DCH, MB וFK נתמכו על ידי מעקב EPSRC על קרן. BL-V וDS היו כל נתמך על ידי תעודת סטודנט לתואר שלישי MRC. KC נתמכה על ידי מימון מבריטניה רפואת רגנרטיבית הפלטפורמה.

.1 סינתזה של PHNGAD (פולי [1,6-hexanodiol / neopentyl גליקול / די (אתילן גליקול) חומצת -alt-adipic] דיאול) <img alt="תכנית 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme1.jpg" width="500" /> 1 תכנית: סינתזה של PHNAGD ייצוג סכמטי של הסינתזה של PHNAGD.. PHNAGD הוכן על ידי התגובה של 1,6-Hexanodiol, גליקול דיאטילן, גליקול neoppentyl וחומצת adipic. PHNAGD, פולי [1,6-hexanodiol / neopentyl גליקול / די (אתילן גליקול) החומצה -alt-adipic] דיאול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל טיפול בחום למונומרים 1,6-hexanediol, di (אתילן גליקול) וגליקול neopentyl ב40 מעלות צלזיוס למשך 48 שעה בתנור ואקום כדי להסיר כל שאריות מים. לאפשר לקור עד לRT תחת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 22 mmol של כל מונומר וחומצת adipic (55 mmol) לבקבוק תחתון עגול שני צוואר מצויד בבר עורר ומחובר למנגנון דיקן-סטארק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את כל ההרכבה תחת ואקום ובעדינות לחמם את glassware בC ° 40 ל6 שעות, כדי להימנע מכל ספיגת לחות במהלך התוספת של החומר הכימי לתוך הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף דרך מזרק, טיפה אחרת טיפה, 0.0055 mol של טיטניום הזרז (IV) butoxide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תערובת התגובה ב180 ° C, תחת אווירת N 2 ל24 שעות, ולאסוף שאריות מים במלכודת הדיקן-סטארק. אפשר למוצר להתקרר לRT. </li></ol> .2 סינתזה של PU134 <img alt="תכנית 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme2.jpg" width="500" /> תכנית 2: סינתזה של PU134 ייצוג סכמטי של הסינתזה של פוליאוריטן 134. PU134 הוכנה על ידי התגובה של 1.0 equiv של PHNGAD עם 2.0 equiv של 4,4&#39;-Methylenebis (isocyanate פניל), ואחריו התוספת של 1.0. equiv של מאריך שרשרת 1,4-butanediol. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים מקבילה של PHNGAD polyol אחד (Mn ~ 1,800 Da, 3.2 mmol) עם שני שווה של 4&quot;4-Methylenebis (isocyanate פניל) (6.4 מילימול) בN נטול מים, N -Dimethylformamide (12 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תערובת התגובה על 70 מעלות צלזיוס, תחת אווירת N 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף דרך מזרק, טיפה אחרת טיפת טיטניום הזרז butoxide (WT 0.8%) (IV). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, להוסיף שווה ערך אחד מאריך שרשרת 1,4-butanediol (3.2 מילימול). להעלות את הטמפרטורה ב90 ° C ומערבבים ל24 שעות תחת אווירת N 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התגובה, לאסוף פוליאוריטן על ידי משקעים על ידי הוספת אתר diethyl (הקסאן או מים יכולים לשמש גם) שחרר חכם לפתרון התגובה עד הממטרים מתרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הפתרון ב5,300 XG למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant ולהתנגב ב40 מעלות צלזיוס בתנור ואקום עד מתאדה הממס. שים לב: על מנת להבטיח כי המוצר הסופי של התגובה יש את הפרמטרים הנכונים בנוגע לחלוקת המשקל המולקולרית, grou הפונקציונליps של הפולימר, וטמפרטורת ההיתוך והמעבר זכוכית, ניתן להשתמש בטכניקות אנליטיות שונות ושיטות, כגון כרומטוגרפיה חלחול ג&#39;ל או ספקטרוסקופיה פיטר. </li></ol> .3 הכנת פתרונות PU134 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 200 מ&quot;ג של PU134 לתוך בקבוק זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל PU134 לריכוז סופי של 2% במספר הממסים: כלורופורם, שילוב של כלורופורם וטולואן ב1: 1, tetrahydrofuran, ושילוב של tetrahydrofuran וdicloromethane ב1: 1. הערה: בחירתו של הממס הנכון משתנה בהתאם לפולימר לשימוש. ממסים שונים יש נקודות רתיחה שונות שיכול להשפיע על solubilization של הפולימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את הפתרון נמרצות ל20 דקות ב RT באמצעות שייקר במהירות של 200 mot / דקה, עד שהפתרון הופך הומוגנית ולא משקע הוא ציין. </li></ol> .4 ציפוי של זכוכית שקופיות עם PU134 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח ROU15 מ&quot;מ 2 coverslip nd על coater הספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 50 μl של פתרון PU134 לכל באמצעות פיפטה. כוון את עוצמת הקול של פתרון PU134 בהתאם לגודל coverslip נדרש שמירה על הנפח על פני השטח יחסי יחס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין כל coverslip ל7 שניות ב23 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslip האוויר היבש ב RT לפחות 24 שעות לפני העיקור. </li></ol> .5 הקרנה של Coverslip <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Gamma-להקרין coverslip מצופה פולימר על ידי יישום מינון של 10 אפורים באמצעות irradiator מעבדה ל12 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> UV- להקרין coverslip מצופה פולימר באמצעות 30 W, הנורה UV