המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להציג שיטה אופטימלית לבידוד הפטוציטים בעכברים לאחר כריתת כבד חלקית ללא צורך בצנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. בדרך כלל אנו רואים אחוז גדול של הפטוציטים עמוסי שומנים במהלך התחדשות מוקדמת. אלה hepatocytes steatotic בדרך כלל לאבד עם צפיפות הדרגתית צנטריפוגה עקב צפיפות נמוכה נשמרים עם פרוטוקול זה.
כדי להכין את ציוד הזילוח, חבר צינורית IUI במד 26 לקצה היציאה של הצינור באמצעות מחבר מנעול Luer. לאחר מכן שטפו את הצינור והכניסו את קצה הכניסה של הצינור לצינור חיץ הזילוח שחומם מראש באמבט המים. הקדימו אותו עם חיץ זילוח חם במהירות משאבה של שלושה מיליליטר לדקה.
לפני שתמשיך בניתוח, ודא כי העכבר מורדם כראוי. לאחר מכן נקו את הבטן עם תמיסת קרצוף כירורגית ואתנול 70%. לאחר מכן חתכו את התפרים כדי לפתוח מחדש את חתך קו האמצע שנעשה בעבר לכריתת כבד חלקית ומשכו בעדינות את קצוות הפצע זה מזה.
אם כריתת הכבד היא מעל 24 עד 48 שעות, להסיר את התפר לחתוך את העור עם מספריים או אזמל. השתמש retractor או קליפסים פשוטים כדי לשמור על הבטן פתוחה. חלל הבטן צריך להיות חשוף ככל האפשר כדי לייעל את הגישה ואת הדמיה.
תקן תפר פוליפרופילן 5-0 לחזה. משוך אותו באופן גולגולתי וקבע אותו במצב זה. הזיזו את המעיים ימינה באמצעות צמר גפן סטרילי כדי לחשוף את וריד הפורטל ואת הווריד הנבוב.
השתמש במטלית רטובה כדי לשמור על המעיים. הניחו חפץ כבד בגובה של כשני סנטימטרים, כגון טבעת משקולת מתכתית, בסמוך לרגליו האחוריות של העכבר. לאחר מכן הניחו את הצינורית עם צינורית IUI 26 מד מחוברת על האובייקט ומקמו את המחט בזהירות על גבי הווריד הנבוב.
התאימו את אורך הצינור לפי הצורך. העבירו את תמיסת ה-collagenase לתוך צינור חיץ העיכול שחומם מראש. הכינו 10 עד 20 מיליליטר של חיץ עיכול לכל חיה.
הפעל את המשאבה לאחר התאמת מהירות המשאבה לשלושה מיליליטר לדקה. השליכו את שניים עד שלושה המיליליטרים הראשונים של חיץ הזילוח שחומם מראש ברגע שהמאגר מגיע למחט. כדי לבצע קנולציה של הווריד הנבוב הנחות, השתמש בצמר גפן סטרילי כדי למשוך בעדינות את הווריד קאווה מתחת לנקב, כך שהמתח שסופק מאפשר את החדרת הצינורית לווריד.
הכנס את צינורית 26 המד IUI בזווית רדודה לתוך הווריד הנבוב התחתון מתחת לכליה בזמן שהמאגר עובר דרך המחט. ודא ששיפוע המחט מצביע כלפי מעלה. חפש דם בתא הבזק של הצנתר כאשר המחט נכנסת לומן.
מקדמים את המחט שניים עד שלושה מילימטרים נוספים כדי לוודא שקצה הצנתר נכנס לווריד. החליקו את קטטר הפלסטיק מעל המחט ולתוך הווריד קאווה עוד חמישה מילימטרים. הסר את המחט לאט ובזהירות רבה.
לאחר שתיים עד שלוש שניות, לחפש כתמים לבנים שנוצרו בכבד או נפיחות של וריד הפורטל, אשר מציין כי חיץ זילוח זורם דרך הכבד ונכנס אונות הכבד מן הווריד המרכזי. המתן עד שווריד הפורטל יתנפח באופן נראה לעין תוך שנייה עד שתיים מהיווצרות כתמים לבנים על פני הכבד. חותכים את וריד השער עם מספריים רחוק ככל האפשר מן הילוס הכבד.
הגדל את קצב הזרימה לארבעה עד שבעה מיליליטר לדקה בהתאם למשקל החיה, גודל הכבד והיקף כריתת הכבד הראשונית. הדקו את וריד הפורטל עם פינצטה או מהדק כלי דם למשך שבע עד 10 שניות. יש לוודא שלא עובר נוזל.
