המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר Lubor Borsig (מכון לפיזיולוגיה, אוניברסיטת ציריך) בעצתו בטכניקה של זלוף ריאות. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מKrebsliga של Kanton ציריך, וולטר ל &#39;ויוהנה קרן וולף, ציריך, לידיה Hochstrasser הקרן, ציריך, שווייץ הקרן הלאומית למדע, SNF, שוויץ, Schweizerischer Verein Balgrist, והאוניברסיטה של הציר.

1. זלוף וקיבוע ריאות באתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם עכברים בהזרקת ה-IP של ~ פוספט μl 150 נאגר מלוח (PBS) המכיל 112.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג (משקל גוף) קטמין, xylazine 16.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג, ומ&quot;ג / ק&quot;ג 15 acepromazine (או על ידי הרדמה אחרת המכילה משככי כאבים מתאימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הרפלקסים של העכבר כבר לא נצפו, לתקן את זה על שולחן ניתוחי גב כלפי מטה ומרטיב את הפרווה עם אתנול 70% לחלקלקות את השערות למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את העור מהבטן עד הצוואר ולמשוך אותו לצדדים או להסיר אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח הצפק ובית החזה לגודל בשפע. למנוע קרע של כולים גדולים (jugularis הווריד למשל) כדי להימנע מיעילות מופחתת של זלוף שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הווריד הנבוב caudalis מתחת הכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק 20 מ&quot;ל מצויד ב21 ז&#39;- 24G מחט להזריק לאט 10-15 המ&quot;ל PBS לחדר הימני של הלב הפועם עד הריאות הן לבנות לחלוטין והלב מפסיק לפעום (asystole). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צבוט את כלי הדם מעל הכבד והסרעפת עם מהדק של כלי דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק מ&quot;ל 10 מצוידים ב21 ז&#39;- 24G מחט להזריק ~ 2 מ&quot;ל של paraformaldehyde 3% (PFA) ב PBS לחדר ימין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את קנה הנשימה מחוץ לבית החזה. השתמש באותו המזרק כדי להזריק ~ 3 מ&quot;ל של 3% PFA ב( מחוץ לבית החזה) PBS גולגולת לתוך קנה הנשימה עד לריאות מנופחות. מייד לאחר הסרת המחט, לצבוט את קנה הנשימה של הזנב לנקב עם מהדק של כלי דם ולחכות 10 דקות כדי לאפשר לקיבעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחצה את כלי הדם מעל מהדק כלי הדם, להסיר את המהדק ולהזריק ~ 2 המ&quot;ל PBS לתוך חדר ימין להסיר PFA העודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב את החלקים התחתונים של כל אונות הריאה עם מחט, להסיר את המהדק של כלי הדם בקנה הנשימה ולהזריק 3-5 מ&quot;ל של תמיסה של PolyFreeze הטבעה בינונית / PBS 01:01 לקנה הנשימה של הזנב לנקב הראשון עד PFA ב ריאותאונות מוחלפות בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הריאות בזהירות על ידי משייכת הלב עם מלקחיים וtransecting רצועות רקמות חיבור, כלי דם וקנו נשימה. שמור על הלב הקשור לריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תלוי איך להמשיך עם ניתוח רקמת הריאה להמשיך