ל16 דקות מכל צד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslip מצופה הפולימר בצלחת תרבית הרקמה מתאימה בהתאם לגודל השקופית. </li></ol> .6 מיקרוסקופית אלקטרונים סורק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslip זהב מעיל פולימר על ידי מקרטעות ל200 שניות באווירה של 5 x 10 -1 מיליבר של לחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללכוד את micrographs של coverslip מצופה הפולימר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק במתח מאיץ של 20 ק במצב שני אלקטרונים הדמיה. </li></ol> .7 תצפיות מיקרוסקופית כוח האטומי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסרוק שטח של 20 x 20 מיקרומטר של משטח הפולימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קצב סריקה מ1.32 הרץ ל1.60 הרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את רזולוציה של 512 x 512 פיקסלים באזור שנסרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את שורש ממוצע ריבוע (RMS או RQ) של הציפוי על ידי שימוש בממוצע של סטיות גובה נלקחו ממטוס נתוני תמונה הממוצע, הביע כ: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq1.jpg" width="123" /> איפה זי הוא ערך Z הנוכחי, וN הוא מספר הנקודות בתוך השטח נתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7.5 חשב את הסטייה או מתכוון חספוס פני השטח (Ra) של התמונה באמצעות, <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq2.jpg" width="154" /> כאשר Z (x) היא הפונקציה שמתארת ​​tהוא משטח הפרופיל מנותח במונחים של גובה (Z) ומיקום (x) של המדגם על פני אורך ההערכה &quot;L&quot;. Ra מייצג את הערך הממוצע של פני השטח ביחס למישור המרכז. </li></ol> .8 תרבות והתמיינות של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות ולבדל את שורת תאי גזע עוברית (hESC) H9 האנושי כפי שמתואר בHay 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את התאים באמצעות מגיב ניתוק וreplate על גבי שקופיות מצופים PU134 ביום 9 של תהליך ההתמיינות, בנוכחותו של מדיום סרום ללא כלתאר בSzkolnicka 18,19. הערה: השימוש בתא דיסוציאציה האנזימטית הוא מועדף לניתוק תא פיזי. </li></ol> .9 ציטוכרום P450 Assay פונקציונלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את פעילות CYP3A הבאה הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה hepatocytes hESC נגזר ביום 13 או יום 19, ותקשורת ללא תאים - כביקורת שלילית, עם substr המתאיםאכלתי במשך 5 שעות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף supernatants מהתאים ותקשורת, לבצע את assay לפי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את רמת פעילות CYP והיחסי מנורמלים לשטח הפנים (2 סנטימטר). </li></ol> 10. Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף hESC נגזר hepatocytes עם PBS, 1 דקות, חוזר שתי פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת מתנול קרח קר 100% לתקן תאים, מקום ב-20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם PBS במשך 5 דקות וחזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם PBS / BSA / 10% עבור שעה 1 ב RT T (tween 0.1%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון PBST ולהוסיף הנוגדן הראשוני המתאים מדולל PBS / BSA / 1% T (tween 0.1%), דגירה על 4 מעלות צלזיוס עם O תסיסה עדין / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם PBS / BSA / 1% T (tween 0.1%) במשך 5 דקות ולחזור על שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנוגדן המתאים בPBS / BSA / 1% T (tween 0.1%), להוסיף לתאי דגירה בחושך בRT עבור שעה 1 עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם PBS במשך 5 דקות ולחזור על שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת Mowiol 488 (המכיל 1 DAPI: 1,000) זה טוב, להוסיף coverslip בעדינות כדי להפחית את מספר בועות אוויר. חנות קבועה תאים על 4 מעלות צלזיוס בחושך. שים לב מכתים באמצעות מיקרוסקופ עם מסנן מתאים ומנורת ניאון. הנוגדנים ראשוניים ומשניים המותאמים מופיעים בטבלה 1. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMOylation+of+HNF4&#945;+regulates+protein+stability+and+hepatocyte+function.">SUMOylation of HNF4&#945; regulates protein stability and hepatocyte function.</a> J Cell Sci. 125 (15), 3630-3635 (2012).</li><li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+hydrogel+modulus+on+the+proliferation+and+differentiation+of+encapsulated+neural+stem+cells.">The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells.</a> Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).</li><li>Shanbhag, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Progenitor+Cells+Grown+on+Hydrogel+Surfaces+Respond+to+the+Product+of+the+Transgene+of+Encapsulated+Genetically+Engineered+Fibroblasts.">Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts.</a> Biomacromolecules. 11 (11), 2936-2943 (2010).