בצע מהדק שני לאחר כ -30 שניות וודא כי הכבד מתנפח ונרגע. המשיכו לשטוף את החיה במשך שלוש עד ארבע דקות והתבוננו בחיץ השקוף הזורם מתוך וריד השער. הדקו את וריד הפורטל למשך שלוש עד ארבע שניות לפני שמאגר העיכול מגיע לכבד.
ודא כי הכבד מרגיע עם שחרורו של מהדק וכי נוזל זילוח נשאר צלול. ברגע שמאגר העיכול מגיע לכבד, מהדקים שוב את וריד השער. הכבד לא צריך להירגע לאחר שחרורו של הידוק הידוק.
לעכל במשך כארבע דקות בקצב זרימה של חמישה מיליליטר לדקה. ככל שהעיכול מתקדם, חפשו סימנים לכך שהכבד מתחיל להתנפח וחלקים קטנים ושקופים על פני הכבד. שימו לב שהכבד מקבל מרקם של חתיכת בד רטובה ונראה כמעט רטוב.
בדקו את העקביות על ידי נגיעה זהירה עם צמר גפן לח וסטרילי. המשך עם זילוח עד הבדל ניכר במרקם פני השטח של הכבד ניתן לראות. שימו לב שהכבד מקבל צבע בהיר מאוד ומראה מבעבע המעיד על כך שהקפסולה של הגליסון נפרדת מהפרנכימה.
עצור את העיכול ברגע שהכבד רכש תכונות אלה. הסר את המחט לפני שהאוויר נכנס לכבד. אחזו ברקמת החיבור המרכזית בין האונות באמצעות מלקחיים והרימו אותה מעט כלפי מעלה תוך שימוש בה כנקודת עיגון.
לחתוך את כל החיבורים של הכבד לאיברים אחרים ולהסיר את כיס המרה. הסר את הכבד בעדינות מחלל הבטן. היזהר מכיוון שהוא יהיה דקיק ושברירי בשלב זה.
מניחים את הכבד במאגר השימור הקר כקרח. מעבירים את הכבד לצלוחית פטרי בקוטר 10 ס"מ ומוסיפים 10 מיליליטר קר כקרח של Williams'Medium E.Tear את הקפסולה של גליסון עם פינצטה עדינה בכמה מקומות לאורך פני הכבד. אוחזים בחלק מרכזי בעזרת שני זוגות פינצטה.
משכו אותם לאט זה מזה, ואפשרו לקפסולה להיקרע מבלי לפגוע בהפטוציטים ושחררו את התאים על ידי ניעור עדין של הכמוסה. מסננים חמישה מיליליטר של עיסת כבד דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מיליליטר. שטפו את המסנן עם 10 מיליליטר של מדיום קר כקרח טרי וסננו את חמשת המיליליטרים הנותרים של עיסת העץ דרך מסננת התא.
סובבו את התמצית ב-50 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו את רוב הסופרנטנט, והותירו מיליליטר אחד להשהות מחדש את התאים על ידי ערבול עדין של הצינור. מוסיפים 40 מיליליטר של Williams'E Medium קר וחוזרים על הצעד שלוש פעמים.
המשך עם בידוד של hepatocytes כמתואר בכתב היד טקסט. לאחר 70% כריתת כבד בעכברים, התשואה הסופית של הפטוציטים הייתה בערך 10 עד 15 x 10 עד 6 עם 78% כדאיות סופית ממוצעת. בעוד לאחר 86% כריתת כבד ממושכת, תשואת הפטוציטים הייתה ארבע עד תשע x 10 עד 6 עם כדאיות ממוצעת של 65%.
לאחר כריתת כבד חלקית, הפטוציטים מראים גודל תא מוגבר בהשוואה לכבדים רגילים המתאימים לתכולת שומנים מוגברת. תכולת שומנים מוגברת נצפתה ב hepatocytes murine 24 שעות לאחר כריתת כבד חלקית, נראה כמו עלייה גרעיניות או נצפתה ישירות על ידי נוכחות של שלפוחיות שומנים בתוך hepatocytes מוגדל. תוך שימוש בשיטת טיהור שיפוע הצפיפות הקלאסית, הפטוציטים שומניים גדולים אבדו בסופרנאטנט ורק הפטוציטים רזים קטנים יותר נאספים בכדורית התא.
עם הפרוטוקול המשופר, הפטוציטים מלאי השומנים לא אבדו וכל הפטוציטים היו כדורים. ההידוק החוזר מקל על תהליך השטיפה. עם זאת, הכבד מנוקה בצורה אופטימלית מרכיבי הדם הנותרים שעלולים לעכב את אנזימי העיכול.
