The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.

1. אלקטרודה בנייה (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצור של מתאם אלקטרודה שמתאים את האלקטרודה ממשק הלוח של 1,2,25 מערכות מגבר רב ערוצים מסחריים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בצלחת פלסטיק קטנה דבוקה לבסיס מחבר 18 פין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הבסיס עם 3 קטעים קצרים של תיל מבודד ל3 זיזי הלחמה נפרדים מוברגים לצלחת הפלסטיק (איור 1 A1-A3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס חריץ לתוך צלחת הפלסטיק שבו נימי זכוכית יכולות בקלות לעבור ולהיות מוחזקות במקום על ידי בורג (איור B1 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאריך את נימי זכוכית על 5 מ&quot;מ באמצעות סיכת minutien. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את חוטי האלקטרודה מיקרו לאורך סיכת minutien ונימי הזכוכית כדי להבטיח ייצוב ותמיכה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצור חוטי מייקר רב ערוצית (שאומץ מRyuichy אוקאדה 32,33) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוחלת 3 חוטי מיקרו (חוטי נחושת פוליאוריטן מצופים, 15קוטר מיקרומטר), באופן שהם ממוקמים אחד ליד שני (איור B2 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחט הלחמת 12 V להפיץ שכבה דקה של שעוות שיניים התכה נמוכה (C ° 50) באופן חלקי לאורך החוטים כדי להדביקם (קצה האלקטרודה) (איור 1 B3). השאר כמה סנטימטרים unglued (סוף אלקטרודה) כסעיף זה ישמש מאוחר יותר לחבר את חוטי מיקרו עם מתאם האלקטרודה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את כבל מיקרו הרב ערוצים למתאם אלקטרודה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את נימי זכוכית מהמחזיק ולצרף אותו עם סיכת minutien לקצה האלקטרודה. להביא אותו לעמדה מקבילה למייקרו אלקטרודה (B3 Figure1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדביקים את הקצה האלקטרודה לפין minutien באמצעות שעוות שיניים התכה נמוכה ולחתוך את האלקטרודה מיקרו בקצה, בולט 2-3 סנטימטר מפיני minutien ובסוף האלקטרודה (חיצים קטנים איור B3 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Slip sl הנימיםightly בחזרה לתוך מתאם האלקטרודה. השתמש בבורג כדי לתקן את זה (איור B4 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלחם את הקצוות החופשיים של שלושה חוטים לזיזי הלחמה באמצעות אקדח הלחמה עם טמפרטורה של כ 360 ° C כדי להבטיח היתוך של הבידוד (איור B4 1). לאחר הלחמה, להבטיח כי יש קשר נאות חשמלי (~ 300 kOhm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר אחד של אלקטרודות (אב) לאלקטרודה ממשק הלוח של headstage ולתקן את האלקטרודה האחר רב ערוצים (עבדים) במתאם נפרד. חבר את הערוצים של העבד להאלקטרודה השנייה (איור 1 C1). בנוסף, לרתך את ההתייחסות, כמו גם אלקטרודות שרירים לבסיס האלקטרודה השנייה (איור 1 C2). </li></ol></li></ol> 2. Bee הכנה (איור 2) בניסויים שתוארו אלה, דבורת הדבש (Apis mellifera), אשר הוא בעלי חיים חסרי חוליותולכן אינו דורש אישורים אתיים ספציפיים לשימוש, הוא בשימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס מלקטי מזון דבורת דבש (mellifera א) בכניסה הכוורת בבוקר, כפי שמוצג על ידי אחרים 34,35. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל הדבורים על קרח כתוש עד חוסר תנועה (5-10 דקות) ולתקן אחד בבעל פרספקס סטנדרטי או צינור מתכת בצורה שהראש חשוף (איור 2). לצמצום תנועות הראש להשתמש בשעוות שיניים התכה נמוכה (~ 50 מעלות צלזיוס) ולתקן את הראש בזהירות לבעל סביב הבסיס של העיניים מורכבות והצוואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשעוות התכה נמוכה לקבע scapi של האנטנות על הקפסולה הראש (איור 2 ב &#39;) בלי לגעת שבוטון. השוטון של האנטנה צריך להיות הצביע קדימה. ודא שהדבורה יכולה להזיז חוטם שלה באופן חופשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את ראש הקפסולה כדי להבטיח נוף וגישה לחלק העליון של הראש באין מפריע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את הדבורים בתמיסת סוכרוז 30% עד saturatiעל מנת להבטיח הרטבה מספקת של רקמת המוח ויכולת קיום טוב של בעל החיים (איור 2 C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתכים זהירים אנכי לאורך הגבולות של העיניים מורכבות ואופקיים מעל בסיסי מחושים כמו גם מתחת לocelli ולהסיר את החתיכה הרופפת של ציפורן (איור 2 ד &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר בזהירות בצד בלוטות hypopharyngeal ולהסיר את קנה הנשימה כדי להבטיח נוף וגישה למוח לפני אלקטרודה הכנסה (2E דמויות, 2F) ברורים. </li></ol> 3. אלקטרודה קלטי במקרה הדוגמא באיור 2, אלקטרודה אחת ממוקמת מכוון l-ALT, והשני מכוון על M-ALT 2. באמצעות ציוני דרך מסוימות, אזורי יעד אחרים אפשריים, כמו גם, לדוגמא אזורי הפלט אל על וMB 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את האלקטרודות באמצעות micromanipulators באזור של עניין ( <strong&gt; איור 2G ו 3 א). כדי למקד את המקום מ &#39;-ALT האלקטרודה בין AL ומדיאלית מהאונה האנכית של מגה בייט. ודא להיות מעל נקודת PNS ALT mediolateral הסתעפות אתר ההכנסה. בולט אלקטרודה למוח עם עומק של כ -180 (2E איור) מיקרומטר. למקום הקלטת l-ALT PN האלקטרודה מתחת protocerebrum לרוחב (LH) באמצע קו דמיוני בין