</li><li>Battista, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+matrix+composition+of+3D+constructs+on+embryonic+stem+cell+differentiation.">The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 26 (31), 6194-6207 (2005).</li><li>Tian, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+hydrogel+as+Nogo-66+receptor+antibody+delivery+system+for+the+repairing+of+injured+rat+brain:+in+vitro.">Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro.</a> Journal of Controlled Release. 102 (1), 13-22 (2005).</li><li>Keshaw, H., Forbes, A., Day, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+angiogenic+growth+factors+from+cells+encapsulated+in+alginate+beads+with+bioactive+glass.">Release of angiogenic growth factors from cells encapsulated in alginate beads with bioactive glass.</a> Biomaterials. 26 (19), 4171-4179 (2005).</li><li>Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S., Farrokhi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+hepatocytes+in+2D+and+3D+culture+systems+in+vitro.">Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro.</a> The International Journal of Developmental Biology. 50 (7), 645-652 (2006).</li><li>Cameron, K., Travers, P., Chander, C., Buckland, T., Campion, C., Noble, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem/precursor+cells+on+silicate+substituted+calcium+phosphate.">Directed osteogenic differentiation of human mesenchymal stem/precursor cells on silicate substituted calcium phosphate.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (1), 13-22 (2013).</li><li>Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+cellular+morphology+and+biocompatibility+using+polymer+microarrays.">Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays.</a> Biomedical Materials. 3 (3), 034112 (2008).</li><li>Li, Z., Guo, X., Matsushita, S., Guan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+cardiosphere-derived+cells+into+a+mature+cardiac+lineage+using+biodegradable+poly(N-isopropylacrylamide)+hydrogels.">Differentiation of cardiosphere-derived cells into a mature cardiac lineage using biodegradable poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels.</a> Biomaterials. 32 (12), 3220-3232 (2011).</li><li>Tare, R. S., Khan, F., Tourniaire, G., Morgan, S. M., Bradley, M., Oreffo, R. O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microarray+approach+to+the+identification+of+polyurethanes+for+the+isolation+of+human+skeletal+progenitor+cells+and+augmentation+of+skeletal+cell+growth.">A microarray approach to the identification of polyurethanes for the isolation of human skeletal progenitor cells and augmentation of skeletal cell growth.</a> Biomaterials. 30 (6), 1045-1055 (2009).</li><li>Khan, F., Tare, R. S., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+cell+manipulation+and+skeletal+tissue+engineering+using+high-throughput+polymer+blend+formulation+and+microarray+techniques.">Strategies for cell manipulation and skeletal tissue engineering using high-throughput polymer blend formulation and microarray techniques.</a> Biomaterials. 31 (8), 2216-2228 (2010).</li><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thermoresponsive+and+chemically+defined+hydrogel+for+long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells.</a> Nature Communications. 4 (1335), (2013).</li><li>Medine, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+high-fidelity+hepatotoxicity+models+from+pluripotent+stem+cells.">Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+screening+of+polymer+libraries+to+define+novel+substrates+for+functional+hepatocytes+with+inducible+drug+metabolism.">Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism.</a> Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).</li><li>Lucendo-Villarin, B., Khan, F., Pernagallo, S., Bradley, M., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+hepatic+stem+cell+gene+expression+on+biological+and+synthetic+substrata.">Maintaining hepatic stem cell gene expression on biological and synthetic substrata.</a> BioResearch Open Access. 1 (1), 50-53 (2012).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (34), 12301-12306 (2008).</li><li>Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell&#8211;Derived+Hepatocytes:+Potential+and+Challenges+in+Pharmacology.">Pluripotent Stem Cell&#8211;Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology.</a> Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+prediction+of+drug-induced+liver+injury+using+stem+cell-derived+populations.">Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).