בפרוטוקולים המפורטים בסעיפי 2 או 3. אם אתה רוצה לעשות את שני הניתוחים, להסיר אונת ריאה אחת והמשך כמתואר תחת 3. לעבד את האונות הנותרות הקשורים ללב כפי שתואר תחת 2. </li></ol> 2. ויזואליזציה של תאי גידול גרורתי lacZ מתויג-באונה של ריאות שלמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הריאות בכוס פלסטיק עם מכסה סגירה הדוק ולתקן את זה עם פורמלדהיד 2% ב PBS בטמפרטורת חדר במשך 30-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון קיבעון ולשטוף ביסודיות 3 פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לפחות 10 מ&quot;ל מוכן טרי 5-Bromo-4-כלורו-3-β-indolyl-D-galactoside (X-גל) (פתרון מנייה מכתים פתרון ה-X גל [40 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בDimethylformamide] 1:40 דילול בפתרון בסיסי כתמים; pH 7.1 (טבלה 1); להגן מפני אור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים פיסת הגזה על גבי הריאה שהחייה כדי לשמור אותו לחלוטין בפתרון ולמקם את המכסה רק באופן רופף על הסיר על מנת לאפשר חילופי האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3-5 שעות מוגנות מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון X-גל, לשטוף פעם עם PBS להסיר פתרון ה-X גל שיורים (אופציונלי) ולהוסיף 4% PFA. </li></ol> 3. ויזואליזציה של תאי גידול גרורתי lacZ מתויג-בCryosections ריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מראש עובש כותרת הטבעה ל1 / 3 עם מדיום הטבעת PolyFreeze מהול. שים את אונת הריאה על גבי ולהתמלא בהטבעה בינונית עד שהאונה מכוסית לגמרי. נסה למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הריאות המשובצות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז להקפיא את הריאות המשובצות לאט בתערובת של קרח יבש וIsopentane ולאחסן ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך מיקרומטר cryo 7-10קטעים על cryostat ולעגן אותן בשקופיות מיקרוסקופ SuperFrostPlus. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הסעיפים מייד עם פתרון מכתים X-גל על ​​37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות בתא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות ב2 פעמי PBS למשך 5 דקות ולאחר מכן לזמן קצר במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counter-הכתם אדום במהירות גרעינית ל10-30 שניות, לשטוף במים מזוקקים ולעגן את השקופיות עם Immu-הר. </li></ol> 4. נציג תוצאות Asai et al. דיווח במאמר המקורי על מודל דאן נגזר-OS LM8 העכבר שגידולי sc עיקריים הנגזרים מתאי דאן ההורים, שונים מאלה הנגזרים משורת התאים גרורתי מאוד LM8 משנה, לא באופן ספונטני בצורת גרורות בריאות בגילוי עכברי syngeneic C3H 14. עם טכניקות כאן שדווחו, אנו reinvestigated ההיווצרות של גרורות בDunn/LM8 מודלי OS עכבר. נצלנו היציב דאן lacZ-transduced וLM8 תאשל ושל פרוטוקול לזלוף באתרו ריאות וקיבעון בעכברים. תמונות מייצגות של ריאות perfused ולא perfused של עכברים שהוזרקו תת עורית עם lacZ-transduced ולא transduced השליטה דאן וLM8 תאים מוצגים באיור 1. בעכברים הוזרקו תאי בקרת