הצד לרוחב של אונה אנכית ואמצע AL. הכנס את האלקטרודה עם עומק של כ -300 מיקרומטר (איור 2E) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את ההתייחסות (חוט כסף, על 25 מיקרומטר קוטר) לעין המורכבת ipsilateral דרך חתך קטן בציפורן. הכנס חוט כסף נוסף לאזור הקרנת שרירים מתחת לocelli לרוחב. הערה: אם יש צורך בהתנהגות של דבורי הלמידה יכולה להיות במעקב עם דיוק גבוה זמני על ידי הקלטת השרירים M17, שהוא מעורב in תגובת הארכה חוטם (PER) של הדבורה 36 כפי שמתוארת ב25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעגן באופן יציב אלקטרודות בתוך המוח ואת הקפסולה הראש, מכסה את החלל כולו מעל המוח עם שני סיליקון הרכיב (איור 2H), אשר ימנע את המוח מהתייבשות. הערה: ההקלטות יכולות להימשך שעות עד ימים, והוא יכול למשל להיות מוקלטים הדבורים במהלך הליך קלאסי אוויר (איור 2H) או מגורה עם פנל גדול של ריחות שונים. </li></ol> 4. רכישת נתונים ועיבוד מקדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת רכישה ראויה שעונה על הדרישות הבאות: קצב דגימה של kHz דקות 25; אנלוגי 1,25 או בידול צלב 2 דיגיטלי בין ערוצי האלקטרודה; להקה לעבור סינון מ300 הרץ עד 8,000 Hz לחלץ אירועי ספייק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת ספייק מיון זמינה כדי לחלץ את פעילות יחידה אחת, למשל templאכל טכניקות התאמה כפי שנכלל בתוכנת Spike2 (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח נוסף להשתמש בבולים של יחידות חילוץ בזמן כדי לחשב יחידה אחת בממוצע תגובות ריח (איור 4) או לחשב וקטורי אוכלוסייה לקרן רכיב ניתוח (PCA) (איור 5) באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי. כדי לנתח יחידה אחת וחביון תגובת אוכלוסייה נוסף אנא להשוות פרסומים אחרונים 1,2,25. </li></ol> 5. ויזואליזציה של עמדת אלקטרודה יחסית (איור 4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את הטיפים אלקטרודות לתוך תמיסה של 5% או Alexa hydrazide 568 או 5% Alexa hydrazide 488 אשר מומסים ב0.5 כלוריד פתרון M אשלגן לפני ניסויי ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האלקטרודות וסיליקון הכיסוי בקפידה לאחר הניסויים, יש לשטוף את המוח עם פתרון Ringer הדבורה, להסיר את הבלוטות ואת קנה הנשימה ולהכניס גבישים זעירים של tetramethylrhodamin dextran או להכניס פתרון 5% פתר ב1.0 אצטט M אשלגן לתוך AL לתייג alts anterogradely. בצע את השלבים הבאים בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לצבע שיש לנקוט ומועבר על ידי נוירונים ההקרנה לאורך שטחי אקסון (30-45 דקות) (איור 4 א), לפני שטיפת המוח עם פתרון Ringer דבורים שלוש פעמים לעוד דקות 30-45. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל הדבורה על קרח עד חוסר תנועה ולהסיר בזהירות את המוח מכמוסת הראש. לקבע את המוח על ידי שטיפתו בתמיסת 0.1 M PBS המכיל פורמלין 4% ולשמור אותו לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחכות שעה לפחות 12 לפני שטיפת המוח פי שניים ב0.1 M PBS (10 דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המוח 3x עבור 20 דקות ב0.2% טריטון X-100 מדוללים ב0.1 M PBS לפני התייבשותו בסדרת אלכוהול עולה (30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 3x 100% אתנול, 20 דקות כל שלב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ המוח מיובש בMethylsalicylate בשקופית מיקרוסקופ ויםeal אותו עם כיסוי שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ לייזר confocal סריקה ולסרוק את המוח, כמו חלקים אופטיים כל מיקרומטר 2-5 באמצעות תרכובת הרמונית מטרת התכנית Apochromat (10X טבילה 0.4 NA). להלהיב את הרקמות באמצעות אורך גל 568 ננומטר לdextran tetramethylrhodamin ואורך גל של 488 ננומטר לתפקיד האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את המבנים המוכתמים המוח ונתיבי האלקטרודה מערימות התמונה ב-3D ​​עם תוכנת שחזור (למשל. עמירה או פיג&#39;י) (איור 4). </li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מאמר זה מדגים את הייצור ושימוש בחוט אלקטרודות מיקרו רב ערוצים מותאמים אישית שתוכננה. אלקטרודות שתוארו מתאימות להקלטה שניהם יחידה אחת ופעילות אוכלוסייה אשר היא שימושי במיוחד עבור מדידות חביון ומאפייני תגובה זמניות אחרים של נוירונים שונים וneuropils שונה בתוך דגימה אחת (לפרטים ראו 1,2,25). בנוסף יש לנו לראות כיצד ליישם באופן קבוע את האלקטרודות חוט מיקרו כדי לאפשר הקלטות יציבים לטווח ארוך במתנהגים דבורי דבש להימשך שעות עד ימים. הקלטות רבת יחידה תאית הפכו לכלי נוח כדי להשיג רזולוציה גבוהה זמנית בשילוב עם מידע מרחבי. במקרה שלנו, אלה הם שני קטעים מקבילים עצביים 2 או שתיים neuropils שונה 1. ניתן להקליט נוירונים מרובים ונותחו ברמת תא העצב הבודד במקביל וברזולוציה גבוהה זמנית. שיא Multi-יחידהings יושמו לראשונה ביונקי 38 ומאוחר יותר גם בחרקים 39-41. התקדמות משמעותית הושגה עם הפיתוח והשיפור של טכניקות הקלטת רב ערוצית תאיים 42,43. זה, למשל, כולל את הפיתוח של אלקטרודות חדשות 44 או אלגוריתמי מיון וקיבוץ באשכול של ספייק רומן 45. שיטות כלליות של טכניקות הקלטה רבת יחידה תאית מתוארות היטב 46-48. אלקטרודות העצמית שנבנה שמוצגים בסרטון הזה בנוסף ניתן להתאים על ידי הוספה יותר microwires לאלקטרודה או יכולים להיות מעוות חוטי מיקרו כדי לזכות במרחקים קבועים למדידה בין הטיפים. שני ההליכים היו, עם