</li><li>Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cell+Populations.">Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations.</a> Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).</li><li>Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+organized+cell+communities.">Culture of organized cell communities.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 33 (1-2), 15-30 (1998).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Vitronectin+Is+a+Functionally+Defined+Substrate+That+Supports+Human+Embryonic+Stem+Cell+Self-Renewal+via+&#945;V&#946;5+Integrin.">Recombinant Vitronectin Is a Functionally Defined Substrate That Supports Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal via &#945;V&#946;5 Integrin.</a> Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521/E-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment.">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5 (3195), (2014).</li><li>Thaburet, J. -. F. O., Mizomoto, H., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Evaluation+of+the+Wettability+of+Polymer+Libraries.">High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries.</a> Macromolecular Rapid Communication. 25 (1), 336-370 (2003).</li><li>Lim, J. Y., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Sensing+and+Response+to+Micro-+and+Nanostructured+Surfaces+Produced+by+Chemical+and+Topographic+Patterning.">Cell Sensing and Response to Micro- and Nanostructured Surfaces Produced by Chemical and Topographic Patterning.</a> Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).</li><li>Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+contact+guidance+on+well-defined+micro-+and+nanostructured+substrates.">Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates.</a> Journal of Cell Science. 116 (10), 1881-1892 (2003).</li><li>Biggs, M. J. P., Richards, R. G., Wilkinson, C. D. W., Dalby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+interactions+with+topographical+structures:+a+novel+method+for+immuno-SEM+labelling+of+focal+adhesions+in+S-phase+cells.">Focal adhesion interactions with topographical structures: a novel method for immuno-SEM labelling of focal adhesions in S-phase cells.</a> Journal of Microscopy. 231 (1), 28-37 (2008).</li><li>Karuri, N. W., Porri, T. J., Albrecht, R. M., Murphy, C. J., Nealey, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-+and+microscale+holes+modulate+cell-substrate+adhesion,+cytoskeletal+organization,+and+-beta1+integrin+localization+in+SV40+human+corneal+epithelial+cells.">Nano- and microscale holes modulate cell-substrate adhesion, cytoskeletal organization, and -beta1 integrin localization in SV40 human corneal epithelial cells.</a> IEEE Transactions on Nanobioscience. 5 (4), 273-280 (2006).</li><li>Hamilton, D. W., Brunette, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+substratum+topography+on+osteoblast+adhesion+mediated+signal+transduction+and+phosphorylation.">The effect of substratum topography on osteoblast adhesion mediated signal transduction and phosphorylation.</a> Biomaterials. 28 (1), 1806-1819 (2007).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Dang, J. M., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+Induction+of+Aligned+Mesenchymal+Stem+Cell+Sheets+by+Culture+on+Thermally+Responsive+Electrospun+Nanofibers.">Myogenic Induction of Aligned Mesenchymal Stem Cell Sheets by Culture on Thermally Responsive Electrospun Nanofibers.</a> Advanced Materials. 19 (19), 2775-2779 (2007).</li><li>Azevedo, E. C., Nascimento, E. M., Chierice, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+and+gamma+irradiation+effects+on+surface+properties+of+polyurethane+derivate+from+castor+oil.">UV and gamma irradiation effects on surface properties of polyurethane derivate from castor oil.</a> Pol&#237;meros. 23 (3), 305-311 (2013).</li><li>Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+UV+radiation+on+the+semi-interpenetrating+polymer+networks+based+on+polyurethane+and+epoxy+maleate+of+bisphenol+A.">Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A.</a> Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169 (2), 177-185 (2005).</li><li>Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blistering+and+degradation+of+polyurethane+coatings+under+different+accelerated+weathering+tests.">Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests.</a> Polymer Degradation and Stability. 77 (1), 103-109 (2002).</li></ol>