דאן, גרורות מאקרוסקופיים ומיקרוסקופיות נותרו בלתי ניתנות לגילוי בריאות הלא perfused וperfused (איור 1 א, I-IV). אבל, באופן מעניין, בעכברים הוזרקו תאי דאן-lacZ, כתמי X-gal חשפו micrometastatic מוקדים כחולים של תאים בודדים או באשכולות של תאים קטנים (&lt;0.1 מ&quot;מ) על פני השטח של ריאות שאינן perfused (איור 1 א, ו). ב זלוף וקיבעון אתר של ריאות נוספות שפרו את יכולת הגילוי של דאן-lacZ micrometastases (איור 1 א, ח). עם זאת, תולדה למוקדים מקרוסקופית לא נצפתה (איור 1 א, נ, ז). &lt;/ P&gt; בעכברים שהוזרקו עם LM8 תאי בקרה, שקופים למחצה, בקושי נראה macrometastatic מוקדים גדולים מ -0.1 מ&quot;מ בקוטר הוכרו ריאות הלא perfused (האיור 1B, ט). הטפטוף של הריאות (האיור 1B, ג) לא שפר את זיהוי של המוקדים. עם זאת, בעכברים שהוזרק תאים מרובים LM8-X-lacZ גל מוכתם כחול מאקרו-(התרשים 1B, v) וmicrometastases (האיור 1B, ו) התגלו על פני השטח של איברים שאינם perfused. יתר על כן, זלוף של ריאות נוספות שפר את יכולת הגילוי של מקרו וmicrometastases (האיור 1B, ז - ח). כתוצאה מכך, מייקרו וmacrometastases הפך גלוי בצפיפות גבוהה יותר ומספר גדול יותר, בעיקר בשל השקיפות של רקמת perfused שבמוקדים מתחת לפני שטח האיבר הפכו גם גלויים. שעות נוספותניתוח istological באמצעות cryosections של רקמת ריאה אשר detectability המשופרת של גרורות בריאות בעכברים שהוזרקו עם דאן lacZ-transduced וLM8 תאים. בעכברים עם גידולים ראשוניים מקורם דאן-lacZ או תאי LM8-lacZ, שלא כמו בעכברים עם גידולים ראשוניים של תאי בהתאמה בקרה, micrometastases או תא מוקדים אפילו אחת הוכרו בסעיפי ריאה (איור 2). יתר על כן, היו גם יותר macrometastases נראה בבירור בעכברים הוזרקו תאי LM8-lacZ מאשר בבעלי חיים הוזרקו שליטת LM8 תאים (איור 2 ג, ד). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> איור 1. איתור של גרורות ספונטניות של הלא transduced (I-IV) וlacZ-transduced (V-VIII) דאן () וLM8 (ב &#39;) בתאים שאינם perfused (I, II, VI, V) וperfused (ג, ד, ז, ח) ריאות בעכברי C3H. גרורות בנציג X-גלאון staריאות לעצמה שלמה (v, ז בA ו-B) והתקריבים מתאימים (VI, VIII בA ו-B) נראה כחול. Macrometastatic המוקדים (&gt; 0.1 מ&quot;מ) באיברים של עכברים שהוזרקו עם LM8 תאים שאינם מתויגים-(I-IV בבוקר) מסומנים בכוכביות. אזור שמוצג בצילומי תקריב הוא נציג לריאות שלמות. ברים בקנה מידה של 1 מ&quot;מ מצביעים בתמונות של ריאות שלמות ו0.1 מ&quot;מ בתקריב. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> איור 2. איתור של דאן וLM8 micrometastases בcryosections ריאה. קטעי רקמת ריאה מוטבע אוקטובר הודגרו בפתרון מכתים X-גל על ​​37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות בתא ולאחר מכן humidified counterstained באדום מהר גרעיני. חיצים מצביעים על micrometastatic המוקדים המוכרים בחלקי ריאות של עכברים שהוזרקו עם דאן-lacZ (B) או תאי LM8-lacZ (ד &#39;). Micrometastases נשאר בלתי ניתן לגילוי בסעיפי ריאות של עכברים שהוזרקו עם דאן אינו transduced () או LM8 תאים (C). ברי קנה מידה מצביעים 0.1 מ&quot;מ.