זאת, להביא לירידה בגמישות והגדלת עובי של האלקטרודה. בהשוואה לבדיקות סיליקון המשמשות בדרך כלל להקלטות תאי בחרקים הרבה יותר גדולים כמו עש נץ, ארבה והמקק 40,49 - </sup&gt; 51 חוט אלקטרודות מיקרו תיארה הם קטנים יותר, גמישות ויכולה להתמודד בקלות עם תנועות מוח פוטנציאליות, ולכן ניתן להשתמש בו באופן מהימן בחרקים חברתיים קטנים כמו דבורים ונמלים המציגים רפרטואר התנהגותי רחב הרבה יותר. רוב בדיקות סיליקון שוק חד כמו מבני חיתוך האקסונים ורקמה עצבית לאורך ערוץ הכנסתם, ואילו חוטי מיקרו תיארו הם עגולים, גמישים וקטנים יותר ולכן הם פחות מזיקים לרקמה הסובבת וזה יתרון ברור אם המטרה היא ללמוד עוד פלסטיות טווח בבעלי חיים בשלמותה ומתנהגים. יתרון נוסף של אלקטרודות חוט מיקרו הוא הייצור שלהם בעלות הנמוכה והטיפול קל. במקום לנקות בדיקה סיליקון יקרה בזהירות את חוטי האלקטרודה הם טריים חתוכים לקראת כניסה המוח, ולכן בעיות חוסר הגודש. כמו כן ניתן להשתמש באלקטרודה חוט מיקרו יותר מפעם אחת באותו ההכנה הוכנסה גם בneuropiles שונה 1 oשטחי r 2 כפי שאנו מראים כאן. גישה זו היא חיובית במיוחד כדי לנתח ולהשוות היבטים זמניים כמו שיהוי תגובה ואינטראקציות ברמות עיבוד עצביים שונות. אנו מודעים לעובדה שאות נרשמה תאית אינה משקפת את פעילות תא בודדת כשלעצמו. זה תמיד תרכובת של פעילות מתח סביב הקצה האלקטרודה. כדי לאתר את מקור אות ההבדל של שני ערוצי חוט מייקר שכנים בתוך אלקטרודה אחת תמיד מחושב. כך המקור לאותות ספייק משמשים כדי לחלץ את פעילות יחידה אחת תמיד היה קרוב מאוד לאחד או ערוץ האלקטרודה האחר וכתוצאה מכך גל ספייק להבחין בקלות. אותות ממקום מרוחק יותר, כמו פעילות שרירים או פעילות של neuropils השכן, יגיעו שני אלקטרודות באותו הזמן מעורר צורות ואמפליטודות דומות וייפסלו על ידי הליך זה. באמצעות טכניקת התאמת תבנית של Spike2,אנחנו בטוחים מאוד כדי להשיג פעילות יחידה אחת, שזה לא אותו הדבר, אבל קרובים מאוד לפעילות תא עצב יחידה. עם זאת, סוגיית מיון ספייק יכולה להימנע על ידי שימוש בטכניקות הקלטה תאית. הקלטות תא בודדות עם שני אלקטרודות חדות או טפטפות תיקון תאפשר ידע מעמיק על מאפיינים פיסיולוגיים של נוירון בודד. עם זאת, בשל גודלו הקטן של נוירונים חרקים וneurites (לדוגמא., מיקרומטר פחות מ 1 לדבורת הדבש PNS 52) הקלטות קצר טווח הן לניהול. יתר על כן, הקלטות סלולריות התוך עשויות להיות פולשנית ועלולה לפגוע בתא שבו הוא אולי סיבה נוספת למגבלות זמן. בvivo הקלטות תאית בחרקים נדירים לשרוד שעה אחת. חלון זמן שהיה מספיק לעבודתו החלוצית של מרטין האמר 53 שנרשמו תאיים מתא עצב אחד מזוהה, תא עצב maxilar # הגחון מזווג 1 (VUMmx1). הוא יכול lדיו את פעילותה באופן ישיר למסלול הגמול. יוליאנה Mauelshagen 54 רשום intracellularly הפעילות של נוירון החיצוני מזוהה פטריות גוף, pedunculus נוירון החיצוני # 1 (PE1) בהתניה קלאסית. אותו תא העצב היה במוקד של מנזל ומנז 55 כאשר הם מצאו LTP לאחר גירוי חשמלי של תאי קניון. עם זאת, אוקאדה ועמיתי 56 יכולים להשתמש בדפוס intracellularly המאופיין היטב spiking (קוצים כפולים ומשולשים) לזיהוי PE1 במהלך הקלטות תאיים. אחרי הכל שילוב של שני השיטות, הקלטות תאיים מתא עצב מזוהה והקלטות ארוכות טווח תאיים עשויות להיות כלי רב עוצמה לחקירות עתידיות. עם זאת, באמצעות אלקטרודות חדות להקליט תאים מרובים (יחידות) בו זמנית ברמות עיבוד שונות על פני שעות רבות עד ימים כדי לנתח את מערכות היחסים שלהם זמני תגובה ו / או אפילו שינויי פלסטיק iזה כמעט בלתי אפשרי. עם ההדמיה סידן הראשונה מתקרבת ב57,58 דבורת הדבש באמצעות צבעי סידן רגיש לניתוח דפוסים מרחביים של תגובות ריח היה נגיש 59-62. עם זאת, במקרים רבים הצבעים הרגישים סידן צריכה להיות הציגו לרקמת המוח באמצעות מניפולציות פולשנית ששוב להגביל את תוחלת החיים של הדבורה ותכונות פנימיות של התאים נותחו. בעיה זו היא להתגבר באורגניזמים מודל אחרים כמו פריזבוב באמצעות חיישני סידן הציגו גנטי 63,64. עם זאת, באופן כללי, חיישני סידן עשויים להציג את מגבלות אחרות כפי שהם יכולים לשמש כמאגרי סידן שצפויה להשפיע על המאפיינים זמניים של תגובות ריח. הקלטות תאיים בו זמנית בשילוב עם הדמיה סידן או גישות חישוביות יכולות להוכיח הפתרון הזמני הנכון של תהליכי הדמיה 65,66. עם זאת, ההחלטה הזמנית של תהליך ההדמיה עצמה היא Rather מוגבל. רכישת מערכות אופטיות בדרך כלל להשתמש CCD-הדמיה עם רזולוציה זמנית של 5-20 הרץ 67, אם כי 2-Photon-Imaging יוכל לרכוש רצפים מהירים יותר 68. עם זאת, קצב דגימת הגדלת תמיד הולך יחד עם הפסד ברזולוציה מרחבית. יתר על כן צבעי סידן רגיש לשימוש בדבורת הדבש לעבור הלבנת, אשר גם מפחיתה את זמן רכישה 69. בהשוואה לטכניקות הקלטה פיסיולוגיות אחרות בחרקי אלקטרודות מיקרו החוט שלנו גמישה רב הערוצים להבטיח גישה ארוך זמן ליחידה אחת ופעילות עצבית באוכלוסייה מתנהג דבורים. הראינו כיצד להשתמש בשני אלקטרודות אלה בשלבי עיבוד שונים באותה החיה, המאפשרת הניתוח של היבטי קידוד זמניים בין אתרי הקלטה השונים. תלוי בבעית המחקר ומודל חרקים השיטה הבסיסית של בניין האלקטרודה הפגין כאן הוא להרחיב בקלותמסוגל ו / או יכול להיות מותאם. לדוגמא ניתן לשער להשתמש יותר משלושה חוטים אחד לייצר אלקטרודות רב ערוצית. בנוסף, מספר אתרי הקלטה ניתן להאריך והתבוננות היבטים זמניים של יותר משני שטחים או neuropils אינה ריאלי. התקווה שלנו היא כי שיטה זו תשמש השראה למדענים רבים ותתרום באופן חיובי להבנה של עיבוד עצבי מתוחכם במוח קטן.