DCH הוא CSO, מנהל, מייסד ובעל מניות בFibromEd המוצרים בע&quot;מ MB וJPI הם בעלי מניות מייסד בFibromEd מוצרים בע&quot;מ

רבים מהשיטות הנוכחיות משמשות ליצירת תאים כבדים מתאי גזע להסתמך על מטריצות מוגדרות מן החי. מצעים אלה יכולים להיות יקרים ומשתנים מאוד, המשפיעים על תפקוד תא ויציבות, המייצג חסם משמעותי ליישום. לכן, ביצענו מסך לחומרים סינטטיים התומכים בתרבות של תאים כבדים שמקורן בתאי גז?...

חומרים ביולוגיים היו בשימוש נרחב בתחזוקה וההתמיינות של תאי גזע pluripotent 1. תוך שהוא מאפשר, מצעים ביולוגיים אלה לעתים קרובות מכילים מספר עצום של מרכיבים בלתי מוגדרים. Matrigel הוא מצע נפוץ לתרבית תאי גזע ובידול. לרוע המזל, ההרכב משתנה משפיע על תפקוד תא ופנוטיפ. למרות מגוון רחב של מטריצות חלופיות, מוגדרות יותר ביולוגיות היה בשימוש 2-7, מן החי או מן מדרגיות עניים שלהם הופכת אותם למועמדים שאינם מתאימים לייצור תעשייתי. לכן זיהוי של חלופות סינתטיות, עם הרכב מוגדר וביצועים אמין, הן מטרות מרכזיות במחקר בתאי גזע. בניסיון להתגבר על המגבלות של מצעי תרבית תאים לא מוגדרים, שיתופי פעולה בין תחומיים בין הכימיה והביולוגיה זיהו חומרים סינטטיים עם היכולת לתמוך בפנוטיפ תא. Synthמצעי etic הם ניתנים להרחבה, חסכוניים, ויכולים להיות מיוצרים לתוך מבנים מורכבים 3D, מחקה את סביבת in vivo. בשל מאפיינים אלה מצעים סינטטיים היו בשימוש נרחב כדי לתמוך ולהוביל בידול של סוגי תאים רבים 8-10. מבחני תפוקה מתקדמים וגבוהים הקלו סינון המהיר של חומרים סינטטיים, מספריות גדולות, ונמסרו חומרים חדשים בעלי תכונות גמישות עם יישומים רחבים במחקר ופיתוח ביו 11-13. ניצול תפוקה גבוהה, טכנולוגית הקרנת מיקרו מערך פולימר, אנו במהירות זיהינו פוליאוריטן פשוט (PU134), מתאים לתחזוקה של תאים כבדים בתאי גזע אנושיים נגזרים. פולימר זה נמצא להיות עדיף על מצעים מן החי בנוגע לבידול hepatocyte ותפקוד 14-16. לאחר מכן יש לנו אופטימיזציה תהליך תנאי ציפוי, הטופוגרפיה ועיקור כדי לגשת להשפעותעל ביצועי פולימרים בייצוב תפקוד הפטוציט ותוחלת חיים. יש לכך השלכות משמעותיות בכל קשור להבנת יסודות הביולוגיה הפטוציט לדוגמנות תא מבוססת ויישומי רפואה רגנרטיבית. הטכנולוגיה שתוארה כאן מייצגת דוגמא לאופן שעל פני השטח של פולימר סינטטי יכול להיות מותאמים כדי לשמר את הפנוטיפ של תאים. אנו מאמינים כי שילוב של טכנולוגיה זו עם פרוטוקול בידול hepatocyte סרום ללא יעיל יש את הפוטנציאל לספק ייצור להרחבה של תאים כבדים לשימוש במודלים במבחנה ורפואת רגנרטיבית.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Edmun B&amp;uuml;hler</td><td>KS-15</td><td></td></tr><tr><td>Irradiator</td><td>CIS Biointernational</td><td>IBL 637&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Specialty Coating System</td><td>P-6708</td><td></td></tr><tr><td>Scanning Electron Microscope&amp;nbsp;</td><td>Philips</td><td>XL30CPSEM</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope</td><td>DimensionV Nanoscope, VEECO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p4-GLO CYP3A4</td><td>Promega</td><td>V8902</td><td></td></tr><tr><td>UV