עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן Wellcome וBBSRC לIG. IG הוא Wellcome עמית בכיר.

<ol>
	<li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions.">Protein-protein interactions.</a> Biochem Soc Trans. 38, 875-878 (2010).</li><li>Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+interacting+partners+using+tandem+affinity+purification.">Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+protein+interactions+and+complexes+by+affinity+purification+followed+by+label-based+quantitative+mass+spectrometry.">Resolving protein interactions and complexes by affinity purification followed by label-based quantitative mass spectrometry.</a> Proteomics. 12, 1623-1638 (2012).</li><li>Emmott, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+interactome+of+the+coronavirus+infectious+bronchitis+virus+nucleocapsid+protein+and+functional+implications+for+virus+biology.">The cellular interactome of the coronavirus infectious bronchitis virus nucleocapsid protein and functional implications for virus biology.</a> J Virol. 87, 9486-9500 (2013).</li><li>Li, W., Belsham, G. J., Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+initiation+factors+4A+(eIF4A)+and+4G+(eIF4G)+mutually+interact+in+a+1:1+ratio+in+vivo.">Eukaryotic initiation factors 4A (eIF4A) and 4G (eIF4G) mutually interact in a 1:1 ratio in vivo.</a> J Biol Chem. 276, 29111-29115 (2001).</li><li>Nielsen, P. J., Trachsel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+protein+synthesis+initiation+factor+4A+gene+family+includes+two+related+functional+genes+which+are+differentially+expressed.">The mouse protein synthesis initiation factor 4A gene family includes two related functional genes which are differentially expressed.</a> EMBO J. 7, 2097-2105 (1988).</li><li>Galicia-Vazquez, G., Cencic, R., Robert, F., Agenor, A. Q., Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+response+linking+eIF4AI+activity+to+eIF4AII+transcription.">A cellular response linking eIF4AI activity to eIF4AII transcription.</a> RNA. 18, 1373-1384 (2012).</li><li>Zakowicz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+the+DEAD-box+RNA+helicase+eIF4AII+characterizes+its+interaction+with+transformation+suppressor+Pdcd4+and+eIF4GI.">Mutational analysis of the DEAD-box RNA helicase eIF4AII characterizes its interaction with transformation suppressor Pdcd4 and eIF4GI.</a> RNA. 11, 261-274 (2005).</li><li>Rothbauer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+nanotrap+for+biochemical+and+functional+studies+with+fluorescent+fusion+proteins.">A versatile nanotrap for biochemical and functional studies with fluorescent fusion proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 282-289 (2008).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes.">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li><li>Dobreva, I., Fielding, A., Foster, L. J., Dedhar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+integrin-linked+kinase+interactome+using+SILAC.">Mapping the integrin-linked kinase interactome using SILAC.</a> J Proteome Res. 7, 1740-1749 (2008).</li><li>Mittler, G., Butter, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SILAC-based+DNA+protein+interaction+screen+that+identifies+candidate+binding+proteins+to+functional+DNA+elements.">A SILAC-based DNA protein interaction screen that identifies candidate binding proteins to functional DNA elements.</a> Genome research. 19, 284-293 (2009).</li><li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+QUICK.">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li><li>Boulon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+protein+frequency+library+and+its+application+in+the+reliable+identification+of+specific+protein+interaction+partners.">Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 861-879 (2010).</li><li>Wang, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+dynamic+interactors+of+protein+complexes+by+quantitative+mass+spectrometry.">Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 46-57 (2008).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+COP9+signalosome+complex+using+affinity+purification+and+mass+spectrometry.">Characterization of the human COP9 signalosome complex using affinity purification and mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 7, 4914-4925 (2008).