דבורי דבש, כמו גם רוב חרקים אחרים להסתמך בכבדות על חוש ריח. בין השאר הם משתמשים ברמזי חוש הריח להתמצאות, הזדווגות, תקשורת עם בני מין, וחיפוש אחר מזון. מערכת חוש הריח פירט גם תורמת לרפרטואר עשיר של התנהגויות למידה הקשורות לגירויי ריח פרחוניים. ניתן ללמוד התנהגויות אלה בקלות בתנאי מעבדה מבוקרת (לסקירה ראתה 3 - 5). &quot;המוח של המיני&quot; שלהם (cp. 6) עם המספרים הקטנים יחסית של נוירונים עושה דבורת דבש אורגניזם מודל מתאים גם ללימוד קידוד חוש הריח והלמידה במהלך הניטור של פעילות עצבית. מערכת חוש הריח בחרקים, כמו גם ביונקים מציגה ארגון מקביל במידה רבה (לסקירה ראה 7,8). בדבורי דבש כ -80,000 קולט נוירונים 9 ממוקמים בsensillae לאורך האנטנות 10,11 לתרגם את גירוי הריח הסביבתי לneurאות onal. האקסונים מתאי עצב קולטני ריח מעצבבים את אונת המחושים (AL), שבה יש ארגון גלומרולרי דומה לנורת חוש הריח החוליות. AL מהווה כ 164 glomeruli מחובר אחד עם השני על ידי כ -4,000 interneurons המקומי (LN) (לסקירה ראה 12). במיוחד בדבורת הדבש זה הוכח לאחרונה כי LNs לספק קישוריות לרוחב אחידה ושאוכלוסיות שונות בעלי תכונות הרחה יסודות וconfigural קידוד 13,14. AL הוצג להיות מחולקים לאונת הגחון וחמים הגבי והוליד המדיאלי והדרכים לרוחב מחושים אונה (m-ו-L-ALT; לשעבר כינה מ-ו-L-APT להמדיאלי וprotocerebral אונת מחושים לרוחב מערכת 15-17). הנה מינוח בדרכי חדש הוצג על ידי מאמץ האחרון למינוח אחיד של מוח החרק ישמש 18. שני alts (l-ו-M-ALT) לשלב גם 410 proje uniglomerular (l-ALT) או 510 (m-ALT)נוירונים ction (PN), בהתאמה 15,16,19. לאחרונה PNS של שני קטעים הוכחו ריחות קוד ב2 מקבילים (לסקירה ראה 17,20), ושני קטעי synaptically ליצור קשרים מסועפים עם תאי קניון (KC), גוף הפטרייה (MB) נוירונים עיקריים. כל MB מכיל כ 172,000 KCS 21-23. מ&quot;ב ידועים להיות מעורב בשילוב גירוי, למידה, ויצירת זיכרון. דנדריטים axo של KCS להקים peduncle (הגזע של הפטרייה), שבו יש שני אזורי פלט עיקריים: vertica או אלפא אונה ו22,24 אופקיים או בטא אונה. הפלט של MB מתכנס רק על 400 נוירונים חיצוניים (EN) 24. ENS אחראי על עיבוד מידע הרחה בעיקר מעצבב את היבט הגחון של האונה האנכית 22. לאחרונה, זה כבר הראה כי ENS נרשם באזור זה לקודד את עמותת הפרס ריח 25. זמני כמוpects בתוך מערכת חוש הריח של חרקים, כמו גם בעלי חוליות הפכו היבט חשוב ומשמעותי כעיקרון קידוד פוטנציאל 26-29. כדי להיות מסוגל להקליט בו זמנית מספר רב של נוירונים מאתרים שונים ברזולוציה גבוהה זמנית, הקמנו טכניקות הקלטת יחידה כפולות רב באמצעות אלקטרודות תיל ערוץ מותאמות אישית רב הציגו לאזורי יעד שונים במערכת ההרחה של הדבורה. גישה זו מאפשרת לנו לנתח ולהשוות בין עיבוד זמני במערכת ההרחה דבורת הדבש ברמה של תאי עצב ואוכלוסיות של תאי עצב או בין מסלולי הרחה מקבילים, המסלול הכפול ההרחה 2 או בין neuropils שלאחר מכן שונה 1 אחד. לאחרונה עם גישה ניסויית דומה במערכת ההרחה ארבה 30 שימוש בתצורה של אלקטרודות שונה היו מסוגלים לנתח את מנגנון קידוד spatiotemporal להכרה ריח רקע בלתי משתנה ביום 31. האותנו, את ההקלטות כפולים הוקמו מאפשרות איסוף מידע מרחבי על פרופילים של פעילות עצביות בו זמנית. בהשוואה לדגימה מרחבית הרחבה יותר המתקבלת מהדמית סידן בשיטה זו מאפשרת הקלטה משתי נקודות בלבד. עם זאת, היתרון בהשוואה לשיטות הדמיה סידן הוא הדיוק הגבוה הזמני של הקלטות פוטנציאל פעולה, אשר אינו יכול להיות מסופקות על ידי או הדמיה CCD קונבנציונלית או רכישת הדמיה 2 פוטונים. אלקטרודות תאי שתוארו כאן באופן קבוע מושתלות וקבוע ביחס למוח וכמוסת ראש הימנעות נדידת האלקטרודה. זהו יתרון ברור בהשוואה לשימוש באלקטרודות תאית חדה. יתרון נוסף בהשוואה להקלטות תאית והדמיה סידן הוא זמן תצפית עצבית המורחב החל משעות רבות עד ימים. זה תנאי חשוב לחקור וקושרת עצבית של היווצרות למידה וזיכרון. יתרונות נוספים של רבהקלטות יחידה מתוארות נוסף בסעיף הדיון. בסקירה מתודולוגית זה הליך הייצור של אלקטרודות תיל עיצוב המותאם אישית תוכלו לראות, שהותאם מ32,33 ומתאים להקלטות יחידה רבת לטווח ארוך במוח דבורת הדבש. בנוסף, דוגמא כיצד סוגים אלה של האלקטרודות מושתלים באופן קבוע בשני אתרי הקלטה שונים בתוך מערכת ההרחה דבורת הדבש כדי להקליט בו זמנית l-וה-M-ALT על פני תקופות זמן כדי לאפשר לפרוטוקולי גירוי רבים ארוכות מוצגת 2. לצורך אימות עמדות הקלטת דוגמא ופרוטוקול להדמיה מכתים והודעת הקלטה של ​​אתרי ההקלטה מסופקת.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Paraffin oil</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>76235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odors</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Methanol free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>BioChemica</td>
			<td>A1388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylsalicylate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4529.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D7162</td>
			<td>keep dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 hydrazide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10436</td>
			<td>keep dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 568 hydrazide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10437</td>
			<td>keep dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bee Ringer Solution</td>
			<td>see 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane-coated copper wire</td>
			<td>Elektrisola</td>
			<td>15&#181;m diameter &#38; P155 insulation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Wax&#160;</td>
			<td>Densply Detrey</td>
			<td>64103015S1</td>
			<td>moderate melting point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Wax</td>
			<td>Flexaponal&#160;</td>
			<td>124-202-00</td>
			<td>low-melting Wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KWIK SIl</td>
			<td>WPI</td>
			<td>03L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 Pin Socket</td>
			<td>Conrad Electronic</td>
			<td>189634-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot melting glue</td>
			<td>Conrad Electronic</td>
			<td>827673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soldering needle</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td>830283</td>
			<td>12 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering terminal lug&#160;</td>
			<td>Conrad Electronic</td>
			<td>531901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glaselectrodes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td>V2A 0.2 x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>switchable headstage</td>
			<td>Tucer Davis Technologies</td>
			<td>SH16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage connection module</td>
			<td>NPI</td>
			<td>INT-03M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier Module</td>
			<td>NPI</td>
			<td>PDA-2F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition boards</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6123, Ni-6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition Software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Lab View 8.2</td>
			<td>custom design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike-Sorting&#160;</td>
			<td>CED&#160;</td>
			<td>Spike 2 v7.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2008B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Leitz</td>
			<td></td>
			<td>manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG-wires</td>
			<td>WPI</td>
			<td>AGT05100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP2 AOBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMIRA</td>
			<td>Mercury Computer Systems&#160;</td>
			<td>2/5/2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous long-term recordings at two neuronal processing stages in behaving honeybees