bulb</td><td>ESCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoScope analysis software</td><td>VEECO</td><td></td><td>version 1.20</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>TH45200</td><td>Use Volocity 4 Software</td></tr><tr><td>Tissue culture plates</td><td>Corning, UK&amp;nbsp;</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>glass slides</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>MIC3308</td><td></td></tr><tr><td>Diethylene glycol</td><td>Sigma&amp;ndash;Aldrich</td><td>93171</td><td></td></tr><tr><td>1,6-hexanediol</td><td>Sigma&amp;ndash;Aldrich</td><td>240117</td><td></td></tr><tr><td>Neopentyl glycol</td><td>Sigma&amp;ndash;Aldrich</td><td>408255</td><td></td></tr><tr><td>Adipic acid</td><td>Sigma&amp;ndash;Aldrich</td><td>9582</td><td></td></tr><tr><td>anhydrous &lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Dimethylformamide</td><td>Sigma&amp;ndash;Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Sigma&amp;ndash;Aldrich</td><td>676845</td><td></td></tr><tr><td>titanium (IV) butoxide&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;ndash;Aldrich</td><td>244112</td><td></td></tr><tr><td>1,4-butanediol&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;ndash;Aldrich</td><td>493732</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum oven</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4,4&amp;rsquo;-Methylenebis(phenyl isocyanate)</td><td>Sigma&amp;ndash;Aldrich</td><td>101688</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofurane</td><td>Sigma&amp;ndash;Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>Sputter coater</td><td>Bal-Tec SCD 050</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Inmunostaining&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline (-MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, -CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td>Store at room temperature</td></tr><tr><td>PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp; Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>EC607&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>&amp;nbsp; Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>CHE5010</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MOWIOL 488 DAPI</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td>Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cell culture and Functional assay&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CYP3A activity pGLO kit</td><td>Promega</td><td>V8902</td><td></td></tr><tr><td>Hepatozyme</td><td>Gibco</td><td>17705021</td><td></td></tr><tr><td>TryLE express</td><td>Life Technologies</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12604013&quot;&gt;12604013&lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