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אסטרטגית הנפתח SILAC המתוארת כאן מהווה אמצעי רגיש מאוד ורב עוצמה של גילוי חלבון חדש: אינטראקציות חלבון, ויתר על כן מאפשרת האפליה המהירה ופשוטה של ​​דפוסים המחייבים שינו בין דגימות קשורות קשר הדוק של עניין. בדוגמא זו טכניקה זו הייתה בשימוש כדי לחקור את החלבון: אינטראקציות חלבון של חלבוני eIF4AI וeIF4AII 6. לידיעתו של המחבר, זהו המחקר הראשון בספרות מנצלת את השירות של פרוטאומיקה SILAC לחקור interactome הסלולרי של שני isoforms של eIF4A אלה. הגישה כפי שתואר לעיל משתמשת GFP-תג ואנטי-GFP חרוזים 9, 10 ולכן שינויים עשויים להידרש כדי לאפשר גישה זו כדי לשמש לחלבון ספציפי של עניין, לדוגמא אם התג ממוקם בN-או C-סופית של חלבון. איפה, כתמים מערביים אפשריים או מבחני פונקציונליים צריכיםיש לבצע כדי לזהות מחייב של שותף אינטראקציה חלבון ידוע. צריך חלבון לא יסבול היתוך עם תג ה-GFP, תיוג אחר או אסטרטגיות הנפתח הוחלו pulldowns SILAC באמצעות שני תגים אחרים (FLAG 11, 12 ביוטין, סטרפטוקוקוס (הנתונים שלו,) לא פורסם), או על ידי שימוש בנוגדנים ראשוניים נגד חלבון עניין שבו מציאה siRNA של חלבון המטרה מספקת מדגם שליטה 13. ניסויים כאלה כבר מתוארים במקומות אחרים בספרות, אבל בקצרה, שלב 1 ושלבים 5.4-8 היינו להיות מיושמים כאמור לעיל, בצעדים 2-5.3 שונה בהתאם למערכת ביטוי / הנפתח של בחירה באמצעות תשומות חלבון שווים כפי שמתואר ב צעדים 2.4-2.5. כשלבי הכימות לאפשר חלבונים המחייבים שאינם ספציפיים שיש להסיר ברמת הניתוח, מומלץ להשמיט מראש דגירה עם חרוזים שליטה, או שטיפות מלח גבוהות על מנת לשמר חלבון דל זיקה: אינטראקציות חלבון עם חלבון של עניין . Ma nucleasey להיכלל או הושמט מפרוטוקול זה על פי הפרטים של ניסוי מסוים. לדוגמא: כמו החלבונים המשמשים בשיטה זו הם helicases RNA, קוקטייל RNase נכלל בפרוטוקול כדי להסיר אינטראקציות עקיפות בתיווך באמצעות RNA (שלב 3.2). במקרים מסוימים עם זאת, יכול להיות שיש להפיק תועלת מביצוע ניסויים במקביל עם ובלי nuclease לזהות אינטראקציות תלויות חומצות גרעין. בתוך פרוטוקול זה, המיתוג של &quot;בינוני&quot; ודגימות &#39;כבדות&#39; בניסויים לשכפל מומלץ לשלוט וריאציה הוצגה על ידי הבדלים בתקשורת SILAC או צמיחת תאים. שליטה חלופית כרוכה במעבר הרציף של כל שלושה (, &#39;הבינוני&#39;, &#39;אור&#39; ו &#39;הכבדות&#39;) כלי התקשורת בניסויי העתק. בעוד גישה זו היא שעלולה להיות מחמירה יותר, זה להגדיל את המורכבות של הניתוח, כמו בלשכפל אחד לפחות, חלבון של עניין wחולה להיות מיוצר בתאים &#39;אור&#39; שכותרתו ולכן יש צורך להבחין בין החלבונים שזוהו באופן עקבי בדגימות &#39;אור&#39; (מזהמים סביבתיים כגון keratins), ואלה שמועשרים רק בדגימות &#39;אור&#39; כאשר חייב חלבון של ריבית. תוך השימוש בנתוני כימות מאפשר אפליה של ספציפיות מאינטראקציות לא ספציפיות באמצעות שימוש בסף, באופן בלתי נמנע כמה אינטראקציות אמיתיות עשויות להיות מושלכת. הגישה הנ&quot;ל היא גישה פשוטה ומהירה לזיהוי חלבון: אינטראקציות חלבון זה יכול להיות ניסיון בקלות על ידי חוקרים ללא ניסיון קודם עם ספקטרומטריית מסה, או ניתוח של חלבון גדול: מערכי נתונים אינטראקציה חלבון. עבור רוב השימושים זה יותר ממספיק לזיהוי חלבונים חדשים של עניין. שינויים בהמשך לגישה זו כדי לעזור להפחית אובדן נתונים זה מתוארים במקומות אחרים בספרות, וכוללים שימוש ביחסי ציבורספרייה בתדירות otein בי ידועות חלבונים מזהמים לקבוצה מסוימת של פרמטרים ניסיוניים (קו תא, מטריצת חרוז, תנאי חיץ) עשויה להיות שלילית 10, 14. עם זאת, בהתאם לפרמטרים של ניסוי מסוימים זה עשוי להיות נחוץ כדי להפעיל מספר ניסויי שליטה לייצר proteome חרוז וזה ולכן יכול להגביר הן את חשבון והמורכבות של הניסוי. מידע נוסף על טכניקה זו הוא זמין מאתר האינטרנט www.peptracker.co.uk 14. צריך גם לציין, כי הפרוטוקול שתואר לעיל כרוך בערבוב דגימות שכותרתו שונה בסופו של תהליך immunoprecipitation (שמכונה ערבוב לאחר טיהור - ניסוי SILAC MAP). הדבר נעשה כחלבון: אינטראקציות חלבון להתרחש בשיווי משקל נתון 15. יש לציין שקבוצות אחרות יש בשילוב גישת SILAC מפה זו מתוארת בפרוטוקול זה עם דגירה של הדגימותלפני הנפתח (טיהור לאחר ערבוב - PAM SILAC) עבור אורכים שונים של זמן (20 דקות לשעה 2 היו בשימוש בספרות) 15, 16. בהתבסס על כמה מהר יחס חלבון יורד לכיוון 1:1, ניתן לחקור באופן איכותי זיקות מחייבות ולהגדיר חלבונים כמו חלבוני אינטראקציה יציבים או דינמיים 15. לסיכום, pulldowns SILAC מייצג אמצעי רב עוצמה לזיהוי חלבונים באינטראקציה עם חלבון נתונה של ריבית, בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. הטכניקה יכולה להיות מותאמת בקלות למספר אסטרטגיות טיהור שונות, המאפשרת יישום שלה לכל חלבון נתונה של ריבית. כימות של תוצאות בהרבה מפשטת זיהוי של אינטראקציות אמיתיות, ומאפשרת הרפיה של תנאי חיץ מחמירים המשמשים להסרת קלסרים שאינם ספציפיים, ובכך שומרת על אינטראקציות זיקה נמוכות. כפי שניתן לעומת עד שלוש דגימות באמור לעילאסטרטגיה, יש לו את הטכניקה עוצמות ברורות בהשוואת הבדלים בחלבון קושר בין isoforms שונה חלבון, חלבוני מוטציה, או את ההשפעה של מעכבים תרופתיים. כפרוסות ג&#39;ל כל מנותחות ולא להקות בודדות שכתם על ידי Coomassie, המספרים של חלבונים שזוהו בוודאות גבוהה הם בדרך כלל גבוהים יותר מאלה שזוהו בGST / TAP-הנפתח סטנדרטיים, והנסיין הטיה בבחירת חלבונים של עניין מוסר. הטכניקה ולכן משווה מאוד לטובה עם טכניקות נפוצות אחרות המשמשות בזיהוי של חלבונים אינטראקציות רומן (שמרים 2 היברידי, GST / או pulldowns TAP).