בשני יונקים וחרקים מידע עצבי מעובד במרכזים במוח מסדר גבוה יותר ונמוך יותר שונים. מרכזים אלה הם מצמידים באמצעות מתכנסים וקשרים אנטומיים מסתעף כולל הזנה קדימה וחיווט משוב. יתר על כן, מידע מאותו המוצא נשלח באופן חלקי דרך שבילים מקבילים לשונה ולפעמים לאותם אזורים במוח. כדי להבין את היתרונות אבולוציוניים, כמו גם את היתרונות חישוביים של אסטרטגיות החיווט הללו ובמיוחד התלות הזמנית שלהם אחד על השני, זה הכרחי כדי לקבל גישה בו זמנית לנוירונים בודדים של שטחים או neuropiles שונים באותה ההכנה ברזולוציה גבוהה זמנית. כאן אנו להתרכז בדבורי דבש על ידי הוכחת גישה לטווח ארוך תאית ייחודית להקליט פעילות יחידה רבת בשתי neuropiles הבא 1, באונה המחושים (AL), השלב הראשון חוש הריח העיבוד וגוף הפטרייה (MB), invo מרכז אינטגרציה מסדר גבוה יותרlved בלמידה וביצירת זיכרון, או שני קטעים עצביים במקביל 2 חיבור AL עם מגה בייט. האחרון נבחר כדוגמה ויהיה מתואר במלואו. בסרטון התמיכה בבנייה וההחדרה קבועה של אלקטרודות חוט רבת ערוצים גמישים באו לידי ביטוי. הגברה ההפרש Pairwise של ערוצי אלקטרודה חוט מיקרו באופן דרסטי מפחיתה את הרעש ומוודאת כי המקור של האות קשור קשר הדוק למצב של הקצה האלקטרודה. הגמישות מכאנית של אלקטרודות החוט משמשים מאפשרת הקלטות ארוכות טווח פולשנית יציבה לאורך שעות רבות עד ימים, וזה יתרון ברור בהשוואה לטכניקות הקלטה קונבנציונליות נוספות ותאיות בגוף חי.