stabilizing hepatocellular phenotype using optimized synthetic surfaces

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing and maintaining primary and pluripotent stem cell derived hepatocytes. While biological matrices are useful, they permit short term culture of hepatocytes, limiting their widespread application. We have attempted to overcome the limitations using a synthetic polymer coating. Polymers represent one of the broadest classes of biomaterials and possess a wide range of mechanical, physical and chemical properties, which can be fine-tuned for purpose. Importantly, such materials can be scaled to quality assured standards and display batch-to-batch consistency. This is essential if cells are to be expanded for high through-put screening in the pharmaceutical testing industry or for cellular based therapy. Polyurethanes (PUs) are one group of materials that have shown promise in cell culture. Our recent progress in optimizing a polyurethane coated surface, for long-term culture of human hepatocytes displaying stable phenotype, is presented and discussed.

ממס פולימר משפיע על הטופוגרפיה של פני השטח מצופה פולימר פוליאוריתן 134 היה solubilized בכלורופורם, לבד או בשילוב עם טולואן או tetrahydrofuran או dichloromethane ושקופיות זכוכית ספין מצופות בניסוחים השונים. במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ומיק...

Watch this Scientific Journal Video about Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces at JoVE.com

Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces

מאמר זה יתמקד בפיתוח משטחים מצופים פולימר לטווח ארוך, תרבות היציבה של תאי גזע המופקת hepatocytes האנושי.

ייצוב Hepatocellular הפנוטיפ באמצעות משטחים סינטטיים אופטימליים

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing ...

stabilizing-hepatocellular-phenotype-using-optimized-synthetic

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.2K Views.  University of Edinburgh.  מאמר זה יתמקד בפיתוח משטחים מצופים פולימר לטווח ארוך, תרבות היציבה של תאי גזע המופקת hepatocytes האנושי. 

Video: Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

מוגדרי דור Scalable של תאי Hepatocyte דמוי מתאי גזע פלוריפוטנטיים האנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Developmental Biology

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

שימוש האדם המושרה תאים דמויי Hepatocyte נגזר תאי גזע Pluripotent לגילוי סמים

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). Current differentiation procedures generate human hepatocyte-like cells (HLCs) displaying a mixture of fetal and adult traits. To improve cell phenotype, we have fully defined our differentiation procedure and the cell niche, resulting in the generation of cell populations which display improved gene expression and&#160;function. While these studies mark progress, the ability to generate large quantities of multi well plates for screening has been limited by labour intensive procedures and batch to batch variation. To tackle this issue, we have developed a semi-automated platform to differentiate pluripotent stem cells into HLCs. Stem cell seeding and differentiation were performed using liquid handling and automatic pipetting systems in&#160;96-well plate format. Following the differentiation, cell phenotype was analyzed using automated microscopy and a multi well luminometer.

This protocol describes a semi-automated approach to produce hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells in a 96 well plate format. This process is rapid and cost-effective, allowing the production of quality assured batches of hepatocyte-like cells for basic and applied human research.

יצור אוטומטי למחצה של Hepatocyte כמו תאים מתאי גזע Pluripotent

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

סרום חינם הפקת מימדים תלת-ממדיים של האדם בתאי גזע חזקים

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Biology

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream single-cell applications is challenging. A marked accumulation of lipids within regenerating hepatocytes is observed during the first 2 days of normal liver regeneration in mice. This so-called transient regeneration-associated steatosis (TRAS) is temporary but partially overlaps the major proliferative phase. Density-gradient purification is the backbone of most existing protocols for the isolation of primary hepatocytes. As gradient purification relies on the density and size of cells, it separates non-steatotic from steatotic hepatocyte populations. Therefore, fatty hepatocytes often are lost, yielding non-representative hepatocyte fractions. 
The presented protocol describes an easy and reliable method for the in vivo isolation of regenerating hepatocytes regardless of their lipid content. Hepatocytes from male C57BL/6 mice are isolated 24-48 h after hepatectomy by a classic two-step collagenase perfusion approach. A standard peristaltic pump drives the warmed solutions via the catheterized inferior vena cava into the remnant, using a retrograde perfusion technique with outflow through the portal vein. Hepatocytes are dissociated by collagenase for their release from the Glisson's capsule. After washing and careful centrifugation, the hepatocytes can be used for any downstream analyses. In conclusion, this paper describes a straightforward and reproducible technique for the isolation of a representative population of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice. The method may also aid the study of fatty liver disease.