צעד חיוני בהבנת תפקוד חלבון הוא זיהוי של חלבוני אינטראקציה רלוונטיים. איפה חלבונים כאלה אינם ידועים יש מספר טכניקות זמינות, כל אחד עם יתרונות משלהם וחסרונות. אלה כוללים את מערכת השמרים שני ההיברידית, מבחני הנפתח באמצעות חלבון רקומביננטי, כמו גם טיהור זיקת טנדם או TAP תיוג 1, 2. בנוסף אחרונים יותר לטכניקות אלה הוא שילוב של טיהור זיקה של חלבון של עניין משורת תאים של יונקים רלוונטיים, ואחריו על ידי ספקטרומטריית מסה כמותית באמצעות תיוג איזוטופ יציב של חומצות אמינו בתרבית תאים 3 (SILAC). זו יש יתרונות על פני הגישה של שני ההיברידית שמרים שבלוקליזציה התא ולאחר translational שינויים אינם מוטרדים, כמו גם יתרונות על פני מסורתי בכך שהיא היא גישת כמותית ולא איכותית המאפשרת למשתמש ריאה תיוג TAP<html> dily להבחין שאינו במיוחד באינטראקציה חלבונים וחומרים מזהמים, מגורמי מארח שלהיקשר באופן ספציפי. יתר על כן, כמדגם מנותח בדרך כלל כולו, ולא להקות חלבון בודדות, כמו, חלבונים של עניין אינם רעול פנים על ידי דומה נודדים חלבונים על ג&#39;ל, ואין הם בדרך כלל צריכים להיות נוכחים ברמות מספיקות כדי להיות גלוי לאחר צביעה, מה שמוביל ל מספרים מוגברים של חלבונים שזוהו בביטחון 4. כדי להדגים את הטכניקה הזו, התכה GFP של גורם החניכה תרגום אוקריוטים הקשור קשר הדוק eIF4AI וeIF4AII מניה שעל זהות חומצת אמין 90% נחקרו על ידי פרוטאומיקה כמותיים SILAC-immunoprecipitation. eIF4AI האדם והשני היו משובטים לתוך pEGFP-C1 ליצירת חלבון היתוך שבו GFP הוא קבע את N-הסופית של eIF4A. כדי למנוע את הצורך ביצירת שורות תאי יציבות transfection חולף שימש כדי לספק המבנים הללו לתאי איזוטופ יציבים שכותרת 293T. &quot;Jove_content&quot;&gt; תאים תויגו ראשון במשך שבועיים בתקשורת תרבות תא SILAC, ואחרי transfection של DNA פלסמיד קידוד חלבון של עניין. תאים אז היו lysed, ריכוז החלבון מנורמל, וכמויות שווים של זיקת lysate מטוהרים על agarose אנטי-GFP. כמויות שווה של eluate אוחדו לאחר מכן והגישו לניתוח LC-MS/MS. התוצאות של ניתוח זה מעובד מכן לזהות חלבון אמון גבוה: אינטראקציות חלבון (איור 1). immunoprecipitation SILAC מאפשרת זיהוי לא רק אינטראקציות ישירות אלא גם זיקה נמוכה או אינטראקציות עקיפות עם קומפלקסי חלבונים 4. באמצעות מערכת זו, immunoprecipitations eIF4AI והשני אפשר זיהוי לשעתק ובטוח בעצמו של השותף העיקרי מחייב eIF4G (isoforms I / II ו-III) 5, כמו גם יחסי גומלין עקיפים עם eIF4E, ומספר רבים של רכיבים המורכבים eIF3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium &#160;(DMEM)</td>
			<td style="width:87px;">Dundee Cell Products</td>
			<td style="width:88px;">LM010</td>
			<td style="width:745px;">DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:271px;">Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml</td>
			<td rowspan="2" style="width:87px;">Dundee Cell Products</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">DS1003</td>
			<td rowspan="2" style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Arginine (R0) 25g</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">A8094</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Arginine (R6) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CLM-2265</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Arginine (R10) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CNLM-539</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Lysine (K0) 25g</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">L8662</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Lysine (K4) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">DLM-2640</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Lysine (K8) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CNLM-291</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml</td>
			<td style="width:87px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">15140-122</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:88px;">11668-027</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">GFP-trap Agarose (500&#956;l resin)</td>
			<td style="width:87px;">Chromotek</td>
			<td style="width:88px;">gta-20</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">5x SDS Sample loading buffer</td>
			<td style="width:87px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">PN39000</td>
			<td style="width:745px;">The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td style="width:87px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:88px;">539134</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">1.7ml&#160; prelubricated tubes</td>
			<td style="width:87px;">Costar</td>
			<td style="width:88px;">3207</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">BCA protein assay kit (1L)</td>
			<td style="width:87px;">Pierce</td>
			<td style="width:88px;">23225</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Tris (Trizma)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Rnase cocktail</td>
			<td style="width:87px;">Ambion</td>
			<td>AM2286&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">NP-40 alternative</td>
			<td style="width:87px;">Millipore</td>
			<td align="right">492016</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of protein interaction partners in mammalian cells using silac-immunoprecipitation quantitative proteomics