&quot;הפרוטוקול הנוכחי מאפשר הקלטות בו זמנית בשני שלבי עיבוד שונים בתוך דבורים בודדים ובנוסף מאפשר לבחון את המנגנון בסיסי של למידה וזיכרון באמצעות דוגמא., PER האוויר בתוך דבורי דבש מאופקים&quot;. זהו תנאי הכרחי לניתוח היבטים זמניים של עיבוד עצבי. השיטה היא להתאמה בקלות לגישות מדעיות שונות לפענח את הרשת העצבית של מערכת חוש הריח של הדבורה. לדוגמא שיטה זו משמשת (i) כדי לנתח עיבוד זמני של PNS בתוך מסלול ההרחה הכפול של דבורת הדבש, l-ו-M-ALT PNS (איור 5). באיור 5A דוגמא אחת PN l-ALT נרשם בו זמנית עם PN של m-ALT ניתן כעשר ממוצע משפט וממחישה את כוחם התגובה והשהיה בגין חמישה ריכוזי ריח שונים כמו עלילת חום בקודי צבע. בממוצע של שבעה דבורים עם 11 l-ו13 mALT PNS (5B דמויות, 5C) ממחיש כי גם כוח התגובה, כמו גם ההשהיה התגובה, במידה מסוימת, משקף את ריכוז odorant. כך PNS בדוגמא זו להגדיל את כוח התגובה שלהם בזמן עם ריכוז odorant הגדלת חביון התגובה שלהם ירד (5B דמויות, 5C). תוצאה זו היא מוגבלת למדי ותקפה רק לodorant ניתח, אבל הוא עדיין עולה בקנה אחד עם מודלים חישוביים האחרונים של 37 AL. אם קידוד ריכוז הריח בAL של הדבורה בבסיס חישובים לא ליניארי או בבסיס מאפייני קידוד אחרים עדיין צריך להיות מנותחים בעתיד. יתר על כן השיטה יכולה לשמש (ii) כדי להשוות היבטים זמניים בפעילות האוכלוסייה בשני שלבים שלאחר מכן עיבוד, AL-וMB-הפלט (איור 6). ניתוח עיקרי רכיב (PCA) ממחיש כי חישוב ריח הוא ממושך ולשרוד את מצגת הריח כולו ברמת PN ואילו בENזה רק הריח לסירוגין סט היו מיוצג בפעילות האוכלוסייה (איור 6). וכך אוכלוסיית EN הגיעה הפעילות המקסימלי שלהם כבר בנקודת זמן שבו פעילות PN עדיין מתפתחת (סרט cp. 1). <img alt="איור 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig1highres.jpg" width="400" /> .. איור 1 ייצור אלקטרודות מיקרו חוט שלושת ערוצי A1) הסיומות של שלושה חוטים מולחמות לפיני IC בפוזיציות 11, 13 ו16 A2) ארבעה זיזי הלחמה דפוקים על צלחת בסיס פלסטיק פרספקס.; סיכת minutien מוכנסת לתוך הקצה של נימי זכוכית אשר מחוברת אז לצלחת הפלסטיק. A3) צלחת הפלסטיק מודבקת על גבי פיני IC ואת הקצה החופשי של כל חוט הוא מולחם לאחד מההלחמה העליונה זיזים. &lt;strong&gt; B1) כדי לצייד את בעל אלקטרודה עם חוטי נחושת הדקים, הנימים יש לקחת החוצה. B2 פעם נוסף) הבסיס של קרס ואז קבועים במנהג עשה יישור מכשיר. שלושה חוטי מייקר נחושת מיושרים לאורך החריץ וקבוע עם דבק בכל קצה B3) חוטי המייקר המקבילים מודבקים יחד עם שעוות שיניים והנימים היא להחזיר במקום (חיצים ארוכים).; אז חוטי מיקרו דבוקים מצורפים לנימים בשעוות שיניים וקצותיו מנותקים (חיצים קצרים). B4) שלושה הקצוות החופשיים של חוטי הנחושת מולחמים לשלושה זיזי ההלחמה העליונים ובכך להביא אותם למגע חשמלי עם ניתן לחבר שתי אלקטרודות פיני IC. C1) התאספו באופן מלא לכל אחד אחר לשימוש עם headstage אחת. C2) לצורך כך את הסיכות של אלקטרודה אחת (משמאל, עבדים) מחוברות באמצעות חוטים מבודדים לאלקטרודה אחרת (מימין, תורןER), אשר מחובר לבמה את הראש; האלקטרודה headstage מחוברת יכולה גם לאסוף קלט משריר (M17) ואלקטרודה השוואתית (נ&quot;צ). <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. הכנה והחדרת אלקטרודה קבועה למוח הדבורה.) דבורה מוכנסת לתוך בעל פרספקס לאחר קיבוע על קרח. אנטנות עם השוטון (פלורידה) וScapus (SC) מצוינים. ב &#39;) את הראש ואנטנות קבועות באמצעות שעוות שיניים. C) הקפסולה הראש מגולחת והדבורים מוזנים במי סוכר. ד&#39;) את הראש הקפסולה נפתחה. E) לאחר הסרת בלוטות וקנה נשימה מהחלק העליון של המוח, יכולים בקלות להיות מכובדת neuropiles שונה וציוני הדרך העיקרית. המסלולים של alts מסומנים יחד עםסימן שבו האלקטרודות מוכנסות. (MB: גוף פטריות, אל על: אונת מחושים, OL: אונה אופטית, α: אונת אלפא או באונה אנכית, ALT: מערכת אונת מחושים, E1: צד החדרת אלקטרודה להקלטות מ-ALT, E2: צד החדרת אלקטרודה לl-ALT הקלטות). F) הפניה (REF) ואלקטרודות שריר (M17) מוכנסות לתוך הקפסולה הראש דרך חורים קטנים בציפורן או עין המורכבת. G) אלקטרודות החוט מוכנסות לתוך המוח באתרים המתאימים. H) לאחר תיקון אלקטרודות במקום באמצעות שני סיליקון רכיב, הדבורה עדיין מראה PER ויכולה להיות מותנית (למשל., שימוש במי סוכר). <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" width="500" /> הקלטת איור 3. תאי בשני שטחים עצביים והפקה אחת יחידה (מיון ספייק). </strאונג&gt;) ציור סכמטי של הגדרת הניסוי. הדבורה היא מקובעת בבעל פרספקס. גירוי ריח מסופק באמצעות שפופרת זכוכית. שני אנקס אלקטרודה מקליט ממוח הדבורה החשוף. ב &#39;) הקלטות בו זמנית מl-ו-M-ALT PNS (ירוק ועקבות סגולות) מראה תגובות מעוררות בשני קטעים לגירוי 500 ריח אלפיות של דבש בפתרון מים בריכוז של 1:100 ב33 ° C. כל שורה זממה מייצגת את הערוצים מובחנים כתווית בצבעים מזיזי הלחמת אלקטרודה בבר א:. 