<ol>
	<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+mouse+cancer+models.">Maximizing mouse cancer models.</a> Nature. 7, 645-658 (2007).</li><li>Coussens, L. M., Fingleton, B., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+inhibitors+and+cancer:+trials+and+tribulations.">Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations.</a> Science (New York, N.Y.). 295, 2387-2392 (2002).</li><li>Fass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+cancer:+a+review.">Imaging and cancer: a review.</a> Mol Oncol. 2, 115-152 (2008).</li><li>Puaux, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+imaging+techniques+to+monitor+tumor+growth+and+cancer+progression+in+living+animals.">A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals.</a> Int. J. Mol. Imaging. 2011, 321538 (2011).</li><li>Malek, A., Catapano, C. V., Czubayko, F., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+polymerase+chain+reaction-based+method+for+detection+and+quantification+of+metastasis+in+human+xenograft+mouse+models.">A sensitive polymerase chain reaction-based method for detection and quantification of metastasis in human xenograft mouse models.</a> Clinical &#38; experimental metastasis. 27, 261-271 (2010).</li><li>Schmidt, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spontaneous+metastasis+in+an+aggressive+breast+carcinoma+model+using+flow+cytometry.">Characterization of spontaneous metastasis in an aggressive breast carcinoma model using flow cytometry.</a> Clinical &#38; experimental metastasis. 17, 537-544 (1999).</li><li>Horwitz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+for+Cytochemical+Demonstration+of+Enzyme+Activity.+I.+Some+Substituted+3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides.">Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some Substituted 3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides.</a> J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).</li><li>Kruger, A., Schirrmacher, V., Khokha, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+lacZ+gene:+an+important+tool+for+metastasis+research+and+evaluation+of+new+cancer+therapies.">The bacterial lacZ gene: an important tool for metastasis research and evaluation of new cancer therapies.</a> Cancer metastasis reviews. 17, 285-294 (1998).</li><li>Arlt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+gelatinase-specificity+of+matrix+metalloproteinase+inhibitors+correlates+with+antimetastatic+efficacy+in+a+T-cell+lymphoma+model.">Increase in gelatinase-specificity of matrix metalloproteinase inhibitors correlates with antimetastatic efficacy in a T-cell lymphoma model.</a> Cancer research. 62, 5543-5550 (2002).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+inhibition+of+intra-peritoneal+tumor+growth+and+dissemination+of+human+ovarian+carcinoma+cells+in+nude+mice+by+anti-L1-cell+adhesion+molecule+monoclonal+antibody+treatment.">Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment.</a> Cancer research. 66, 936-943 (2006).</li><li>Banke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+inhibition+of+experimental+metastasis+and+prolongation+of+survival+in+mice+by+a+potent+factor+Xa-specific+synthetic+serine+protease+inhibitor+with+weak+anticoagulant+activity.">Effective inhibition of experimental metastasis and prolongation of survival in mice by a potent factor Xa-specific synthetic serine protease inhibitor with weak anticoagulant activity.</a> Thrombosis and haemostasis. 94, 1084-1093 (2005).</li><li>Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+and+cancer+revisited:+mechanistic+connections+involving+platelets,+P-selectin,+carcinoma+mucins,+and+tumor+metastasis.">Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3352-3357 (2001).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LacZ+transgene+expression+in+the+subcutaneous+Dunn/LM8+osteosarcoma+mouse+model+allows+for+the+identification+of+micrometastasis.">LacZ transgene expression in the subcutaneous Dunn/LM8 osteosarcoma mouse model allows for the identification of micrometastasis.</a> J. Orthop. Res. 29, 938-946 (2011).</li><li>Asai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+murine+osteosarcoma+cell+line+(LM8)+with+high+metastatic+potential+to+the+lung.">Establishment and characterization of a murine osteosarcoma cell line (LM8) with high metastatic potential to the lung.</a> International journal of cancer. 76, 418-422 (1998).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antineoplastic+antibiotic+taurolidine+promotes+lung+and+liver+metastasis+in+two+syngeneic+osteosarcoma+mouse+models+and+exhibits+severe+liver+toxicity.">The antineoplastic antibiotic taurolidine promotes lung and liver metastasis in two syngeneic osteosarcoma mouse models and exhibits severe liver toxicity.</a> International journal of cancer. , (2011).</li><li>Steinmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimetastatic+activity+of+honokiol+in+osteosarcoma.">Antimetastatic activity of honokiol in osteosarcoma.</a> Cancer. , (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