פרוטאומיקה כמותית בשילוב עם טיהור חיסונית זיקה, immunoprecipitation SILAC, מייצגת אמצעי רב עוצמה לגילוי חלבון חדש: אינטראקציות חלבון. על ידי המאפשר כימות היחסית מדויקת של שפע חלבון בשליטה והן דגימות בדיקה, אינטראקציות אמיתי ניתן להבחין בקלות ממזהמים ניסיוניים. ניתן לשמר אינטראקציות זיקה נמוכה באמצעות השימוש בתנאי חיץ פחות מחמירים ויישארו לזיהוי בקלות. פרוטוקול זה דן בתיוג של תאים בתרבית רקמה עם חומצות אמינו שכותרתו איזוטופ היציב, transfection וimmunoprecipitation של זיקה מתויג חלבון של עניין, ואחריה ההכנה להגשה למתקן ספקטרומטריית מסה. פרוטוקול זה אז מסביר כיצד לנתח ולפרש את הנתונים שהוחזרו מספקטרומטר המסה על מנת לזהות שותפים סלולריים אינטראקציה עם חלבון של עניין. כדוגמא טכניקה זו תחול על iDENתצדיק את החלבונים מחייבים את גורמי חניכה תרגום אוקריוטים: eIF4AI וeIF4AII.

