עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות DK074656 ו AI56374 (CEM), כמו גם את הקרן למחקר סוכרת נעורים.

1. הכנת התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא היעד תרבות: תרבות של בטא עכבר שורות תאים, ניט-1 ו אנבה-4, היה 1,2 תיאר בעבר DMEM בתוספת 10% FBS, BSA 0.02%, שאינן חיוניות חומצות אמינו, 15mm HEPES, 16.5mM Glocose ו פניצילין / סטרפטומיצין. במשך 51 תיוג Cr, בתאי הזרע צלחת שטוחה לתחתית-96 גם בתרבות ב 5X10 4 תאים / טוב בינוני 200 μl תרבות. עבור מיקרוסקופיה ניסויים בתאי הזרע 8-היטב Lab-טאק II החדרים coverglass ב 5x10 4 לכל תא בינוני 500 μl תרבות, ולאפשר לגדול במשך 48 שעות לפני השימוש בניסויים cytotoxicity. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרת קו T תרבית תאים: השתמש שורת תאים Jurkat (ATCC, CD3 + תא אנושי קו לימפוציטים) כביקורת שלילית. Jurkat התרבות תאים RPMI1640 בתוספת 10% FBS, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, 1.5 גר &#39;/ L סודיום ביקרבונט, HEPES 10 מ&quot;מ 1.0 נתרן pyruvate מ&quot;מ. </li></ol> 2. אוסף והפעלה של מפעיל autoreactive CD8 + T תאים NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] ו NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] נרכשו מן המעבדה ג&#39;קסון (בר הרבור, ME) ו העכבר הוליד במתקן שלנו. הצאצאים היברידית F1 מ הזדווגויות של NOD-AI4a עם NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] לפתח סוכרת ב 3-5 שבועות. כל העכברים שוכנו הפתוגן ללא מתקנים ספציפיים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים של מוסד רלוונטי ועדת שימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים 3-4 בן שבוע NOD-AI4a / b בעכברים באמצעות ה-CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף spleens מעכברים. בעכברים מורדמים מוכנים עם תרסיס אתנול ופתח מתחת למכסה המנוע כירורגית. Spleens יוסרו לשים חיץ קרים כקרח HBSS מיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים הטחול באמצעות 7 מ&quot;ל זכוכית homogenizer. שניים עד שלושה spleens כל שמים 5 מ&quot;ל של HBSS קר הומוגני עם 7 מ&quot;ל זכוכית homogenizer. Homogenate נאסף centrifuged ב 1200rpm במשך 5 דקות ב 4 ° C באמצעות צנטריפוגות Sorvall RT7 +. כדורי תא נאספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כדוריות הדם האדומות באמצעות טיפול פתרון hypotonic. פתיתי מטופלים עם 5 מ&quot;ל hypotonic פתרון / הטחול על קרח למשך 5 דקות, ואז לנטרל על ידי הוספת נפח שווה של HBSS. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה, כאמור לעיל, ו resuspend ב 50 HBSS מ&quot;ל. Pass התאים מושעה דרך מסננת התא לספור באמצעות hemocytometer עם מכתים TrypanBlue. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת התאים. תאים Resuspend ב 5x10 6 / mL ולהפעיל באמצעות התרבות 3 יום עם 0.1 מיקרומטר AI4 mimotope (רצף החומצות האמיניות YFIENYLEL) ו 25 U / mL IL-2 ב RPMI1640 בתוספת 10% FBS, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, 1.5 גר &#39;/ L סודיום ביקרבונט, HEPES 10 מ&quot;מ 1.0 נתרן pyruvate מ&quot;מ. </li></ol> 3. Assay 51 Cr לשחרר לבחון CML <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היעד תאים לייבל: הוסף 51 Cr למקד תאים ב 1 μCi / היטב בתרבות במשך 3 שעות, 3 פעמים ולשטוף עם המדיום לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מפעיל תאים במדיום 1640 RPMI כאמור בשלב 2.5 כך הנפח הסופי נוספו גם כל 200 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי של התאים היעד שכותרתו, להוסיף תאים מפעיל מופעל על התא תרבויות היעד ב מפעיל הרצוי היעד (E: T) יחסי. אנחנו