התוצאות שהוצגו כאן במודל עכבר Dunn/LM8 OS להדגים את כוחה של השיטה החדשה שהוקמה שמשלבת מכתים X-הגל של תאים סרטניים lacZ מתויג-עם זלוף באתרו / קיבוע של רקמת ריאה. זה שילוב של שתי הטכניקות מאפשר גילוי רגישות גבוהה של נגעי micrometastatic עד לרמת התא הבודדה ומשפר גם את ההדמיה של macrometastases על פני הריאות (איור 1), כמו גם בחלקי ריאה (איור 2). בעוד מכתים X-הגל גם מאפשר זיהוי של גרורות (מייקרו) באיברים אחרים, זלוף באתרו / קיבעון משפר את יכולת הגילוי של גרורת מוקדים ברקמות אחרות מאשר הריאה רק במעט בגלל צבע דם ורקמות הקשורה הטבעי 13 איברים אלה. גם אם זלוף מופנה לאיבר אחר, כגון הכבד, הסרת הדם הייתי חלקי בלבד לשפר את הימור הניגודמכתים Ween X-גל והצבע הטבעי של האיבר. עם זאת, השיטה ישימה לכל סוג של lacZ בתיוג תאים סרטניים, באופן דרמטי לשפר את יכולת הגילוי של גרורות ריאות עד לרמה של micrometastases הרדום תא בודד ומאפשר כימות קלה ואמינה של מאקרו וmicrometastases. מגבלה של שיטה זו ואת כל טכניקות האחרות המבוססות על גנים מדווחים, כוללים חלבוני וציפראז וניאון, היא היציבות של ביטוי transgene. כפי שמוצג באיור 2, שלא כל התאים הסרטניים בתוך macrometastatic המוקדים מוכתמים כחול, המעיד על חוסר הפעילות בטא גלקטוזידאז. זה יכול להיות קשור לנימק, אבל זה סביר יותר עקב אובדן ביטוי transgene. הבחנו כי דאן וLM8 התאים יעילים מאוד במורד הוויסות של lacZ ומושתל אחרים גם בבחירה מתמדת לביטוי. לכן החלפנו במחקרים שנעשה לאחרונה לK12 העכבריוK7M2 והוז, 143B האדם וSaOS-2 קווים סלולריים, סרטן העצמות שנשמרה כל ביטוי lacZ יציב במבחנה, כמו גם in vivo עד 100% לאורך זמן. ברגע lacZ ביטוי יציב מובטח, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת במחקרים בתאים סרטניים מניפולציות גנטיות, למשל מכניסטי לחקור את התהליך של קולוניזציה הרקמה 13, כמו גם לפיתוח והבדיקה של טיפולים החדשים שמטרתה מיגור הגרורות 15 , 16. יתר על כן, הוא יכול לשמש כאמת מידה לשיפור טכניקות נוכחיות רדיולוגיות הדמיה, כגון PET, (מייקרו) CT ו-MRI, המשמשות לגילוי מוקדם של גרורות. במחקר PET האחרון (לא פורסם) עם קליעים נותבים שונים שאומתו בריאה זוהתה vivo גרורות vivo מכן לשעבר עם הפרוטוקול המתואר. במחקר מתמשך עם חיה קטנה חדשה מייקרו-CT (SkyScan) אנחנו כל כך הרבה able לזהות גרורות בריאות בvivo עד גודל של 0.5 מ&quot;מ וvivo לשעבר עד 0.3 מ&quot;מ, אך אנו שואפים ברזולוציה של 0.1 מ&quot;מ. מעניין, זה הוא מגבלת הגודל שאנו קובעים להבחין המאקרו מmicrometastases עם השיטה המשולבת של זלוף באתר ומכתים X-גל. זה מדגיש שוב את הרגישות והתועלת של טכניקה קלה וחסכונית זו.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Narketan10 (קטמין) </td><td> Vétoquinol AG </td><td></td><td> 100 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון </td></tr><tr><td> Xylazin (xylazine) </td><td> Streuli פארמה AG </td><td></td><td> 20 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון </td></tr><tr><td> Prequilan (acepromazine) </td><td> Fatro SpA </td><td></td><td> 10 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון </td></tr><tr><td> בולדוג סוג Serrefine מהדק כלי דם </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 18051-35 </td><td> , 35 מ&quot;מ מעוגל </td></tr><tr><td> כוס פלסטיק עם מכסה </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> 25 מיליליטר כוסות עם מכסים </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-כלורו-3-β-indolyl-D-galactoside (X-גל); אבקה </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> מתמוסס בN, N-Di-methylformamide עד 40 מ&quot;ג / מ&quot;ל, חנות אור המוגן ב -20 ° C </td></tr><tr><td> פתרון בסיסי מכתים, מתאזן ל-pH 7.1, מאוחסן אור המוגן ב 4 ° C למקסימום. 1 חודש </td><td> מתוצרת עצמית </td><td></td><td> 100 10xPBS מ&quot;ל / ליטר, 1.64 גר &#39;/ ל&#39; K3Fe (CN) 6, 2.1 גר &#39;/ ל&#39; K4Fe (CN) 6, 2 מ&quot;ל / ליטר MgCl2 1M, 2 10% מ&quot;ל / L NP40, 1 מ&quot;ל / L 10% נתרן Deoxycholate </td></tr><tr><td> בינוני הטבעת PolyFreeze </td><td> Polysciences; מפיץ שויצרי: רונשוויג </td><td> 19636-1 </td><td></td></tr><tr><td> הטבעה של עובש </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> יקה CM1850 cryostat </td><td> Microsystems היקה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> שקופיות SuperFrost </td><td> מנזל </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> פתרון אלומיניום סולפט - גרעיני-Fast אדום </td><td> חטיבת Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> Immu-הר </td><td> Thermo Electron, מפיץ שויצרי: Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלת 1. ריאגנטים וציוד.

improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and x-gal staining of lacz-tagged tumor cells

גרורות הן סיבת מוות העיקרי ברוב סוגי הסרטן, ולכן התמקדות עיקרית בחקר הסרטן. עם זאת, זיהוי של micrometastases ידי radiologic הדמיה וההצלחה במיגור הטיפולי שלהם יישאר מוגבל. בעוד מודלים של בעלי חיים הוכיחו להיות כלי רב ערך עבור סרטן 1 מחקר, הניטור / ההדמיה של micrometastases עדיין מהווה אתגר והערכה מדויקת של התפשטות גרורה במחקרים פרה פוטנציאלי מוביל לתוצאות מאכזבות בניסויים קליניים 2. כתוצאה מכך, יש עניין רב בשיטות זיקוק לבסוף לאפשר זיהוי לשעתק ואמין של גרורות עד לרמת התא הבודדה ברקמה נורמלית. ההתמקדות העיקרית לכן היא על טכניקות, המאפשרים זיהוי של תאים סרטניים בגוף חי, כמו מייקרו טומוגרפיה ממוחשבת (CT מייקרו), טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), פליטת אור או דימות פלואורסצנטי &lt;sup&gt; 3,4. כרגע אנחנו ייעול שיטות אלה לניטור vivo של גידול ראשוני וגידול בגרורות סרטן עצמות מודלים שונים. כמה טכניקות אלו יכולות גם לשמש לניתוח vivo לשעבר של גרורות לצד שיטות קלסיות כמו qPCR 5, 6 FACS או סוגים שונים של צביעה היסטולוגית. כאמת מידה, הקים במחקר הנוכחי transfection או התמרה של תאים סרטניים עם גן lacZ היציב קידוד חיידקי אנזים β-גלקטוזידאז שחילוף חומרי מצע chromogenic 5-4-כלורו-3-indolyl-beta-D bromo -Galactopyranoside (X-גל) לכחול וסגול, 7 צבע מסיס ומאפשר את הצביעה רגישה מאוד סלקטיבית histochemical הכחולה של תאים סרטניים ברקמת vivo לשעבר עכבר לרמת התא הבודדה, כפי שמוצג כאן. זהו כלי עלות נמוכה ולא ציוד אינטנסיבי, המאפשר אימות מדויקת של גרורות 8 במחקרי ההערכה חדשהטיפולי ticancer 9-11. גורם מגביל של מכתים X-gal הוא ניגודיות הנמוכה לדוגמא כתמי דם אדומים הקשורה ברקמות כלי דם כן. ברקמת ריאת בעיה זו יכולה להיפתר על ידי זלוף ריאות באתרו, טכניקה שהוקמה לאחרונה על ידי Borsig et al. Perfused 12 שריאות של עכברים תחת הרדמה כדי לנקות אותם מהדם ולתקן ולהטמיע אותם באתרו תחת אינפלציה דרך קנה הנשימה. שיטה זו מונעת גם הקריסה של ריאות ובכך שומרת על המורפולוגיה של הריאות alveoli הפונקציונלי, אשר משפר את האיכות של הרקמות לניתוח היסטולוגית. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול חדש, שמנצל את היתרון של שילוב של כתמי X-גל של lacZ-להביע תאים סרטניים ובאתרו זלוף וקיבוע של רקמת ריאה. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מעודן רגישות גבוהה של תאים גרורתי בודדים בריאה ואפשר לנו בשנים האחרונה במחקר לדetect micrometastases &quot;הרדום&quot; ריאה במודל עכבר 13, שתואר במקור להיות שאינם גרורתי 14.

Watch this Scientific Journal Video about Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tum

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

פרוטוקול הרומן שדווח במחקר הנוכחי מאפשר איתור סלקטיבי של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי שילוב<em&gt; באתרו</em&gt; זלוף ריאות וקיבעון וX-גל הכתמה של<em&gt; LacZ</em&gt; מתויג תאים סרטניים.

ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב<em&gt; באתרו</em&gt; זלוף של רקמת ריאה וכתמי X-גל של<em&gt; LacZ</emגידול תאים&gt; תייג-

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

improved-visualization-lung-metastases-at-single-cell-resolution-mice

Google

Research

JoVE Journal

Medicine

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

17.2K Views.  Balgrist University Hospital, Zurich. פרוטוקול הרומן שדווח במחקר הנוכחי מאפשר איתור סלקטיבי של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי שילוב באתרו זלוף ריאות וקיבעון וX-גל הכתמה של LacZ מתויג תאים סרטניים.

Video: Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. As this technology expands and improves, the ability to potentially evaluate and improve the quality of substandard lungs prior to transplant is a critical need. In order to more rigorously evaluate these approaches, a reproducible animal model needs to be established that would allow for testing of improved techniques and management of the donated lungs as well as to the lung-transplant recipient. In addition, an EVLP animal model of associated pathologies, e.g., ventilation induced lung injury (VILI), would provide a novel method to evaluate treatments for these pathologies. Here, we describe the development of a rat EVLP lung program and refinements to this method that allow for a reproducible model for future expansion. We also describe the application of this EVLP system to model VILI in rat lungs. The goal is to provide the research community with key information and &#8220;pearls of wisdom&#8221;/techniques that arose from trial and error and are critical to establishing an EVLP system that is robust and reproducible.

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. Here, we describe the development of a rat EVLP program and refinements that allow for a reproducible model for future expansion.

שיטה של ​​מבודד<em&gt; Ex Vivo</em&gt; ריאות זלוף במודל עכברוש: ​​לקחים מפיתוח תכנית EVLP עכברוש