בניסוי הנפתח SILAC טיפוסי, הרוב המכריע של חלבונים שזוהו (&gt; 90%) מייצג מזהמים כמו גם חלבונים מחייבים שאינם ספציפי למטריצת זיקה וזה מודגם באיור 2 ב &#39;, גם כאשר פרוטוקולי כביסה להסיר רוב המזהמים cytoplasmic כגון (איור 2 א) GAPDH. עם זאת, באשכולות של הלא ספציפי מחייבים חלבונים בהתפלגות נורמלית מאפשר לי חלבונים באופן ספציפי להיקשר לחלבון של עניין יש להבחין כמו אלה מדגם / יחסים מדומים גבוהים יותר מהרקע. בעוד מזהמים אמורים באופן תיאורטי אשכול סביב יחס יומן 2 SILAC של 0, זה לא בהכרח המקרה, דוגמא לכך היא נתון באיור 3. סיבות אפשריות לכך כולל תיוג SILAC מושלם של תאים, טעינת כרכים או ריכוזים של lysate שוויוניים על חרוזים אנטי-GFP, אובדן מקרי של חרוזים במהלך טיהור או שילוב שוויוני<html> ing של דגימות בסוף הליך הטיהור 3. עם זאת, הנתונים בהנחה שהם נותחו על בסיס סטיית תקן סף מהממוצע של המזהמים מתפלגים נורמלי, משמרות קטין במרכוז של נתונים לא אמורה להשפיע על איכות התוצאות. כאשר משווים את ההבדלים באינטראקציות חלבון בין שני חלבונים קשורים, מצב דומה עלול להתרחש בו חלבון אחד של העניין מופק לרמות גבוהות יותר בתוך תאים משנייה (או בשל הבדלים ביעילות transfection, או נכס מהותי של החלבון או mRNA) . וריאציה מסוימת בביטוי (לדוגמא, איור 2 א) ניתן לתיקון על ידי ניתוח ליחס SILAC לשתי דגימות אלה. בדוגמא זו אלה יהיו דגימות ה-GFP-eIF4AI וה-GFP-eIF4AII. על ידי ניתוח יחס 4AI/4AII SILAC כאמור בסעיף 7, ניתן לזהות חלבונים שמחייבים משתנה באופן משמעותי בין isoforms. <html> class = &quot;jove_content&quot;&gt; באיור 4, ייצוג מחייב חלבוני eIF4A זיהו באחד הניסויים שנערכו ההעתק מוצג הממחיש את הכיסוי של מתחם גורם ייזום פרוטוקול זה הושג. היחס הגבוה ביותר נצפה בדרך כלל עם eIF4G, אשר נקשר ישירות לeIF4A, עם יחס נמוך יותר עבור eIF4E, אשר נקשר לeIF4G באתר מהאתר מחייב eIF4A. יחס נמוך יותר נצפה עבור חברים של מתחם eIF3. עם זאת, זה ממחיש באופן ברור כי הניסוי באופן משביע רצון זיהה שותפים המחייבים הן ישירים ועקיפים של eIF4AI ושני. כפי שניתן לצפות מהזהות גבוהה רצף 6, חלבון: אינטראקציות חלבון הופיעו נשמרים במידה רבה בין שני isoforms במערכת זו ניסיונית 7, 8. בחירה של חלק מחלבוני האינטראקציה מוצגת בטבלה 2, הממחישה את פורמט הנתונים. <table border="0" cellpadding="0" cellsp</html style=";text-align:right;direction:rtl">Acing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> כותרת עמודה </td><td> תיאור </td></tr><tr><td> הצטרפות </td><td> מציג את מספר ההצטרפות לרצף </td></tr><tr><td> כיסוי </td><td> חלקם של רצף החלבון מכוסה על ידי פפטידים זוהו </td></tr><tr><td> ♯ PSM </td><td> התאמה רפאים פפטיד </td></tr><tr><td> ♯ פפטידים </td><td> מספר כולל של פפטידים ייחודיים שזוהו לחלבון </td></tr><tr><td> ♯ AAS </td><td> אורכו של חלבון בחומצות אמינו </td></tr><tr><td> MW (דה) </td><td> המשקל המולקולרי של חלבון בDaltons. לא כולל שינויים </td></tr><tr><td> calc. PI </td><td> הנקודה איזואלקטרית התיאורטית של חלבון </td></tr><tr><td> ציון </td><td> הציון הכולל של חלבון (המייצג את הסכום של indivעשרות פפטיד idual). הציון המדויק הנדרש למשמעות ינוע בין ניסויים. מתקן MS בדרך כלל יחול 5% הפסקת שיעור גילוי שווא. </td></tr><tr><td> רצף </td><td> רצף חומצות האמינו המרכיבות את החלבון </td></tr><tr><td> יחס </td><td> העצמה היחסית של פפטידים בשם מדגם שכותרתו, בהשוואה למדגם שכותרת שנייה </td></tr><tr><td> רוזן יחס </td><td> מספר יחסי פפטיד ששמשו לחישוב יחס חלבון נתון </td></tr><tr><td> השתנות יחס (%) </td><td> ההשתנות של יחסי פפטיד הבודדים המשמשים לחישוב יחס חלבון נתון </td></tr><tr><td> תיאור </td><td> שמו של החלבון </td></tr></tbody></table> טבלת 1. כותרות עמודות רגילה מדו&quot;ח Proteome Discoverer.בעוד מידע שימושי ניתן להשיג מכל אחת מהעמודות אלה, אלה קריטיים לניתוח זה מוצגים באותיות מודגשות. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1057" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> הצטרפות </td><td> פפטידים </td><td> 4AI/Mock </td><td> 4AII/Mock </td><td> שם </td><td> ניתוח SILAC </td></tr><tr><td> A8K7F6 </td><td> 21 </td><td> 100 </td><td> 1 </td><td> eIF4AI </td><td rowspan="2"> חלבון &#39;פיתיון&#39; </td></tr><tr><td> Q14240 </td><td> 22 </td><td> 0.01 </td><td> 90.855 </td><td> eIF4AII </td></tr><tr><td> G5E9S1 </td><td> 25 </td><td> 47.575 </td><td> 30.53 </td><td> eIF4GI </td><td rowspan="3"> אינטראקציה חלבונים </td></tr><tr><td> Q59GJ0 </td><td> 5 </td><td> 11.778 </td><td> 10.619 </td><td> eIF4GII60; </td></tr><tr><td> P06730 </td><td> 3 </td><td> 7.22 </td><td> 7.57 </td><td> eIF4E </td></tr><tr><td> Q5T6W5 </td><td> 4 </td><td> 0.685 </td><td> 0.646 </td><td> hnRNPK </td><td rowspan="2"> מזהמים-במיוחד שאינו מחייבים </td></tr><tr><td> P62805 </td><td> 1 </td><td> 0.531 </td><td> 0.498 </td><td> H4 היסטון </td></tr><tr><td> H6VRG2 </td><td> 18 </td><td> - </td><td> - </td><td> קראטין-1 </td><td rowspan="2"> מזהמים סביבתיים </td></tr><tr><td> P35527 </td><td> 11 </td><td> 0.01 </td><td> 0.01 </td><td> cytoskeletal קרטין-1 9 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. נתונים אופייניים מניסוי immunoprecipitation SILAC. מתן נתונים דוגמא לחלבון של עניין / פיתיון (פפטידים גבוהים, יחס גבוה), חלבוני אינטראקציה עם חלבון של עניין (פפטידים גבוהים / נמוכים, יחס גבוה), שאינו מחייבים באופן ספציפי חלבונים (pept גבוה / נמוךאידו, יחס יורד מתחת לסף - בניסוי זה 0.96), ומזהמים סביבתיים (לעתים קרובות פפטידים גבוהים, יחס שלילי / מתחת לסף). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig1.jpg" /> איור 1. ניסויי תכנית. ראשית תאים גדלים בתקשורת חסרת ארגינין וליזין ולהחליף עם ארגינין איזוטופ היציב שכותרתו ויזין 2 שבועות (1). (2) תאים הם זורעים לתוך 10 סנטימטר 2 מנות וtransiently transfected עם פלסמידים קידוד ה-GFP (מוק) או חלבוני GFP היתוך (דוגמאות). (3) תאים lysed והחלבונים GFP או GFP היתוך הם immunoprecipitated מlysates התא. (4) דוגמאות משולבות בביחס של 1:1 והגישו לניתוח LC-MS/MS. הנתונים נותחו לאחר מכן להסיר את זיהוי חלבון אמון נמוךכישורים, וכדי לבחור ברמה של העשרת החלבון המתאימה לחלבוני אינטראקציה אמיתיים. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig2.jpg" /> איור 2. אישור תנאי immunoprecipitation מתאימים. א) ניתוח מערבי כתם של lysates תא, כמו גם שברים מאוגדים וכרוך מimmunoprecipitation מאשר ביטוי וimmunoprecipitation של החלבון של עניין. כתם מערבי נגד GAPDH מאשר דלדול של חלבונים שאינן אינטראקציה וכתם מערבי עוד שותפת אינטראקציה ידועה של eIF4A מאשרת immunoprecipitation המוצלחת של חלבוני קשירה לחלבון של עניין. ב) שותפים באינטראקציה של חלבון של עניין אינם ידועים, ג&#39;ל מוכתם כסף רשאי לאשר immunoprecipitation של חלבוני אינטראקציה. על כסף הכתם הזה<html> להקות ג&#39;ל ed עבור ה-GFP וGFP-eIF4AI/II ברורות, ולהקה הנודדת בגודל הנכון עבור eIF4G קיים רק בנתיבי GFP-4AI/II-bound ולא בנתיב שליטת ה-GFP. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig3.jpg" /> איור 3. נציג תוצאות. היסטוגרמה המציגה את ההתפלגות של יחסי חלבון מן חוזר אחד () הנפתח ה-GFP-eIF4AII ה-GFP-eIF4AI או (ב). הפסקת סטיית תקן 1.96 מסומנת בקו מקווקו. חלבוני אינטראקציה נופלים מחוץ למזהמים בדרך כלל המופצים ניכרים מ~ 0.25 ו1 ב (א), ו ~ .3-1.5 ב( ב &#39;). les/ftp_upload/51656/51656fig4.jpg &quot;/&gt; איור 4. זיהוי של חברים מורכבים eIF מהעתק אחד של ניסוי SILAC IP. חלבונים בירוק היו החלבון של עניין משמש לנפתח אינטראקציה חלבונים מוצלים מאדום לדברים לבנים להיכנס 2 יחס SILAC בIP SILAC עם אדום להיות החלבון הנפוץ ביותר בניתוח, ולבן להיות הפסקת 1.96 SD. חלבונים המוצלים באפור לא זוהו בניתוח זה.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics at JoVE.com