בדרך כלל להשתמש E: יחסי T על 0.4:1, 01:01, 02:01, 05:01, 10:01, 20:01 ו - 50:1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טרי שונה RPMI 1640 בינוני (ראה שלב 2.5) עד 6 בארות של תאים מטרה לשמש שליטה תמוגה ספונטנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף התרבות תאים מפעיל היעד במשך 16 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant ב 6x50 מ&quot;מ צינורות זכוכית ליים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים על ידי הוספת SDS 2% 100μl ו pipetting מספר פעמים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף lysate תא קבוצה נוספת של 6x50 מ&quot;מ ליים צינורות זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בארות פעם עם נקי H 2 O ולהוסיף את לשטוף את הצינורות lysate התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן supernatants ו lysates תא באמצעות מונה גמא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב תמוגה ספציפיים כדלקמן: <img src="files/ftp_upload/2724/2724eq1.jpg" alt="משוואה 1" /></li></ol> 4. מכתים של תאים עבור דימות תא חי בין הנפוצות ביותר צבעים קרום המיטוכונדריה פוטנציאל, תערוכות TMRM את הרעילות לפחות המיטוכונדריה. 3 לפיכך, אנו בוחרים TMRM אלה בדיקות הדמיה לחיות התא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 40 המניות mM פתרון TMRM ב DMSO ולאחסן ב -20 ° C. הפוך [25 nM] פתרון עובד טרי פנול אדום ללא DMEM עם כל תוספי לתרבות ניט 1 תא 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם היעד ניט-1 תאים עם TMRM 25 ננומטר למשך 30 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את התקשורת עם התקשורת טרי המכיל 5 nM TMRM לשמור על חלוקת משקל של 4 צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן מופעל מפעיל AI4 בתאי T באמצעות hematocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם מופעל מפעיל AI4 בתאי T עם μl 1 / mL Picogreen עבור5 דקות בטמפרטורת החדר לשטוף עם פנול אדום ללא בינוני תרבות 3 פעמים. </li></ol> 5. הערכת תא T לימפוציטים בתיווך מוות בטא באמצעות דימות תא חי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverglass החדרים עם תאים ניט מוכתם על הבמה של מיקרוסקופ LSM 510 Zeiss confocal. הסר את הכרטיסייה עם dremmel וגז לעקר את הכוס החדרים עם תחמוצת etheline. השלב מצויד תא חי תא הדמיה כי יש טמפרטורה מבוקרת על 37 ° C ו 5% CO 2 עם לחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מופעל בתאי T מוכתמות לתאי המיועד ב E שונים: יחסי טי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוסף אותו מספר של תאים Jurkat מוכתם לתאי הבקרה. </li></ol> 6. קבלת תמונות תא חי המיקרוסקופ מצויד הבמה ממונע שאפשר לנו שוב ושוב לרכוש תמונות במקומות שונים מתאי זהה או שונה באופן אוטומטי במשך זמן הניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות עדשה שמן 63x אובייקטיבי, לקחת תמונות בהפרש של כל 3 דקות עבור סכום כולל של 300 מסגרות לשנייה מיקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי מכתים TMRM באמצעות גל עירור באורך של 543 ננומטר להגדיר מסנן פליטה 565-619 ננומטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי מכתים Picogreen באמצעות עירור 488 ננומטר ומערכת סינון עבור פליטת 500-630 ננומטר. הסרטון נוצר באמצעות תוכנה Zeiss LSM. </li></ol> 7. וידאו המרה לפרסום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנה LSM Zeiss, ליצור קובץ דחוס סרט בפורמט AVI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמיר את הוידאו לפורמט שפורסם, לייבא את הווידאו לתוך חבילת תוכנה פיג&#39;י ( <a