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute respiratory distress syndrome (ARDS), characterized by neutrophilic alveolitis, and injury to both alveolar epithelium and vascular endothelium. Clinically, ARDS is defined by acute onset of hypoxemia, bilateral patchy pulmonary infiltrates and non-cardiogenic pulmonary edema. Human studies have provided us with valuable information about the physiological and inflammatory changes in the lung caused by ARDS, which has led to various hypotheses about the underling mechanisms. Unfortunately, difficulties determining the etiology of ARDS, as well as a wide range of pathophysiology have resulted in a lack of critical information that could be useful in developing therapeutic strategies.
Translational animal models are valuable when their pathogenesis and pathophysiology accurately reproduce a concept proven in both in vitro and clinical settings. Although large animal models (e.g., sheep) share characteristics of the anatomy of human trachea-bronchial tree, murine models provide a host of other advantages including: low cost; short reproductive cycle lending itself to greater data acquisition; a well understood immunologic system; and a well characterized genome leading to the availability of a variety of gene deletion and transgenic strains. A robust model of low pH induced ARDS requires a murine ALI that targets mainly the alveolar epithelium, secondarily the vascular endothelium, as well as the small airways leading to the alveoli. Furthermore, a reproducible injury with wide differences between different injurious and non-injurious insults is important.
The murine gastric acid aspiration model presented here using hydrochloric acid employs an open tracheostomy and recreates a pathogenic scenario that reproduces the low pH pneumonitis injury in humans. Additionally, this model can be used to examine interaction of a low pH insult with other pulmonary injurious entities (e.g., food particles, pathogenic bacteria).

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

להרחיב הנשמת קיבת חומצה שאיפת Murine הדגם של פגיעה החריפה ריאות תוצאות ב מקסימלי חריפה קטלנית פגיעת ריאות

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) used as 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) represent an elegant and biologically highly relevant 3D cell culture model, which highly resemble in situ tissue due to their complexity, biomechanics and molecular composition. Tissue slicing is widely applied in various animal models. 3D-LTCs derived from human PCLS can be used to analyze responses to novel drugs, which might further help to better understand the mechanisms and functional effects of drugs in human tissue. The preparation of PCLS from surgically resected lung tissue samples of patients, who experienced lung lobectomy, increases the accessibility of diseased and peritumoral tissue. Here, we describe a detailed protocol for the generation of human PCLS from surgically resected soft-elastic patient lung tissue. Agarose was introduced into the bronchoalveolar space of the resectates, thus preserving lung structure and increasing the tissue&#39;s stiffness, which is crucial for subsequent slicing. 500 &#181;m thick slices were prepared from the tissue block with a vibratome. Biopsy punches taken from PCLS ensure comparable tissue sample sizes and further increase the amount of tissue samples. The generated lung tissue cultures can be applied in a variety of studies in human lung biology, including the pathophysiology and mechanisms of different diseases, such as fibrotic processes at its best at (sub-)cellular levels. The highest benefit of the 3D-LTC ex vivo model is its close representation of the in situ human lung in respect of 3D tissue architecture, cell type diversity and lung anatomy as well as the potential for assessment of tissue from individual patients, which is relevant to further develop novel strategies for precision medicine.

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Here, we present a protocol for the preparation of agarose-filled human precision-cut lung slices from resected patient tissue that are suitable for generating 3D lung tissue cultures to model human lung diseases in biological and biomedical studies.

דור של תרבויות רקמות אמבריולוגיה תלת-ממד (3D-LTCs) עבור מידול המחלה

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

ניתוח כמותי של הרכב הסלולר בנגעים טרשת עורקים מתקדמת של שריר חלק תא שושלת היוחסין-עקיבה עכברים

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

גרימת פציעה חריפה של הריאה בעכברים על ידי הישירה ליפופוליסכראסטיליאלגרלציה

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: Evaluation of Lung Function and Metabolism

Lung transplantation (LTx) remains the standard of care for end-stage lung disease. A shortage of suitable donor organs and concerns over donor organ quality exacerbated by excessive geographic transportation distance and stringent donor organ acceptance criteria pose limitations to current LTx efforts. Ex situ lung perfusion (ESLP) is an innovative technology that has shown promise in attenuating these limitations. The physiologic ventilation and perfusion of the lungs outside of the inflammatory milieu of the donor body affords ESLP several advantages over traditional cold static preservation (CSP). There is evidence that negative pressure ventilation (NPV) ESLP is superior to positive pressure ventilation (PPV) ESLP, with PPV inducing more significant ventilator-induced lung injury, pro-inflammatory cytokine production, pulmonary edema, and bullae formation. The NPV advantage is perhaps due to the homogenous distribution of intrathoracic pressure across the entire lung surface. The clinical safety and feasibility of a custom NPV-ESLP device have been demonstrated in a recent clinical trial involving extender criteria donor (ECD) human lungs. Herein, the use of this custom device is described in a juvenile porcine model of normothermic NPV-ESLP over a 12 h duration, paying particular attention to management techniques. Pre-surgical preparation, including ESLP software initialization, priming, and de-airing of the ESLP circuit, and the addition of anti-thrombotic, anti-microbial, and anti-inflammatory agents, is specified. The intraoperative techniques of central line insertion, lung biopsy, exsanguination, blood collection, cardiectomy, and pneumonectomy are described. Furthermore, particular focus is paid to anesthetic considerations, with anesthesia induction, maintenance, and dynamic modifications outlined. The protocol also specifies the custom device's initialization, maintenance, and termination of perfusion and ventilation. Dynamic organ management techniques, including alterations in ventilation and metabolic parameters to optimize organ function, are thoroughly described. Finally, the physiological and metabolic assessment of lung function is characterized and depicted in the representative results.