Lipid-laden hepatocytes are inherent to liver regeneration but are usually lost upon density-gradient centrifugation. Here, we present an optimized cell isolation protocol that retains steatotic hepatocytes, yielding representative populations of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice.

בידוד של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

Medicine

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to shortages in donor organ availability. Organ scarcity also affects the routine supply of human hepatocytes for basic research and the clinic. Therefore, the development of renewable sources of human liver progenitor cells is desirable and is the goal of this study. To be able to effectively generate and deploy human liver progenitors on a large scale, a reproducible hepatic progenitor differentiation system was developed. This protocol aids experimental reproducibility between users in a range of cell cultureware formats and permits differentiations using both, human embryonic and induced pluripotent stem cell lines. These are important advantages over current differentiation systems that will enhance the basic research and may pave the way towards clinical product development.

The goal of this article is to provide a standardized approach to induce human hepatic progenitor differentiation from pluripotent stem cells. The development of this procedure with ready-to-use media formulations offer the user a facile system to generate human liver cells for biomedical research and translation.

מפרט פרוגניטור בכבד מתאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות מערכת בידול מוגדרת

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the executor for most of the liver functions, primary hepatocytes have limited proliferating capacity. This requires the establishment of ex vivo hepatocyte expansion models for liver physiological and pathological research. Here, we isolated murine hepatocytes by two steps of collagenase perfusion and established a 3D organoid culture as the 'mini-liver' to recapitulate cell-cell interactions and physical functions. The organoids consist of heterogeneous cell populations including progenitors and mature hepatocytes. We introduce the process in detailed to isolate and culture the murine hepatocytes or fetal hepatocyte to form organoids within 2-3 weeks and show how to passage them by mechanically pipetting up and down. In addition, we will also introduce how to digest the organoids into single cells for lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering. The organoids can be used for drug screens, disease modelling, and basic liver research by modeling liver biology and pathobiology.

A long-term ex vitro 3D organoid culture system was established from mouse hepatocytes. These organoids can be passaged and genetically manipulated by lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering.

מניפולציה ממסדית וגנטית של אורגנוידים של מורין הפטוציט

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

מערכת כבד דו-ממדית + כל-אנושית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית לגילוי תרופות

An All-Human Hepatic Culture System for Drug Development Applications

Finding a long-term, human-relevant culture model for primary human hepatocytes (PHHs) for pharmacological and toxicological studies remains a challenge. Current in vitro model platforms are often inconvenient and complex, lack phenotypic stability over time, and do not support multiple PHH lots, lacking experimental reproducibility and flexibility. Here, we provide a detailed protocol for the thawing, plating, and maintenance of an all-human 2D+ hepatic system (TV2D+), which takes advantage of standard two-dimensional (2D) culture techniques and equipment while maintaining the longevity and phenotypic stability over time that typically accompany more complex three-dimensional (3D) systems. The results show attachment and percent plateability in TV2D+ as a function of PHH seeding density, as well as stable functionality for at least 2 weeks in culture. A range of PHH seeding densities are assessed to achieve a successful long-term culture. When established properly, the PHHs in TV2D+ organize into hepatocyte colonies, express a hepatic-specific marker, and maintain viability, architectural integrity, and physiologically relevant levels of albumin and urea. This unique combination of attributes makes the TV2D+ system a suitable hepatic model for a variety of pharmacological and toxicological applications.

Author Spotlight: פיתוח מודל כבד פשוט וחזק ליישומים פרמקולוגיים וטוקסיקולוגיים 

Recent technical advances enabled the scaled production of an in vitro platform for drug metabolism and toxicity applications. An all-human 2D+ hepatic system (TV2D+) provides physiologically relevant results using traditional two-dimensional culture methods. This protocol will support end-users in the setup, maintenance, and application of the system.

מערכת כל-אנושית של תרביות כבד ליישומים לפיתוח תרופות

Finding a long-term, human-relevant culture model for primary human hepatocytes (PHHs) for pharmacological and toxicological studies remains a challenge. ...