href="http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji">http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji</a> ), ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info. nih.gov / ij /</a> ) הפצה, באמצעות תוסף Bioformats מ לוקוסים ( <a href="http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats">http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הגדרות הבהירות והניגודיות כדי לאזן את אותות ירוק ואדום ואת מסגרת הדולר נקבע 2 מסגרות / שנייה באמצעות תפריט אפשרויות אנימציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את הווידאו 512 x 512 פיקסלים ולייצא כקובץ לא דחוס אבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח קובץ AVI ב Quicktime תוכנה 7 (Apple Computer, בקופרטינו, קליפורניה) ו לדחוס ולייצא את פורמט קובץ פתוח וידאו H264/MPEG-4 ב 1200 kbs / שנייה. </li></ol> 8. נציג תוצאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התוצאה נציג assay 51 CML Cr. איור 1 מציג תוצאה נציג assay CML שם תמוגה אחוז מסוים (ציר Y) מגדילה את מפעיל: יחס יעד (ציר X) עולה. תאים היעד העיקרי הם איים מבודדים NOD immunodeficient Rag1-/ -. עכברים שכותרתו עם 51 Cr. Splenocytes מן העכברים הטרנסגניים NOD.AI4α / β מבודדות הופעל כמתואר בשלב 2 לעיל. מטרות effectors היו שיתוף תרבותי במשך 16 שעות. תמוגה אחוז מסוים מחושב כמתואר צעד 3.11 לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני (חיוביות ושליליות) נציג תוצאות של תא בתיווך T בטא פיזור קרום התא המיטוכונדריה פוטנציאל מוצגים. תאים הם מוכתמים ותגובות נרשמות כמתואר 4 שלבים, 5 ו -6 לעיל, קבצי וידאו נוצרים כמו בשלב 7. וידאו 1: בטא עכבר התא קו ניט-1 היה מוכתם פוטנציאל קרום המיטוכונדריה TMRM צבע (אדום). הופעל, autoreactive CD8 + T התא AI4 (ירוק ויטראז עם Picogreen) היו שיתוף תרבותי עם אלה ניט-1 תאים ב E: T יחס של 50:1. ניט-1 פוטנציאל קרום המיטוכונדריה התפוגגה בהדרגה במהלך משך 400 דקות, אבל רק אשכולות שהיו באינטראקציה עם AI4 ותאי T. וידאו 2: כמו בניסוי שליטה, ניט-1 תאים הוכתמו TMRM ושיתוף בתרבית עם תאים Picogreen Jurkat מוכתם ב E: T יחס של 50:1. תאים Jurkat הם קו התא האנושי T כי היא MHC תואמים. ניט-1 התאים נשמר פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה במהלך כל תקופת 400 דקות שיתוף תקופת הדגירה. תאים Jurkat לא אינטראקציה עם ניט-1 אשכולות ולכן, לא לגרום הרג. </li></ol><img src="files/ftp_upload/2724/2724fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1 תוצאה נציג CML כמו איים באמצעות תאים היעד העיקרי שבודד immunodeficient NOD.Rag1-/ -. עכברים splenocytes מן העכברים הטרנסגניים NOD.AI4α / β. מטרות effectors היו שיתוף תרבותי במשך 16 שעות. תמוגה אחוז מסוים מגבירה את מפעיל: יחס מגביר יעד. 1. בטא עכבר וידאו התא קו ניט-1 היה מוכתם הקרום המיטוכונדרי פוטנציאל TMRM צבע (אדום). הופעל autoreactive CD8 + T התא AI4 (ירוק ויטראז עם Picogreen) היו שיתוף תרבותי עם אלה-1 ניט תאים ב E: היחס T של 50:1. ניט-1 המיטוכונדריה פוטנציאל הממברנה dissipaטד בהדרגה במהלך משך 400 דקות, אבל רק אשכולות שהיו באינטראקציה עם ירוק AI4 ותאי T. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/video.mov">לחץ כאן כדי לצפות בווידאו</a> . וידאו 2. אנבה-1 התאים היו מוכתמים אותו כמתואר וידאו 1 ושיתוף תרבותי עם Picogreen Jurkat מוכתם האדם קו T התא. ניט-1 התאים היו מסוגלים לשמור על פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה מחשבה משך 400 דקות. תאים Jurkat לא אינטראקציה עם ניט-1 אשכולות ולכן לא לגרום הרג. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/Video2.mp4">לחץ כאן כדי לצפות בווידאו</a> .