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

ניסויי immunoprecipitation SILAC מייצגים אמצעי רב עוצמה לגילוי חלבון חדש: אינטראקציות חלבון. על ידי המאפשר כימות היחסית מדויקת של שפע חלבון בשליטה והן דגימות בדיקה, אינטראקציות אמיתי ניתן להבחין בקלות ממזהמים ניסיוניים, ואינטראקציות זיקה נמוכות נשמרו באמצעות שימוש בתנאי חיץ פחות מחמירים.

זיהוי של שותפי אינטראקציה חלבון בתאי יונקים באמצעות SILAC-immunoprecipitation פרוטאומיקה כמותי

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

identification-protein-interaction-partners-mammalian-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

31.3K Views.  University of Cambridge.  ניסויי immunoprecipitation SILAC מייצגים אמצעי רב עוצמה לגילוי חלבון חדש: אינטראקציות חלבון. על ידי המאפשר כימות היחסית מדויקת של שפע חלבון בשליטה והן דגימות בדיקה, אינטראקציות אמיתי ניתן להבחין בקלות ממזהמים ניסיוניים, ואינטראקציות זיקה נמוכות נשמר...

Video: Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר<sub&gt; 2</sub&gt; כלי-<sub&gt; 2</sub&gt; Domains אבץ האצבע

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

זיהוי של איתות תאיים אירועים מושרה תאים קיימא על ידי אינטראקציה עם תאים שכנים מוות של תאים אפופטוטיים שעברו

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...