50 μV ג) לאחר הליכי מיון ספייק פוטנציאל פעולה בודד מסודרים וקודי צבע. היסטוגרמה מרווח כיסוי של היחידות ממוינות ממחיש את ההפרדה של צורות הגל. ד) ספייק מציינת את איכות הפרדת היחידות ממוינות כהוכחה למיון ספייק הולם. שים לב שאין ספייק בתוך התקופה עקשן של היחידה. ה) שתי תצוגות (E1, E2) מאשכולות 3D של יחידת המיון עם ניתוח מרכיבים ראשי המציין את המרחק של היחידות ממוינות אחד לשני. עיגולים מציינים את מרחק מלנוביס פי 2.5 אשר דומה SD בחלל ומציין בידול משמעותי של האשכולות בF מרחב המרכיב העיקרי יחידות) צבע מקודד מתארות את פוטנציאל הפעולה גלוי בהגדלה של שלושה ערוצים מהקלטת מערכת אחת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. הדמיה לאחר הקלטה ו3D-שחזור של עמדת ההקלטה. א) השקפת הקרנה של Ortho-פרוסות לאורך Z-הצירים עם יישור עוצמה מקסימלית של Anteroולמלא את המשבצות מדרדר של נוירונים הקרנת uniglomerular מקרינים מAL לMB ו-LH. נותב תאיים Microruby (dextran tetramethylrhodamin) היה מוכנס לתוך AL לאחר ניסויי ההקלטה. glomeruli המוכתם בתוך תצוגת הקרנת AL מכתים הוכחה נכונה PN. ב) לפרוסות Ortho לאורך Z-הצירים עם יישור עוצמה מקסימלית מהכתמה של שתי אלקטרודות עם אלקסה hydrazide 488 מציין את מיקום האלקטרודה למ-ALT (E1, החץ ) ו-L-ALT (E2, חץ). נותב Alexa Hydrazide 488 נודד לרקמות המקיפות את האלקטרודה ומכתים את אתר החדרת אלקטרודה. שים לב, הצביעה הבולטת בAL היא artefact שטחי. C) 3D שחזורים של התאים המוכתמים היעד (PNS) ואתר הכנסת האלקטרודה מA, B (בצד ימין) יחד עם סקירה סכמטית של מערכת חוש הריח דבורת הדבש (משמאל צד) עם הציון של מסלולי l-ו-M-ALT. שים לב, רק uniglomerשטחי התואר בלבד PN מוצגים. : עצב מחושים, אל על: אונת מחושים, LH: קרן לרוחב, MB: גוף פטרייה, E1, E2: אתרי החדרה אלקטרודה, מ-ALT: מערכת אונת מחושים המדיאלי, L-ALT: מערכת אונת מחושים לרוחב, ג: הזנב, r: מקורי, מ &#39;: המדיאלי, l:. לרוחב <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig5highres.jpg" width="300" /> איור 5. דוגמא לקידוד ריכוז ריח במסלול הריח הכפול.) חלקות חום להמחיש את התגובה של l-ALT בודד (ירוקה) ו-M-ALT אחד PN (סגול) רכש בו זמנית מדבורת דבש בודדת בתגובה לodorant hexanal בהגדלת ריכוזי ריח (מ 1: 10 -6 ל1:100). כל שורה היא ממוצע של עשרה סטים משפטulation. שיעור הירי מוצג כשינוי עוצמה יחסי המהווה את קצב הירי ביחס לפעילות הספונטנית מופחת. ב &#39;) חביון תגובת אוכלוסיית 11 l-ו13 מ-ALT PNS מ7 דבורים רשמו. בכל אחד דבורת PNS משני חלקות נרשמו בו זמנית. חביון תגובת אוכלוסיית תערוכות השהיה יורדת עם הגדלת ריכוז ריח בPNS משני קטעים. תחילת תגובת ריח במחושים ב99 אלפיות שניים נרשמה באמצעות electroantennograms ונגרעה משיהוי תגובת PN. שים לב כי בריכוזים הנמוכים ביותר תגובות חלשות מדי למדידות השהיה, ולכן לא נכללו בתגובת אוכלוסייה. C) ירי שיעור מאותה PNS כמו בב &#39;עם ריכוז ריח הגדלת כוח התגובה הולך וגדל. L-ALT מציג חוזק תגובה חזק יותר. בB, ניתנים C הממוצע ו-SD. <img alt="איור 6" fo:contenרוחב t-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51750/51750fig6highres.jpg&quot; = &quot;500&quot; /&gt; איור 6. השוואת פעילות אוכלוסייה בשני שלבי עיבוד שלאחר מכן לאורך מסלול חוש הריח של דבורת הדבש. נתונים נרשמו ב20 בעלי חיים אשר היו מגורה עם 1-hexanol ו2-octanone.) כל שורה מייצגת צבע השווא מקודד קצב ירי ממוצע של היטל אחד נוירון (PN) מחושב על פני 10 חזרות ריח של 1-hexanol. מצגת ריח מתחילה בזמן 0 ונמשכה שלוש שניות. ב &#39;) מציג את אותו הדבר כמו ב) אבל לנוירונים חיצוניים גוף פטרייה (EN). המטריצה ​​שמוצגת ב) ניתן לראות כוקטור אוכלוסיית PN במהלך גירוי ריח עם 1-hexanol. חישבנו את אותו סוג של וקטור אוכלוסייה במהלך גירוי ריח עם 2-octanone והשתמשנו בשני הווקטורים בניתוח מרכיבים עיקריים (PCA) שמירה הזמני ממד. C) שלושת המרכיבים העיקריים הראשונים (PC1, 2 ו -3) היוזמם נגד אחד את השני כדי להמחיש את הפרדת הריח בפעילות הרכב PN במוצא אונת המחושים. הזמן לפני הופעת ריח מסומן בשחור. פעילות במהלך שלוש שניות של גירוי עם 1-hexanol מוצגת בכחול. הפעילות במהלך גירוי עם 2-octanol מוצגת באדום. יתר על כן, אנו מראים 1.5 שניות (הודעה) של הפעילות לאחר הריח של סט של 1-hexanol (כחול אור) ו -2 octanonen (ורוד). שים לב כי ברמת הרכב PN, שני הריחות מעוררי מסלולים שונים מאוד להתיישב ב&quot; נקודה קבועה &quot;, שמאריכה ימים אחרי כל תקופת גירוי ריח. רק אחרי הריח לקזז את המסלולים לחזור לפעילות הבסיסית ללא גירוי ריח. ד &#39;) אותו הניתוח נעשה ברמת הרכב EN המייצגת את הפעילות במוצא גוף פטרייה. בהשוואה לפעילות PN ריחות לעורר מסלול פחות מובחן. יתר על כן &quot;נקודה קבועה&quot; אינה נצפות. בתחילה המסלולים מושרה ריח Intermingle עם פעילות בסיסית למרות שהריח הוא עדיין קיים. רק הריח לקזז עורר מסלול נוסף. <a href="/files/ftp_upload/51750/Movie_R3_Brill_et_al._JoVE.avi" target="_blank">. סרט 1</a> זמן נפתר הערכה של מסלול ריח מושרה לאחר ניתוח מרכיבים ראשי של וקטור PN-אוכלוסייה (משמאל) ווקטור EN אוכלוסייה. (מימין;. Cp איור 6) החלקים העליונים כוללים שלושה מרכיבים העיקריים הראשונים (PC1, 2 ו -3) זממו אחד נגד השני. הלוחות הנמוכים להמחיש את ההערכה של PC1, 2 ו -3 לאורך זמן. גירוי ריח מסומן בפס האפור. כל הלוחות היו מסונכרנים. שים לב שפעילות אוכלוסיית EN מתחילה מעט לפני פעילות אוכלוסיית PN, תופעה אשר נראתה כי contraintuitive אבל יכולה להיות מוסברת על ידי הקישוריות ומאפיינים של השכבות מעורבות, אשר דנו קודם לכן 1.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees at JoVE.com