<ol>
	<li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li><li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell.">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li><li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores.">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li><li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+immune-mediated+(type+1)+diabetes+mellitus:+potential+for+immunotherapy.">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li><li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+resistance+of+ALR/Lt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction:+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants.">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes.">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li><li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+membrane+potential+(deltapsi(m))+in+apoptosis;+an+update.">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li><li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways.">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li><li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha.">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li></ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת פלורידה Animal Care מוסדיים ועדת שימוש.

ציטוטוקסיות T בטא בתיווך התא מוות של תאים הוא פתופיזיולוגיה העיקרי של T1D 5. מבחני CML באמצעות שחרור 51 Cr לאפשר לנו ללמוד את מידת התגובה היעד מפעיל-6. עם זאת, תהליך מפורט מסלולים המוות T התא בתיווך תא הבטא עדיין לא הבינו באופן מלא. מאז המיטוכונדריה הן קריטיו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> CR-51 </td><td> פרקין אלמר </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tetramethyl Rhodamine מתיל אסתר (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td> רצף חומצות אמינו: YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> R &amp; D </td><td> 485-MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> שור סרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25-060-Cl </td><td></td></tr><tr><td> ממ שאינם חיוניים חומצות אמינו </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> מזל תאומים </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> פנול אדום ללא DMEM </td><td> סיגמא </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> החממה CO2 </td><td> תרמו פישר </td><td> HeraCell 150i </td><td> שמרו סטרילי עבור תרבית תאים </td></tr><tr><td> בטיחות ביולוגית הממשלה </td><td> תרמו פישר </td><td> פורמה 1440 </td><td></td></tr><tr><td> תרבות צינורות פנויה, 6x50 מ&quot;מ זכוכית ליים </td><td> דיג </td><td> 14-958-A </td><td></td></tr><tr><td> גמא מונה </td><td> פרקין אלמר </td><td> אשף אוטומטי 1470 מונה גמא </td><td></td></tr><tr><td> Confocal מיקרוסקופ </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 Meta Confocal </td><td> עם הבמה ממונע תא תא חי </td></tr><tr><td> פיפטה (1ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> צינורות (אמבר) </td><td> דיג </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Sorvall מקרא RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Hemacytometer </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> זקוף מיקרוסקופ </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ עכברים </td><td> ג&#39;קסון מעבדה </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ עכברים </td><td> ג&#39;קסון מעבדה </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD-AI4α / עכברים F1 β </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bred במתקן חיה UF </td></tr></tbody></table>

methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes

סוכרת מסוג 1 (T1D) הוא תא T בתיווך מחלה אוטואימונית. במהלך בפתוגנזה, חולים הופכים בהדרגה insulinopenic יותר כמו ייצור אינסולין הוא איבד, ככל הנראה זו תוצאה של הרס תאים בטא בלבלב על ידי ותאי T. הבנת מנגנוני מוות של תאים בטא במהלך הפיתוח של T1D יספק תובנות כדי ליצור תרופה יעילה למחלה זו. Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity השתמשו בעבר כרום רדיונוקלידים 51 (51 Cr) לתייג התאים היעד. מטרות אלו נחשפים מכן מפעיל תאים ושחרור של 51 Cr מתאי המטרה היא לקרוא כאינדיקציה המוות הלימפוציטים בתיווך התא. מעכבי תוצאה של התא למוות לשחרר ירידה של 51 Cr. כמו תאים מפעיל, השתמשנו האוכלוסייה מופעל המשובטים autoreactive של CD8 + ציטוטוקסיות לימפוציטים מסוג T (CTL) מבודד מהונדס עכבר המניות אלפא וגם שרשראות בטא של קולטן T AI4 תא (TCR). הופעל AI4 בתאי T היו שיתוף תרבותי עם 51 Cr שכותרתו ניט תאים היעד במשך 16 שעות, שחרור של 51 Cr נרשמה לחשב תמוגה ספציפי המיטוכונדריה להשתתף באירועים רבים פיזיולוגיים חשובים כגון הפקת אנרגיה, ויסות איתות התמרה, ו אפופטוזיס. המחקר של בטא שינויים התא המיטוכונדריה תפקודית במהלך הפיתוח של T1D הוא אזור הרומן של המחקר. שימוש המיטוכונדריה פוטנציאל הממברנה לצבוע Tetramethyl Rhodamine מתיל אסתר (TMRM) הדמיה confocal מיקרוסקופיים תא חי, אנחנו במעקב פוטנציאל קרום המיטוכונדריה לאורך זמן בתור תא בטא ניט-1. עבור בדיקות הדמיה, מפעיל AI4 בתאי T תויגו עם פלורסנט גרעיני מכתים צבע Picogreen. ניט-1 ותאי T היו שיתוף בתרבית החדרים coverglass ועלה על הבמה מיקרוסקופ המצויד בתא תא חי, מבוקר על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2, ו humidified. במהלך ניסויים אלה התמונות נלקחו של כל אשכול כל 3 דקות עבור 400 דקות. במהלך של 400 דקות, צפינו את פיזור פוטנציאל קרום המיטוכונדריה ניט-1 אשכולות התא שבו AI4 בתאי T צורפו. בניסוי שליטה בו זמנית איפה ניט-1 התאים היו שיתוף תרבותי עם MHC אי - התאמה האדם תאים לימפוציטים Jurkat, פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה נותרו על כנן. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לצפות בזמן אמת שינויים בפוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה בתאים תחת מתקפה של לימפוציטים, ציטוקינים ציטוטוקסיות, או ריאגנטים ציטוטוקסיות אחרות.

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes at JoVE.com

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity ניתן להשתמש כדי לבדוק את התגובות autoreactive מנגנוני המחקר של מוות של תאים במבחנה. עם זאת, שימוש לחיות תאים confocal טכניקות הדמיה מיקרוסקופית עם צבעי ניאון, סוג קינטיקה של מוות של תאים, כמו גם את המסלולים מנוצל ניתן ללמוד ביתר פירוט.