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: Evaluation of Lung Function and Metabolism

This paper describes a porcine model of negative pressure ventilation ex situ lung perfusion, including procurement, attachment, and management on the custom-made platform. Focus is made on anesthetic and surgical techniques, as well as troubleshooting.

אוורור לחץ שלילי נורממי זילוח ריאות Ex Situ : הערכת תפקוד הריאות וחילוף החומרים

Lung transplantation (LTx) remains the standard of care for end-stage lung disease. A shortage of suitable donor organs and concerns over donor organ ...

Lung Rapid Recovery Procurement Combined with Abdominal Normothermic Regional Perfusion in Controlled Donation after Circulatory Death

Controlled donation after circulatory death (cDCD) has contributed to increasing donor numbers all over the world. Experiences published in the last years confirm that the outcomes after lung transplantation from cDCD are similar to those from brain death donors; however, the utilization of lungs from asystole donors remains low. Several reasons may be involved: different legal frameworks among countries and centers with different premortem interventions, inadequate lung donor care before procurement, or even poor experience with cDCD procedures and protocols.
Initially, the rapid recovery technique was commonly employed for the procurement of thoracic and abdominal organs in cDCD, but, in the last decade, abdominal normothermic regional perfusion (ANRP) with extracorporeal membrane oxygenation devices has become a useful method to restore blood flow to abdominal organs, allowing their quality improvement and their functional assessment prior to transplantation. This makes the donation procedure more complex and generates doubts about injury to the grafts due to dual temperature.
The aim of this article is to describe a protocol based on a single center experience with Maastricht III donors combining lung cooling rapid recovery in the thorax and abdominal normothermic regional perfusion. Tips and tricks focused on premortem interventions and lung procurement procedure techniques are explained. This may help to minimize the reluctance among professionals to use this combined technique and encourage other donor centers to use it, despite the increased complexity of the procedure.

The protocol combines a lung cooling rapid recovery technique with abdominal normothermic regional perfusion for abdominal graft procurement in controlled asystole donors, which is a safe and useful method to expand the donor pool.

רכש התאוששות ריאה מהירה בשילוב עם זילוח אזורי נורמום בטני בתרומה מבוקרת לאחר מוות במחזור הדם

Controlled donation after circulatory death (cDCD) has contributed to increasing donor numbers all over the world. Experiences published in the last years ...

הדמיית ריאות חדשנית באמצעות קטעי ויברטום משובצים באגרוז

Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural support for sectioning, pieces of lung tissue are commonly embedded in paraffin or OCT compound and cut with a microtome or cryostat, respectively. A more recent technique, known as precision-cut lung slices, adds structural support to fresh lung tissue through agarose infiltration and provides a platform to maintain primary lung tissue in culture. However, due to epitope masking and tissue distortion, none of these techniques adequately lend themselves to the development of reproducible advanced light imaging readouts that would be compatible across multiple antibodies and species. 
To this end, we have developed a tissue-processing pipeline, which utilizes agarose embedding of fixed lung tissue, coupled to automated vibratome sectioning. This facilitated the generation of lung sections from 200 &#181;m to 70 &#181;m thick, in mouse, pig, and human lungs, which require no antigen retrieval, and represent the least "processed" version of the native isolated tissue. Using these slices, we reveal a multiplex imaging readout capable of generating high-resolution images whose spatial protein expression can be used to quantify and better understand the mechanisms underlying lung injury and regeneration.

Author Spotlight: חקר ביטוי חלבונים מרחביים באמצעות מקטעי רקמת ריאה משובצים באגרוז 

We have developed a tissue-processing technique utilizing a vibratome and agarose-embedded lung tissue to generate lung sections, thereby permitting the acquisition of high-resolution images of lung architecture. We employed immunofluorescence staining to observe spatial protein expression using specific lung structural markers.

חתך ויברטומי אוטומטי של רקמת ריאה משובצת אגרוז להדמיית פלואורסצנטיות מרובת משתתפים

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural ...