לעקוב אחר תאים ו לביטוי יתר גן בונה 2, 3. עם זאת, עיכוב גן בדג זברת זחל מוגבל בעיקר לoverexpression של מבנים דומיננטיים שליליים, שאינם זמינים לכל הגנים של עניין או transgene שהמוצר יכול לרכוש השפעות לזכות-of-פונקציה שאינו משקפות את פעילות אנדוגני של הגן. לפיכך, יש צורך בשיטה חלופית כדי להסיר ביטוי גנים ספציפי בנוקאאוט או מציאה כדי להתגבר על בעיות אלה. גן ספציפי מיקוד באמצעות TALENS קיים כאמצעי גנטי הפוך למפסיד יוצא, תפקוד גן; עם זאת, אסטרטגית נוקאאוט הזה היא לעתים קרובות מאוד מוגבל להערכות תפקודיות בעובר מוקדם, כי דרישות ראשוניות של הגן למנוע התקדמות נוספת של התפתחות עוברית. לפיכך, חקר תופעות מאוחר יותר כגון התחדשות או הומאוסטזיס איברים לאחר פיתוח באמצעות TALENS מנועה 4, 5. לכן, יש צורך באסטרטגית הסרת גן חלופית, כי מטרות תפקוד גן אחרי התפתחות מוקדמת להעריך את הדרישות של גנים באיברים ומבנים שהוקמו באופן מלא. </p&gt; Morpholino הזרקה הוכח כיעילה במיקוד גנים בכמה איברים בוגרים והמבוגרים התחדשות 6-8 סנפיר, אך שיטות אלו דורשות electroporation ורבים איברים פנימיים קשים electroporate או בשל מיקומם או בשל רגישותם לחשמלית הפרעה. יתר על כן, כמה רקמות בזחל קשות להזריק ישירות, כי הזרקה ישירה עלולה לשבש את השלמות המבנית שלהם או בגלל הגודל שלהם הוא מגבילה. סנפיר הזנב של הזחל הוא מבנה אחד כזה, כי הזרקה ישירה לתוך finfold אינה אפשרית. לפיכך, חלופה לelectroporation והזרקה ישירה הייתה צורך למקד גנים ברקמות שגם הם קטנים מדי כדי להזריק או שלא ניתן electroporated. על מנת למקד ומעכבים את הפונקציה של גנים ספציפיים במהלך ההתחדשות של סנפיר הזנב הזחל, יש לנו שונה בטכנולוגיות קיימות מאפשר morpholinossessment של תפקוד הגן במהלך רגנרציה של סנפיר הזנב בזחל מבוים המאוחר. שיטה זו מעסיקה משלוח תוך חדרי 9 של morpholinos העמסה-מתויג יחד עם מגיב transfection Endo-פורטר 10. פעם אחת בחדר, את תערובת morpholino-Endo-פורטר מתפשטת במהירות ברחבי הזחל דרך כלי הדם ונכנסה רקמות שהיו בלתי אפשרי בעבר להתמקד. שיטת הזרקה זו עשויה להיות שונה כדי למקד גנים ברקמות ספציפיות וייתכן בהחלט ניתן ליישם במודלים של בעלי חיים אחרים, כי כרגע אין לי שיטות גנטיות הפוכה כדי לעכב את תפקוד גן. לכן, היא מציעה שיטה מהירה וקלה עם הפוטנציאל לשימוש מגוון רחב ללמוד באופן מיידי את תפקוד גן במהלך הומאוסטזיס כללי איבר והתחדשות בשלבי זחל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:672px;" width="673">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagent/Material</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Morpholino with 3&#180;fluorescein tag</td>
			<td style="width:171px;">Gene Tools Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Customized</td>
			<td style="width:167px;">More information on www.genetools.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Endo-Porter</td>
			<td style="width:171px;">Gene Tools Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">More information on www.genetools.com</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:171px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">120623</td>
			<td style="width:167px;">For pouring plates to place the fish during injections and imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricane (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)</td>
			<td style="width:171px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSo4)</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">For larval husbandry</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:171px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">821.472</td>
			<td style="width:167px;">For placing the fish during injections and imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;Equipment</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td style="width:171px;">World Precision Instruments, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TW100F-3</td>
			<td style="width:167px;">For preparing injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:171px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5,242,956,003</td>
			<td style="width:167px;">For loading the needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml)</td>
			<td style="width:171px;">Brand</td>
			<td style="width:119px;">747760/ 74775</td>
			<td style="width:167px;">For transfering larva</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Flaming / Brown&#160; needle puller&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Sutter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">More information on www.sutter.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5)</td>
			<td style="width:171px;">World Precision Instruments, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">501985</td>
			<td style="width:167px;">To brake the needle before sharpening</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:171px;">Olympus, Leica, Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Varies with the manufacturer</td>
			<td style="width:167px;">Part of the whole injection setup</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescence camera</td>
			<td style="width:171px;">Olympus, Leica, Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Varies with the manufacturer</td>
			<td style="width:167px;">To image the fluorescence after injeciton</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PicoNozzle kit (microinjector holder)</td>
			<td style="width:171px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">5430-12</td>
			<td style="width:167px;">For microinjections</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pneumatic PicoPump (microinjector)</td>
			<td style="width:171px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">SYS-PV820</td>
			<td style="width:167px;">For microinjections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva

דג הזברה הוא מודל חשוב להבין את התא וביולוגיה מולקולרית של איבר והתחדשות סרח. עם זאת, אסטרטגיות מולקולריות להעסיק גנטיקה הפוכה עדיין לא פותחו במידה מספקת כדי להעריך את תפקוד גן בהתחדשות או הומאוסטזיס רקמות בשלבי זחל אחרי עובר דג הזברה, וכמה רקמות בתוך זחל דג הזברה הן קשות להתמקד. זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי להציע שיטה חלופית לחוסר היכולת הנוכחית למקד genomically גנים דג הזברה באופן temporally מבוקר בשלבים האלה. שיטה זו מאפשרת לפיזור מלא ושילוב הבא של morpholino לרקמות שונות בגוף, כוללים מבנים שהיו בעבר בלתי אפשריים להגיע כגון אלה בסנפיר הזנב הזחל, מבנה המשמש לעתים קרובות כדי לחקור התחדשות רקמות noninvasively. מספר גנים מופעלים במהלך רגנרציה finfold זחל גם presenלא בהתחדשות רקמות חוליות מבוגרים, ולכן הזחל הוא מודל שימושי כדי להבין התחדשות במבוגרים. שיטת פיזור morpholino זה מאפשרת זיהוי קל ומהיר של גנים הנדרשים להתחדשות של רקמות זחל כמו גם תופעות פיסיולוגיות אחרות המסדירות הומאוסטזיס רקמות אחרי העובר. לכן, שיטת מסירה זו מספקת אסטרטגיה דרושה כעת לשליטה זמנית להערכה של תפקוד גן אחרי העובר.

המחט החדה, משופעת ההזרקה ממוקמת בקלות בחדר הלב של זחל דג הזברה כאשר ניגש dorsally (איור 3 א). הלב ממשיך לשאוב ונשמרת זרימת דם למרות נוכחותם של המחט (3B דמויות ו3 ג). זריקות להיזהר לא לשבש את המורפולוגיה של החדר או התכווצויות לב (איור 3D) למרות הזרקה של morpholino ללב (איור 3E). בתוך דקות, פתרון morpholino-Endo-פורטר מפיץ בכל הגוף באמצעות כלי הדם (איורים 4 א ו -4 ב). Morpholino מכן יחולק מכלי הדם לרקמות שונות כגון finfold והמוח לפחות 12 שעה או יותר כפי שנצפה מהקרינה (איור 4C). בגישה זו, אנו מסירים את הקצה הדיסטלי של הfinfold דואר, הקצה הדיסטלי של חוט השדרה, שרירים תא מטען דיסטלי, notochord דיסטלי ותאי פיגמנט (4D דמויות ו4H); כל אלה הם קשים במיוחד למטרה על ידי הזרקה ישירה בשל קומפקטיות (שריר), גודל קטן (חוט השדרה וnotochord) ורזון (finfold), אבל מופיע לשלב morpholino לאחר זריקות חדרית סדרתי, אשר נתפסו על ידי הקרינה בתוך אלה רקמות (איור 4E) בהשוואה לבעלי החיים uninjected (4F דמויות ו4G). לכן, שיטה זו בקלות יחסית מקדמת מסירה של morpholino לרקמות שקשה למקד בנפרד, והוא מאפשר הערכה של תפקוד גן בכמה רקמות בסנפיר ההתחדשות בבת אחת. כדי להעריך את חשיבותם של גנים ספציפיים המעורבים בהתחדשות, אחד בניתוח חלקי קוטם סנפיר זחל הזנב (איור 4H), resecting כל הרקמות שיש לי Incorp<html> נאם morpholino (איור 4I). Finfold הזחל מחדש את המבנה שלה בתוך כמה ימים לאחר קטיעה (DPA) (איור 4J). מיקוד morpholino &#160; גן דרושים לרגנרציה (נתונים שלא פורסמו) תוצאות בתגובת התחדשות מוטרדת (איור 4K) בהשוואה לuninjected (איור 4J) ופקדי morpholino חוסר התאמה (איור 4L). ההשפעה הכוללת של ניסויי morpholino אלה בתולדת משובי ניתן למדוד באמצעות כלים morphometric סטנדרטיים בתוכניות פיג&#39;י הזמינות בפומבי 12 על ידי התחקות הרקמות מחדש והשוואת האזורים (איורים 4J-4L). לפיכך, שיטת מיקוד הגן הזה מספק assay מהיר וקל יחסית כדי לבדוק את החשיבות של גנים בתהליך ההתחדשות. <html> &quot;Width =&quot; 5fig1highres.jpg 500 &quot;/&gt; איור 1. הכנת מחטי זכוכית נימים להזרקה. א) צינור נימי זכוכית לפני משיכת (לעיל) ומשך את המחט (בהמשך). ב &#39;) מכשירי משיכת מחט. C) מחרטה לbeveling וחידוד מחט הזכוכית. מוצגת המחט דרך המשקפת. ד) המחרטה היא דיסק מסתובב גומי רטוב. המחט היא הורידה באיטיות על גבי התקליטור. מחט E) חדדה חייבת להיות פוע קצר כי הוא כבר לא (20 מיקרומטר) מרוחבו (20 מיקרומטר) כדי לצמצם את המרחב הדרוש כדי להכניס את כל סוף את המחט לתוך לב הזחל חדר. F) תמונה בהגדלה גבוהה מראה את קצה המחט. בתצוגה סכמטית של קצה המחט המראה את הצורה של פוע לאחר חידוד G). &quot;Width =&quot; s/ftp_upload/51595/51595fig2highres.jpg 500 &quot;/&gt; איור 2. מנגנון הזרקה להגדיר.) מנגנון שלם להזרקה של morpholino לזחל דג הזברה. ב &#39;) יעמוד ללשלוט במיקום של המחט במהלך זריקות. C) משאבת פיקו שמווסת את הלחץ פנאומטי לזריקות עיתונות טופס. ד&#39;) בשימוש עובש Agarose ליצור עובש agarose. E) המשמש לייצוב זחל להזרקה. <img alt="איור 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51595/51595fig3highres.jpg" width="400" /> איור 3. הזרקה של זחל דגים. הקרינה קלטי) מיקום המחט ביחס לזחל דג הזברה. ב &#39;) לחדר לב. C) של morpholino במחט אבל נעדר בחדר לפני injectiב. ד &#39;) תמונת Brightfield מציגה את יחסי הגודל בין מחט הזכוכית וחדר הזחל) הזרקה. ה&#39; לmorpholino הניאון לתוך חדר הלב. סולם ברים שווים 100 מיקרומטר. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51595/51595fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. פיזור של morpholino ברחבי דגים. א) הקרינה זחל ישן 3 יום דג הזברה. ב) morpholino לאורך כל כלי הדם בגוף נפיצה (v) ההודעה חדרית 5 דקות הזרקה. C) של morpholino לאורך כל בעלי החיים כוללים finfold (ואילך), מתויגת והעמסת, מוח (ב) במבוגרים זחל לאחר זריקות של morpholino כל 12 שעה D רקמות) בסנפיר הזנב הזחל ותא מטען:.. notochord (n), חוט השדרה (sc), פיגמנט (עמ &#39;), וfinfold (ואילך) E) מפוזר morpholinoכמה דקות לאחר הזרקה לרקמות תא מטען זחל כוללים finfold. תמונת Brightfield של תא מטען זחל uninjected וסנפיר הזנב F). קו מקווקו מציין את סנפיר מטוס קטיעה הפוטנציאלי. G) uninjected צילם עם מסנן ה-GFP מראה autofluorescence בירוק (ראשי חץ). צורת הדנדריטים של מבני fluorescing עולה כי אלה הם תאי פיגמנט. H) תמונת Brightfield של סנפיר הזנב זחל נקטע בניתוח דרך notochord, השרירים ועמוד השדרה. אני) תמונת פלורסנט מראה הפצת morpholino ברקמות הגדם. התאגדות morpholino לתוך שרירים, חוט השדרה, notochord וfinfold. J) מחדש מבני finfold הזנב של זחל wild-type. קו שחור משרטט את הרקמות מחדש לניתוח כימות העיכוב. K) בתיווך morpholino של התחדשות. מעקב קו שחור מדגיש בבירור מופחתת ההתחדשות מחדשsponse לאחר מציאה morpholino. L) מחדש finfold הזנב של זחל הוזרק morpholino שליטת חוסר התאמה מראה תגובת התחדשות דומה כמו בזחל uninjected (J). סולם ברים שווים 100 מיקרומטר.

Watch this Scientific Journal Video about Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva at JoVE.com

Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva

שיטה להתאמה הפוכה גנטית לדג זברה כדי להעריך את תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות והומאוסטזיס פיסיולוגי כגון התחדשות רקמות באמצעות זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי.

הפוך גישת morpholino גנטית באמצעות הזרקת לב חדרית לtransfect רקמות קשה ליעד מרובים בזחל דג הזברה

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to ...

reverse-genetic-morpholino-approach-using-cardiac-ventricular

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

10.5K Views.  Technische Universität Dresden.  שיטה להתאמה הפוכה גנטית לדג זברה כדי להעריך את תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות והומאוסטזיס פיסיולוגי כגון התחדשות רקמות באמצעות זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי. 

Video: Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

החדר דג הזברה המוח Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

רטרו מסלולית הזרקה של דג הזברה למבוגרים

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

גישה מעשית מיפוי גנטי ועין מתנהלת הגורל: מדריך חזותי כדי מארק עקוב אחר תאים In vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging דג הזברה למבוגר

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible cytoplasmic compartments. Another hurdle is the tight apposition of myofibers to the surrounding tissues. Because the process of tissue fixation and paraffin embedding leads to the shrinkage of muscle fibers, freezing is an optimal means of hardening muscle tissue for sectioning. However, a commonly encountered issue, the formation of ice crystals, occurs during the preparation of frozen sections because of the high water content of muscle. The protocol presented here first describes a simple and efficient method for properly freezing muscle tissues by immersing them in liquid nitrogen. The problem with using liquid nitrogen alone is that it causes the formation of a nitrogen gas barrier next to the tissue, which acts as an insulator and inhibits the cooling of the tissues. To avoid this "vapor blanket" effect, a new cryovial was designed to increase the speed of liquid flow around the tissue surface. This was achieved by punching a total of 14 inlet holes in the wall of the vial. According to bubble dynamics, a higher rate of liquid flow results in smaller bubbles and fewer chances to form a gas barrier. When liquid nitrogen flows into the cryovial through the inlet holes, the flow velocity around the tissue is fast enough to eliminate the gas barrier. Compared to the method of freezing muscle tissues using pre-chilled isopentane, this protocol is simpler and more efficient and can be used to freeze muscle in a throughput manner. Furthermore, this method is optimal for institutions that do not have access to isopentane, which is extremely flammable at room temperature.

This protocol describes a procedure to freeze muscle tissues by plunging them directly into liquid nitrogen. This protocol also highlights a new cryovial that can avoid the &#34;blanket effect&#34; of nitrogen gas when liquid nitrogen contacts the tissue surface of a specimen.

מבטל Multi-חור cryovial הקפאת חפצים כאשר השרירים שקועים ישירות בחנקן נוזלי

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. In vivo cardiac-specific gene delivery is commonly achieved by either systemic or local delivery. Systemic injection via tail vein is easy and efficient in manipulating cardiac gene expression by using recombinant adeno-associated virus 9 (AAV9). However, this method requires a relatively high amount of vector for efficient transduction, and may result in nontarget organ gene transduction. Here, we describe a simple, efficient, and time-saving method of intramyocardial injection for in vivo cardiac-specific gene manipulation in mice. Under anesthesia (without ventilation), the pectoral major and minor muscles were bluntly dissected, and the mouse heart was quickly exposed by manual externalization through a small incision at the fourth intercostal space. Subsequently, adenovirus encoding luciferase (Luc) and vitamin D receptor (VDR), or short hairpin RNA (shRNA) targeting VDR, was injected with a Hamilton syringe into the myocardium. Subsequent in vivo imaging demonstrated that luciferase was successfully overexpressed specifically in the heart. Moreover, Western blot analysis confirmed the successful overexpression or silencing of VDR in the mouse heart. Once mastered, this technique can be used for gene manipulation, as well as injection of cells or other materials such as nanogels in the mouse heart.

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Here we present a protocol for cardiac-specific gene manipulation in mice. Under anesthesia, the mouse hearts were externalized through the fourth intercostal space. Subsequently, adenoviruses encoding specific genes were injected with a syringe into the myocardium, followed by protein expression measurement via in vivo imaging and Western blot analysis.

שיטה פשוטה ויעילה In Vivo מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב באמצעות הזרקת Intramyocardial בעכברים

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

Intrathoracic Injection for the Study of Adult Zebrafish Heart

The adult zebrafish heart provides a powerful model in cardiac regeneration research. Although the strength of this system is based on transgenic approaches, a rapid delivery of exogenous factors provides a complementary technique in functional studies. Here, we present a method that relies on administration of a few microliters of solution into the pericardial cavity without causing myocardial damage. Intrathoracic (IT) injections can efficiently deliver proteins and chemical compounds directly onto the heart surface. The injected substances diffuse through the epicardium into the underlying cardiac tissues. Compared to intraperitoneal (IP) injections, the main advantage of intrathoracic injections is the focal administration of the tested factors on the target organ. The delivery of molecules directly into the pericardium is a suitable strategy for studies of cardiac preconditioning and regeneration in adult zebrafish.

This method relies on the injection of 0.5&#8722;3 &#956;L of solution into the thorax of adult zebrafish. The procedure efficiently delivers proteins and chemical compounds into the proximity of the zebrafish heart without damaging the organ. The approach is suitable for testing effects of exogenous factors on various tissues of the heart.