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

methods-to-assess-beta-cell-death-mediated-by-cytotoxic-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.3K Views.  University of Florida. Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity ניתן להשתמש כדי לבדוק את התגובות autoreactive מנגנוני המחקר של מוות של תאים במבחנה. עם זאת, שימוש לחיות תאים confocal טכניקות הדמיה מיקרוסקופית עם צבעי ניאון, סוג קינטיקה של מוות של תאים, כמו גם את המסלולים מנוצל ניתן ללמוד ביתר פירוט.

Video: Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

הרחבת לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים מדם טבורים שציטומגלווירוס יעד, וירוס אפשטיין באר, וadenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host cells1. These cells express a specialized receptor, called the T cell receptor (TCR), which can recognize a specific antigenic peptide bound to HLA class I molecules2. Engagement of infected cells or tumor cells through their HLA class I molecule results in production of lytic molecules such as granzymes and perforin resulting in target cell death. While it is useful to determine frequencies of antigen-specific CD8 T cells using assays such as the ELIspot or flow cytometry, it is also helpful to ascertain the strength of CD8 T cell responses using cytotoxicity assays3. The most recognizable assay for assessing cytotoxic function is the Chromium Release Assay (CRA), which is considered a standard assay 4. The CRA has several limitations, including exposure of cells to gamma radiation, lack of reproducibility, and a requirement for large numbers of cells. Over the past decade, there has been interest in adopting new strategies to overcome these limitations. Newer approaches include those that measure caspase 
release 4, BLT esterase activity 5 and surface expression of CD107 6. The impedance-based assay, using the Roche xCelligence system, was examined in the present paper for its potential as an alternative to the CRA. Impedance or opposition to an electric current occurs when adherent tumor cells bind to electrode plates. Tumor cells detach following killing and electrical impedance is reduced which can be measured by the xCelligence system. The ability to adapt the impedance-based approach to assess cell-mediated killing rests on the observation that T cells do not adhere tightly to most surfaces and do not appear to have much impact on impedance thus diminishing any concern of direct interference of the T cells with the measurement. Results show that the impedance-based assay can detect changes in the levels of antigen-specific cytotoxic CD8 T cells with increased sensitivity relative to the standard CRA. Based on these results, impedance-based approaches may be good alternatives to CRAs or other approaches that aim to measure cytotoxic CD8 T cell functionality.

The chromium release assay, a common assay for detecting cytotoxic T cell activity, has several limitations. Using antigen-specific CD8 T cells and the human breast cancer tumor line, SKBR3, in the present article, an impedance-based approach was examined for the capability of detecting cell killing.

קביעת פעילות ציטוטוקסית אופטימלית של CD8 תאי T ספציפי אדם Her2neu על ידי השוואת Assay שחרור Cr51 למערכת xCELLigence

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on extracellular matrix proteins, for measuring the motility of fluorescently-labeled, non-adherent human or murine effector immune cells. This technique employs a stainless steel manifold and 10-well Teflon slide to focally deposit non-adherent T cells into wells prepared with either confluent tumor cell monolayers or extracellular matrix proteins. Light and/or multi-channel fluorescence microscopy is used to track the movement and behavior of the effector cells over time. Fluorescent dyes and/or viral vectors that code for fluorescent transgenes are used to differentially label the cell types for imaging. This method is distinct from similar-type in vitro assays that track horizontal or vertical migration/invasion utilizing slide chambers, agar or transwell plates. The assay allows detailed imaging data to be collected with different cell types distinguished by specific fluorescent markers; even specific subpopulations of cells (i.e., transduced/nontransduced) can be monitored. Surface intensity fluorescence plots are generated using specific fluorescence channels that correspond to the migrating cell type. This allows for better visualization of the non-adherent immune cell mobility at specific times. It is possible to gather evidence of other effector cell functions, such as cytotoxicity or transfer of viral vectors from effector to target cells, as well. Thus, the method allows researchers to microscopically document cell-to-cell interactions of differentially-labeled, non-adherent with adherent cells of various types. Such information may be especially relevant in the assessment of biologically-manipulated or activated immune cell types, where visual proof of functionality is desired with tumor target cells before their use for cancer therapy.

We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.

מחוגי ניידות ותפקוד ציטוטוקסיות של retroviral מעתיקה וקטור transduced, שאינם חסיד Alloresponsive T לימפוציטים

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

פרוטוקול בידוד יעיל עבור B ו- T לימפוציטים משקדי הפלטין אדם

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

דיפוזיה מולקולרית פלזמה ממברנות יסודי לימפוציטים נמדד באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

כימות מהיר של Blastogenesis mitogen-Induced T לימפוציטים לזיהוי סמים המערכת החיסונית

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...