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

הקלטות ארוכות טווח תאיים בו זמנית משני neuropiles המוח שונה או שני קטעים אנטומיים שונים הוקמו בדבורי דבש. הקלטות אלה מאפשרות החקירה של היבטים זמניים של עיבוד עצבי על פני אזורים שונים במוח בנוירון הבודד, כמו גם ברמת ההרכב בבעלי חיים מתנהגים.

הקלטות ארוכות טווח בו זמנית בשני שלבים עצביים עיבוד במתנהגים דבורי דבש

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

simultaneous-long-term-recordings-at-two-neuronal-processing-stages

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.8K Views.  University of Würzburg.  הקלטות ארוכות טווח תאיים בו זמנית משני neuropiles המוח שונה או שני קטעים אנטומיים שונים הוקמו בדבורי דבש. הקלטות אלה מאפשרות החקירה של היבטים זמניים של עיבוד עצבי על פני אזורים שונים במוח בנוירון הבודד, כמו גם ברמת ההרכב בבעלי חיים מתנהגים. 

Video: Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

ניתוח אוטומטי של מורפולוגיה Sholl העצבית סרוקים בקני מידה מרובים

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-אלקטרודה מערך הקלטות של מפולות העצבית תרבויות Organotypic

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב<em&gt; ג elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

הליך השתלת מערכים מאורגנים של Microwires להקלטות יחידה אחת בAwake, מתנהגת בעלי חיים

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic Entrainment התנודות תטא בהיפוקמפוס ב מתנהג עכברים

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

הקונפליקט חושי לטווח ארוך באופן חופשי להתנהג עכברים

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

הערכה של האינדוקציה לטווח ארוך של דיכאון פרוסות למבוגרים בלבד

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...